Методическая статья

Оценка взаимодействия между дополнением белка C1q и гиалуроновой кислоты в содействии клеточной адгезии

DOI:

10.3791/58688

⸱

15 июня 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Life Sciences, University of Trieste, 2Institute for Maternal and Child Health, IRCCS (Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico) Burlo Garofolo, 3Department of Medical, Surgical and Health Science, University of Trieste

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Дополнительным компонентом C1q является провоспалительная молекула, высоко выраженная в микроокружении тканей, которая может взаимодействовать с внеклеточной матрицей. Здесь мы описываем метод, чтобы проверить, как C1q связаны с гиалуроновой кислотой влияет на сливки клеток.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все чаще становится очевидным, что микроокружение опухоли играет активную роль в росте неоплазии и метастазах. Через различные пути, опухолевые клетки могут эффективно набирать стромальные, иммунные и эндотелиальные клетки путем выделения стимулирующих факторов, хемокины и цитокины. В свою очередь, эти клетки могут изменять сигнальные свойства микросреды, высвобождая стимулирующие рост сигналы, метаболиты и внеклеточные матричные компоненты для поддержания высокой пролиферации и метастатического свойства. В этом контексте мы определяем, что компонент C1q, высоко выраженный локально рядом злокачественных опухолей человека, при взаимодействии с внеклеточной матричной гиалуроновой кислотой, сильно влияет на поведение первичных клеток, изолированных от опухоли человека Образцов. Здесь мы описываем метод проверки того, как C1q, связанный с гиалуроновой кислотой (HA), воздействует на сливные клетки опухоли, лежащие в основе того факта, что биологические свойства ключевых компонентов внеклеточной матрицы (в данном случае HA) могут быть сформированы биоактивными сигналами к опухоли Прогрессии.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микросреда опухоли (TME) влияет на развитие рака и прогрессирование, поскольку она может обеспечить вседозволенную нишу для выживания клеток, роста и вторжения. Выявление новых ключевых игроков в ТМЕ может быть полезным для открытия новых молекулярных инструментов для целевой терапии. TME включает в себя сложную и динамичную сеть незлокачественных клеток, таких как эндотелиальные клетки, фибробласты и клетки иммунной системы, встроенные в окружающие внеклеточные матеновые компоненты (ECM), включая коллагены, ламинины, фибронектины, протеогликанов и гиалуронов. Как опухолевые, так и неопухолевые клетки синтезируют и выделяют компоненты ECM вместе с цитокинами, хемокинами, факторами роста и воспалительными и матричными ремоделирования ферментов, которые в целом изменяют физические, химические и сигнальные свойства TME. Среди этих компонентов, гиалуроновая кислота (HA) возникла оказывать решающую роль в биологии опухоли. Несмотря на свой простой химический состав, HA, вместе с его HA-связывающих молекул (гиаладеринов), может модулировать ангиогенез, иммунная система отзывчивость и ECM ремоделирования в размере и концентрации зависимым образом1.

Система дополнения (С) также является частью местной ТМЭ, которой в последнее время уделяется все большее внимание. Система C включает в себя набор растворимых и мембранных белков, участвующих в первой линии защиты от не-самоклеток, нежелательных элементов хозяина и патогенных микроорганизмов. Функционально, C связывает двух-эффектор оружия врожденных и адаптивных систем для содействия либо прямого убийства клеток или монтажа воспалительных ответ2. C активация может подавить рост опухоли, путем уничтожения раковых клеток или ингибирования их роста, но становится все более очевидным, что он может обладать опухолевых поощрения деятельности путем поддержания хронического воспаления, способствуя созданию иммуносупрессивной среде, вызывая ангиогенез, и активации рака связанных сигнальных путей3. В этом контексте, C1q, первая молекула распознавания классического пути системы C появился для оказания важных функций в микросреде опухоли независимо от активации C4. C1q было показано, что выражается локально целый ряд человеческих злокачественных опухолей, где он может способствовать раковой клетки адгезии, миграции и распространения в дополнение к ангиогенеза и метастазов5. Интересно, что C1q взаимодействует с основным компонентом ECM, таким как HA.

Мы разработали метод изолировать первичные раковые клетки от опухолевой массы. Кроме того, мы создали матрицу, которая может стимулировать микроокружение опухоли, в частности взаимодействие между C1q и высокомолекулярной гиалуроновой кислотой. C1q связаны с HA удалось вызвать сливку опухолевых клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Образцы тканей у пациентов были собраны после информированного согласия после утверждения этических соображений Институциональным советом Университетской больницы Триеста, Италия.

1. Изоляция опухолевых клеток и культура (День 1)

