Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

МикроРНК легких профилирования через эстральный цикл в подвергшихся воздействию озона мышей

5.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58664

⸱

7 января 2019 г.

 , 
1Pulmonary, Immunology and Physiology Laboratory, Department of Pediatrics, Pennsylvania State University College of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Pennsylvania State University College of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы описываем метод, чтобы оценить выражение легких адаптивной, прогнозируются регулировать воспалительные гены с помощью мыши воздействию озона или отфильтрованным воздухом на разных стадиях эстрального цикла.

Аннотация

МикроРНК (miRNA) профилирование стал интерес для исследователей, работающих в различных областях исследований в биологии и медицины. Текущие исследования показывают, многообещающего будущего использования адаптивной диагностики и ухода за легочных заболеваний. Здесь мы определить протокол для Мирна, профилирование для измерения относительного изобилия группы интерферирующим предсказал регулировать воспалительные гены в легочной ткани от модели мыши воспаление озона индуцированной дыхательных путей. Потому что было показано, что циркулирующие уровни полового гормона может повлиять на регулирование легких врожденного иммунитета у самок, этот метод предназначен для описания воспалительных Мирна, профилирование протокол в самок мышей, принимая во внимание эстральный цикл стадии каждого животного во время воздействия озона. Мы также рассмотреть применимые биоинформатики подходы к Мирна обнаружения и целевых методов идентификации с помощью Лимма, R/Bioconductor программного обеспечения, и программное обеспечение функционального анализа для понимания биологических контекст и пути, связанные с Дифференциальный Мирна выражение.

Введение

микроРНК (интерферирующим) являются короткие (19-25 нуклеотидов), естественным, некодирующих молекул РНК. Последовательности адаптивной эволюционных сохранение видов, предлагая важность интерферирующим в регулировании физиологические функции1. микроРНК выражение профилирование было доказано быть полезны для выявления адаптивной, которые имеют важное значение в регуляции различных процессов, в том числе иммунного ответа, дифференцировки клеток, процессов развития и апоптоз2. Совсем недавно адаптивной были признаны за их потенциального использования в терапии и диагностики заболеваний. Для исследователей, изучение механизмов регуляции генов измерения Мирна выражение может просветить модели уровне систем регулирования процессов, особенно когда Мирна информации объединяется с мРНК профилирования и другие геном масштаба данных3. С другой стороны адаптивной также было показано, быть более стабильным, чем mRNAs в широкий спектр типов образцов и также поддаются измерению с большей чувствительностью, чем белки4. Это привело к большой интерес в развитии интерферирующим качестве биомаркеров для различных молекулярных диагностических приложений, включая легочных заболеваний.

В легких адаптивной играют важную роль в процессах развития и поддержания гомеостаза. Кроме того их аномальные выражения был связан с развития и прогрессирования различных легочных заболеваний5. Воспалительные легочных заболеваний, вызванных загрязнением воздуха продемонстрировала большую серьезность и бедных прогнозом у самок, указав, что гормоны и эстральный цикл может регулировать легких врожденный иммунитет и Мирна выражение в ответ на экологические проблемы 6. в настоящем Протоколе, мы используем воздействия озона, который является одним из основных компонентов загрязнения воздуха, чтобы побудить форму воспаления легких в самок мышей, что происходит в отсутствие адаптивного иммунитета. С помощью озона, мы вызывая развитие сократимость hyperresponsiveness, который связан с повреждения эпителиальных клеток дыхательных путей и увеличение числа нейтрофилов и воспалительных медиаторов в проксимальном airways7. В настоящее время есть не хорошо описанные протоколы охарактеризовать и проанализировать интерферирующим эстрального цикла в подвергшихся воздействию озона мышей.

Ниже мы опишем простой метод для определения этапов эстрального цикла и Мирна выражение в легочной ткани самок мышей, воздействию озона. Мы также рассмотреть эффективные биоинформатики подходы к обнаружения и целевой идентификации Мирна, с акцентом на вычислительной биологии. Мы анализируем microarray данные с помощью Лимма, R/Bioconductor программное обеспечение, которое обеспечивает интегрированное решение для анализа данных из выражения гена эксперименты8. Анализ ПЦР массива данных от Лимма имеет преимущество с точки зрения власти над t теста на основе процедур при использовании небольшое количество массивов/образцы для сравнения выражений. Чтобы понять биологические контексте Мирна выражение результатов, затем мы использовали программное обеспечение функционального анализа. Для того чтобы понять механизмы, регулирующие transcriptional изменений и прогнозирования вероятных результатов, программное обеспечение сочетает в себе Мирна выражения наборов данных и знаний из литературы9. Это преимущество по сравнению с программным обеспечением, просто искать статистических обогащения в перекрывающимися наборами адаптивной.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из университета штата Пенсильвания.

1. Оценка стадии эстрального цикла

  1. Должным образом сдерживать C57BL/6 мышь (8-9 недель) с помощью Одноручные мыши сдержанность метод, описанный в Махгольца et al.10женщин.
  2. Заполните стерильных пластиковых дозаторов с 10 мкл ультра-чистой воды.
  3. Кончик пластиковая Пипетка ввести во влагалище.
  4. Аккуратно промойте жидкости 4 – 5 раз собирать образца.
  5. Место окончательный флеш, содержащие вагинальной жидкости на стеклянное скольжение.
  6. Наблюдать за безупречный вагинальный скрытой под микроскопом света с целью 20 x.
    Примечание: Животных, которые не показывают регулярные циклы pseudopregnancy или другими причинами, должны быть исключены из эксперимента. Рекомендуется для выполнения ежедневных влагалищные выделения по крайней мере три последовательных цикла для подтверждения цикличность.

2. воздействие озона

  1. Место максимум 4 мышей в двух контейнерах 1,2 Л стекло проволоки сетки крышками, и вода ad libitum.
  2. Положите один стеклянный контейнер в камере озона и другой в зале экспозиции отфильтрованного воздуха.
  3. Отрегулируйте концентрации озона в 2 ppm и мониторинга уровней озона регулярно.
    Примечание: Озон аппарат обеспечивает регулируемый воздушный поток (> 30 воздуха изменения/ч) с управлением температурой (25 ° C) и относительной влажности (50%). Система генерирует озона, Озонатор электрического разряда, который отслеживается и контролируется анализатор ультрафиолетового озона и регуляторами массового расхода, как описано выше11.
  4. После 3 h воздействия озона/фильтрации воздуха удалите стеклотары. Возвращение животных в клетке с постельным бельем, продовольствия и воды ad libitum.

3. легких Коллекция

  1. 4 ч после воздействия, анестезировать животных с внутрибрюшинного введения кетамин/Ксилазина коктейль (90 мг/кг кетамин, Ксилазина 10 мг/кг).
    Примечание: Для подтверждения надлежащего уровня анестезии, Проверьте мышь для педали рефлекс (фирмы мыс пинча) и при необходимости измените анестетиков.
  2. Смочите кожу мыши с 70% этиловом спирте.
  3. Сделайте надрез срединной 2 см, используя операционной ножницы и хирургические пинцеты подвергать верхней полой вены.
  4. Пожертвовать мышей, перерезка верхней полой вены и аорты. При необходимости вставьте иглой 21 G датчика в верхней полой вены выше почечных вен для сбора крови до обескровливания. Кроме того Соберите кровь через прокол сердца после стандартных протоколов.
  5. Используйте хирургические ножницы разрезали брюшной полости и удаление кожи/верхних мышц, движется вверх к ребер.
  6. Используйте хирургические ножницы для прокола диафрагмы.
    Примечание: Легкие рухнет от диафрагмы.
  7. Отрежьте грудную клетку, с помощью хирургического ножниц выставить сердца и легких.
  8. С помощью щипцов, взять 1,5 мл бесплатно РНКазы пробки microcentrifuge и погрузите его в жидком азоте заполнить трубу.
    Примечание: Использовать защитные перчатки и очки для обработки жидкого азота.
  9. Удаление легких, поместить их в свободных РНКазы microcentrifuge 1,5 мл труб заполненных жидким азотом для оснастки замораживание ткани и подождите несколько секунд, пока жидкость не испарится.
  10. Закройте крышку трубки и хранить ткани-80 ° c до использования.

4. РНК подготовка

  1. Распылить всю легких с использованием нержавеющей стали ткань мельница.
    Примечание: Мельница ткани необходимо размещать в жидком азоте до использования. Очистите мельница после каждого использования РНКазы раствором.
  2. Разделение вдувания легких и место в две пробирки 1,5 мл (половина легкого каждый).
  3. Добавьте 500 мкл Гуанидиновые тиоцианат за образец трубки и перемешать.  Однородный каждого образца с помощью 18 G, 21 G и 23 G иглы, соответственно.
    Примечание: Образцы могут быть шипами 5.6 x 108 копий небольшой РНК Спайк в управления (от разных видов) прежде чем приступить к добыче.
  4. Добавьте 500 мкл этанола для каждого образца и вихрь для 15 s.
  5. Нагрузки в смесь в спин столбца в коллекции трубки и центрифуги на 12000 x g за 1 мин отбросить потока через.
  6. Для DNase я лечение (в колонка);
    1. Добавьте 400 мкл буфера мытья РНК и центрифуги на 12000 x g за 1 мин.
    2. В пробирку, RNase бесплатно, добавить 5 мкл DNase I и 75 мкл 1 x ДНК пищеварение буфера и перемешать. Добавьте смесь непосредственно к матрице столбца.
    3. Инкубации при комнатной температуре в течение 15 мин.
  7. 400 мкл РНК программ решения для столбца и центрифуги на 12000 x g за 1 мин отклонения потока через и повторите этот шаг.
  8. 700 мкл буфера мытья РНК в столбце и центрифуги на 12000 x g за 1 мин отбросить потока через.
  9. Центрифуга на 12000 x g за 2 мин удалить оставшиеся буфера. Перенести столбец в трубу, RNase бесплатно.
  10. Для элюировать РНК, мкл 35 DNase/РНКазы свободной воды непосредственно в столбец матрицы и центрифуги на 12000 x g для 1,5 мин.
  11. Измерение общей концентрации РНК (260 Нм) и чистоты, используя спектрофотометр. Следуйте инструкциям для выполнения количественного определения РНК в 1,5 мкл пример аликвота. Пустой документ с DNase/РНКазы свободной воды, используемой для элюции.
    Примечание: Как «чистый» 260/280 отношение ~2.0 является общепринятым для РНК. Типичные концентрации РНК обычно колеблется между 750 и 2500 нг/мкл.
  12. Хранить при температуре-80 ° C.

5. Мирна профилирования

  1. Ретро-транскрибировать малых РНК, использования 200 ng всего РНК.
    1. Подготовьте смесь реверс транскрипция реакции на льду (общий объем в реакции составляет 20 мкл). Для каждой реакции мкл 4 5 x буфер, 2 мкл 10 x, которые смешивать нуклеотидов, 2 мкл обратной транскриптазы и 2 мкл РНКазы свободной воды. Смешайте все компоненты и Алиготе в 600 мкл РНКазы Бесплатные пластиковые трубы (10 мкл смесь реакции).
      Примечание: Реверс транскрипция мастер смесь содержит все компоненты, необходимые для синтеза cDNA перв стренги за исключением шаблона РНК.
      Примечание: Рассчитайте объем избыточного (10%), при подготовке основной микс.
    2. Добавьте шаблон РНК (200 ng в 10 мкл) к каждой пробке, содержащий Мастер микс обратной транскрипции. Mix, центрифуги для 15 s на 1000 x gи хранить их на льду до размещения в Термоциклер или сухой блок.
    3. Инкубируйте 60 мин при 37 ° C.
    4. Инкубируйте 5 мин при 95 ° C и место трубы на льду.
    5. Разбавьте cDNA, добавив 200 мкл РНКазы свободной воды для каждой реакции 20 мкл обратной транскрипции.
  2. Выполните с помощью мыши воспалительной реакции и аутоиммунные заболевания Мирна ПЦР массив ПЦР в реальном времени.
    1. Подготовка смесь реакции (общий объем 1100 мкл): для каждой реакции, добавить 550 мкл 2 x PCR мастер смеси, 110 мкл 10 x смесь универсальная грунтовка, 340 мкл РНКазы свободной воды и 340 мкл шаблон cDNA (разбавленным реакции от шага 5.1.5).
    2. Добавьте 10 мкл реакция смеси в каждой скважине поджатые Мирна ПЦР-массива с помощью многоканальных дозаторов.
    3. Уплотнение Мирна ПЦР массив пластины с оптическим самоклеющаяся пленка.
    4. Центрифуга пластину за 1 мин на 1000 x g при комнатной температуре для удаления пузырьков.
    5. Программа реального времени велосипедист, ПЦР первоначальной активации шаг 15 мин при температуре 95 ° C, 3-шаг Велоспорт содержащие денатурации 15 s на 94 ° C, отжиг для 30 сек при 55 ° C и расширения для 30 s при 70 ° C для 40 циклов номер.
      Примечание: Следуйте производителя Велоспорт условия инструкции для настройки в реальном времени циклователь. Выполните шаг кривой диссоциации, встроенные в программное обеспечение реального времени cycler.
    6. Выполните анализ данных.

6. анализ данных

  1. Извлечь значения Ct из программного обеспечения PCR реального времени для каждого образца в программное обеспечение для анализа.
    Примечание: КТ значение 34 рассматривается как отсечки. Если образцы содержат Спайк в управления (например, чел мир-39), нормализовать значения Ct в копилку в элементе управления для каждого образца. Пороговые значения может потребоваться вручную установить. Базовые значения устанавливаются автоматически.
  2. Нормализовать Ct значения в среднем Ct шести Мирна хозяйствования управления: SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A, RNU6-2, используя следующее уравнение:
    ΔCt = (Ct_Target − Ct_housekeeping)
  3. Для свертки изменить вычисления, рассчитать значения ΔΔCt с помощью определенного образца как элемент управления, используя относительное выражение уравнения12:
    Мирна относительное выражение:
    2-∆∆КТ, где - ∆∆Ct =-[∆Ct тест - ∆Ct управления]
    Примечание: Изменение раз 200 считается отсечки.
  4. Экспорт раз изменить значения выражений для выполнения статистического анализа на R с помощью пакета Лимма в Bioconductor8.
  5. Исправление для нескольких сравнений с использованием метода Benjamini-Хёхберг13.
    Примечание:  Копия скрипта R доступна на: http://psilveyra.github.io/silveyralab/. Наборы данных и проанализированы данные также доступны в Омнибус выражения гена под номером GSE111667, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE111667.

7. анализ данных: Функциональный анализ программного обеспечения

  1. Организовать набор данных. Включать интерферирующим с их соответствующих выражений журнала коэффициенты и p значения. Таблица 1 см для форматирования конкретного набора данных.
  2. Программное обеспечение открытого функционального анализа (версия 01-10).
  3. Загрузить набор данных, используя следующий формат: формат файла: «Гибкий формат», содержит заголовок столбца: «Да», выберите тип идентификатора: «miRBase (зрелые)», массив платформа, используемая для экспериментов: выбрать массив платформы.
    Примечание: Принято, являются файлы форматов .txt (табуляцией текстовые файлы), .xls (файлы excel) и .diff (файлы cuffdiff).
  4. Выберите «Выводить наблюдения» и проверьте правильность маркировки экспериментальной группы.
  5. Перейти к «Набора данных резюме» пересмотреть общее количество сопоставленных и несопоставленные адаптивной.
  6. Нажмите на кнопку «Новый» в верхней левой части программы. Выберите «Новый фильтр микроРНК целевой» и загрузить набор микроРНК.
    1. Задание источника: TarBase, изобретательность экспертов выводы, miRecords.
    2. Установите доверие: экспериментально наблюдаемого или высокой (предсказал).
    3. Выберите «Добавить столбцы» включают в себя различные биологической информации о цели таких видов, заболеваний, тканей, пути и многое другое.
    4. Чтобы сосредоточиться на цели, которые изменили выражение в эксперименте, выберите «Добавить / заменить мРНК набор данных». Используйте «Выражение спаривания», чтобы найти микроРНК с уровнями одинаковые или разные выражения.
      Примечание: Анализ фильтра будет предоставлять микроРНК имена и символы, мРНК-мишеней, источник, который описывает отношения целевой и уровень достоверности прогнозируемого отношений (рис. 2).
  7. Нажмите кнопку «Добавить в мой путь» для отправки фильтрованных данных путь холст и изучить более биологического отношения.
  8. Используйте конструктор путь для создания публикации качество модели микроРНК эффектов.
  9. Альтернативный вариант заключается в создании основной анализ.
    1. Основной тип анализа выберите «Анализ выражения».
    2. Для тип измерения выберите «Expr соотношение журнала».
    3. Реферат анализ фильтра: рассмотреть только молекулы или отношения где: (видов = мыши) и (доверия = экспериментально наблюдаемого) и (источники данных = «Изобретательность экспертов выводы», «Изобретательности ExpertAssist выводы», «miRecords», «TarBase», или» TargetScan человека»).
    4. Выберите частоту среза p-значение = 0,05.
    5. Запустите анализ.
      Примечание: Доклад будет включать в себя: канонические пути, вверх по течению регуляторы анализ, заболеваний и функций, регулятор эффекты, сетей, молекулы и многое другое.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Различных типов клеток в мазках используются для идентификации этапа эстрального цикла мыши (рис. 1). Они идентифицируются по морфологии клеток. Во время proestrus клетки являются почти исключительно кластеры-округлой формы, сформирован ядерных эпителиальных клеток (рис. 1A). Когда указатель мыши находится на стадии эструса, клетки являются ороговевшем Плоскоклеточный эпителиальных клеток, присутствующих в плотно упакованных клас...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

МикроРНК профилирование является выгодным техника для диагностики заболеваний и механистические исследований. В этой рукописи мы определили протокол для оценки выражения интерферирующим прогнозам регулировать воспалительные гены в легких самок мышей, воздействию озона в различных эстрального цикла этапов. Методы определения эстральный цикл, например метод визуального обнаружения, были описаны16. Однако эти полагаться на одноразовые измерений и поэтому являются ненадежными. Чтобы точно определить в...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они имеют не конкурирующие интересы.

Благодарности

Это исследование было поддержано грантов из низ K01HL133520 (PS) и K12HD055882 (PS). Авторы благодарят д-р Джоанна Floros за помощь с озоном воздействия экспериментов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
C57BL/6J мышиЛаборатория Джексона0006648 недель
Ультрачистая водаThermo Fisher Scientific10813012
Стерильная пластиковая пипеткаFisher Scientific13-711-25Емкость: 1,7 мл
Матовый микроскоп СлайдыThermo Fisher Scientific2951TS
Световоймикроскоп МирMW3-H510x и 20x объективный
Кетатезия-Кетамин HCl Инъекция USP HenrySchein Animal Health5585390 мг/кг. Контролируемый препарат.
Стерильный раствор ксилазинаLloyd Laboratories139-23610 мг/кг. Контролируемый препарат.
ЭтанолFisher ScientificBP2818100Разбавьте до 70% этанол водой.
Игла 21 G калибраBD Biosciences305165
ШприцFisher Scientific3296541 мл
Операционные ножницыWorld Precision Instruments501221, 50461314 см, Острый/Тупой, Изогнутый и 9 см, Прямой, Тонкий Пинцет с острым концом
Набор для пинцетаWorld Precision Instruments504616
Spectrum  Измельчители тканей BessmanFisher Scientific08-418-1Емкость: от 10 до 50 мг
микрофужейных пробирок без РНКазыThermo Fisher ScientificAM124001,5 мл
ТРИзолаРеагент Thermo Fisher Scientific15596026
Direct-zol РНК MiniPrep PlusZymo ResearchR2071
NanoDropThermo Fisher ScientificND-ONE-W
Набор для miScript II RTQiagen218161
мыши: Воспалительная реакция и Аутоиммунные микроРНК ПЦР МатрицаQiagenMIMM-105Z
Тонкостенные, без ДНКазы, без РНКазы ПЦР-пробиркиThermo Fisher ScientificAM12225на 20 мкм; L реакции
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in ControlQiagen219610
Microsoft ExcelMicrosoft Corporationhttps://office.microsoft.com/excel/
Ingenuity Pathway AnalysisQiagenhttps://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/
R SoftwareThe R Foundationhttps://www.r-project.org/
Термоамплификатор или блок охлаждения/нагреваОбщая лаборатория Поставщик
микроцентрифугОбщая лаборатория Поставщик
ПЦР в реальном времени Поставщик общейлаборатории Многоканальный
дозаторОбщая лаборатория Поставщик
РНК Буфер для промывки РНКZymo ResearchR1003-3-4848 мл Буфер
расщепления ДНКZymo ResearchE1010-1-44 мл
Буфер для предварительной промывки РНКZymo ResearchR1020-2-2525 мл
Анализатор ультрафиолетового озонаTeledyne APIModel T400http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400
Контроллеры массового расходаSierra Instruments IncFlobox 951/954http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html
для

Ссылки

  1. Rebane, A., Akdis, C. A. MicroRNAs: Essential players in the regulation of inflammation. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (1), 15-26 (2013).
  2. Cannell, I. G., Kong, Y. W., Bushell, M. How do microRNAs regulate gene expression? Biochemical Society Transactions. 36 (Pt 6), 1224-1231 (2008).
  3. Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nature Reviews Genetics. 13 (5), 358-369 (2012).
  4. Mi, S., Zhang, J., Zhang, W., Huang, R. S. Circulating microRNAs as biomarkers for inflammatory diseases. Microrna. 2 (1), 63-71 (2013).
  5. Sessa, R., Hata, A. Role of microRNAs in lung development and pulmonary diseases. Pulmonary Circulation. 3 (2), 315-328 (2013).
  6. Fuentes, N., Roy, A., Mishra, V., Cabello, N., Silveyra, P. Sex-specific microRNA expression networks in an acute mouse model of ozone-induced lung inflammation. Biology of Sex Differences. 9 (1), 18(2018).
  7. Aris, R. M., et al. Ozone-induced airway inflammation in human subjects as determined by airway lavage and biopsy. American Review of Respiratory Disease. 148 (5), 1363-1372 (1993).
  8. Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43 (7), e47(2015).
  9. Krämer, A., Green, J., Pollard, J., Tugendreich, S. Causal analysis approaches in Ingenuity Pathway Analysis. Bioinformatics. 30 (4), 523-530 (2014).
  10. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
  11. Umstead, T. M., Phelps, D. S., Wang, G., Floros, J., Tarkington, B. K. In vitro exposure of proteins to ozone. Toxicology Mechanisms and Methods. 12 (1), 1-16 (2002).
  12. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  13. Phipson, B., Lee, S., Majewski, I. J., Alexander, W. S., Smyth, G. K. Robust hyperparameter estimation protects against hypervariable genes and improves power to detect differential expression. Annals of Applied Statistics. 10 (2), 946-963 (2016).
  14. Smyth, G. K., et al. Linear Models for Microarray and RNA-Seq Data User's Guide. Bioconductor. , (2002).
  15. Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).
  16. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. Public Library of Science ONE. 7 (4), e35538(2012).
  17. Alves, M. G., et al. Comparison of RNA Extraction Methods for Molecular Analysis of Oral Cytology. Acta Stomatologica Croatica. 50 (2), 108-115 (2016).
  18. Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. Biotechniques. 22 (3), 478-481 (1997).
  19. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
  20. Walker, S. E., Lorsch, J. RNA purification- precipitation methods. Methods in Enzymology. 530, 337-343 (2013).
  21. Git, A., et al. Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression. RNA. 16 (5), 991-1006 (2010).
  22. Smyth, G. K. Limma: linear models for microarray data. Bioinformatics and Computational Biology Solutions Using R and Bioconductor. , 397-420 (2005).
  23. Griffiths-Jones, S. miRBase: the microRNA sequence database. Methods Mol Biol. 342, 129-138 (2006).
  24. Sethupathy, P., Corda, B., Hatzigeorgiou, A. TarBase: A comprehensive database of experimentally supported animal microRNA targets. RNA. 12 (2), 192-197 (2006).
  25. Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. eLife. 4, e05005(2015).
  26. Xiao, F., Zuo, Z., Cai, G., Kang, S., Gao, X., Li, T. miRecords: an integrated resource for microRNA-target interactions. Nucleic Acids Res. 37, D105-D110 (2009).
  27. Mullany, L. E., Wolff, R. K., Slattery, M. L. Effectiveness and Usability of Bioinformatics Tools to Analyze Pathways Associated with miRNA Expression. Cancer Informatics. 14, 121-130 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Воздействие озономлегочная тканьэкстракция РНКобратная транскрипцияПЦР-массиванализ Limmaфункциональный анализцитология влагалища
МикроРНК легких профилирования через эстральный цикл в подвергшихся воздействию озона мышей
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.