  1. Изолировать клетки мезотелиомы человека из твердых образцов MPM. Мелко фарш ткани с резаком для получения фрагментов около 2-3 мм2 в размере и инкубировать в 5 мл раствора пищеварения состоит из Хэнкса сбалансированного сольного раствора (HBSS) дополнены 0,5 мм Ca2"Mg2 "0,5% трипсин и 50 мкг/мл DNase I, на ночь при 4 градусах По Цельсию.
  2. Изоляция опухолевых клеток и культура (День 2)
    1. После ночной инкубации поместите переваренные ткани на 30 мин в инкубатор 37 градусов с нежной тряской.
    2. Замените раствор пищеварения при центрифугации (250 х г) 3 мг/мл коллагеназа типа 1 растворяется в 5 мл среднего 199 с HBSS и далее инкубировать в течение 30 мин при 37 градусах Цельсия с нежной тряской.
    3. Блокируйте ферментативную реакцию, добавляя 10% теплоинактивированной сыворотки крупного рогатого скота (FBS). Resuspend клетки очень тщательно с 5 мл пипетка, чтобы убедиться, что большинство клеток высвобождаются из ткани. Затем процедите суспензию клетки через фильтр пор ы 100 мкм.
    4. Семя клетки в 12,5 см2 колбы и культуры их на 37 градусов по Цельсию с человеческими эндотелиальных клеток сыворотки свободной среде (HESF), с 10% FBS и дополнены EGF (10 нг /мл), основные FGF (20 нг /мл), и 1% пенициллин-стрептомицин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Заменить на свежий средний каждые 2-3 дня.

2. HA покрытие (День 1)

  1. Приостановить высокий молекулярный вес HA (1,5 kDa) в двойной дистиллированной воды при концентрации 1 мг/мл6.
  2. Разбавить раствор запаса HA до 50 мкг/мл в карбонатном/бикарбонатном буфере (0,1 М, рН 9,6) с нежным пайпетированием.
  3. Пальто 96-хорошо пластины с 100 л разбавленного HA бульона раствора на ночь на 4 градуса по Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гиалуроновая кислота была добрым подарком от профессора Ивана Донати, кафедры наук о жизни, Университет Триеста7.

3. Покрытие C1q (День 2)

  1. После ночной инкубации, вакуум аспирации обработанных скважин и мыть 96-ну пластины с 100 зл.
  2. Разрешить C1q (25 мкг/мл или различных концентраций для экспериментов по дозам) или BSA (в качестве отрицательного контроля) привязать к пластиковой обездвиженной HA путем инкубации этих белков в концентрации 25 мкг/мл в 100 мл dPBS 0,5% BSA и 0,7 мМ Ca2"Mg2" . Затем инкубировать на ночь при 4 градусах Цельсия.
  3. Вакуумные аспирированные скважины и мыть 96-ну пластины с 100 Л /хорошо dPBS.

4. Маркировка клеток с FAST DiI

  1. Resuspend 1 х 105 опухолевых клеток в 500 Л dPBS, содержащий 10 мкг/мл флуоресцентного красителя FAST DiI. Инкубировать в течение 15 мин при 37 градусах По Цельсию в инкубаторе 5% v/v CO2 для маркировки, смешивая вручную после 5 мин интервалов.
    1. Чтобы удалить избыток FAST DiI, добавьте 10 мл dPBS, пипетки мягко вверх и вниз, и центрифуга на 250 х г в течение 7 мин. Открепите клеточные гранулы в 1 мл человеческой эндотелиальной сыворотки свободной среде, содержащей 0,1% BSA (HESF 0,1% BSA).

5. Клеточная приливка на матрицах HA/C1q (День 1)

  1. Вакуумные аспирированные скважины, покрытые различными матрицами (колодцы были покрыты шагом 3.2).
  2. Распределите 100 qL маркированной клеточной суспензии на покрытые колодцы и инкубировать пластину в течение 35 мин при 37 градусах Цельсия в 5% v/v CO2 инкубаторе.
  3. Удалите неприсоединения клеток, успонившись супернатант. Вымойте один раз с dPBS, содержащим 0,5% BSA, 0,7 мМ Ca2 "и 0,7 мм Мг2 "
  4. Lyse адепта клеток, добавив 200 л / хорошо 10 мм Tris-HCl, рН 7,4 й 0,1% V/ V SDS и сразу же читать 96-ну с флуоресценции читателя (544 нм, выброс 590 нм) с помощью кривой калибровки, порожденных через лисис все большего числа маркировки Клетки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HA является отрицательно заряженных высокомолекулярно-вес полисахарида, который состоит из повторяющихся (No 1-4)-D-глюкуроновая кислота-(З,1-3)-N-ацетил-D-глюкозамин дисахарида единиц (Рисунок 1B)7. Было проверено возникновение связывания HA на 96-аплской пластине, а также эффективность ее иммобилизации с использованием биотинилатированных HA (био-HA). Различные концентрации Био-ХА, варьируясь от 10 мкг/мл до 1 мг/мл, были повторно пр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем простой метод для исследования того, как компонент дополнения C1q, взаимодействующий с гиалуроновой кислотой, способен модулировать поведение первичных клеток, изолированных от тканей опухоли человека. Оба HA и C1q обильно присутствуют в микросреде ткани как в физиологических, так и в патологических условиях, участвуя в нескольких клеточных биологических процессах. Например, C1q было показано, что присутствует в микросреде плаценты, где он выступает за экстравиллу с трофобластом вторжения материнской decidua...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Ивана Донати за предоставление HA, Леонардо Амадио, Габриэлла Зито (Департамент гинекологии IRCCS "Burlo Garofolo", Trieste, Италия) и Андреа Романо (Оперативное клиническое отделение анатомии и патологической гистологии, Больница Каттинара, Триест, Италия ) для сбора образцов тканей. Мы благодарим также Николо Морозини за помощь в подготовке видео и Алекс Коппола, голос. Эта работа была поддержана грантами от Института охраны здоровья матери и ребенка, IRCCS "Burlo Garofolo", Trieste, Италия (RC20/16) и Fondazione Cassa di Risparmio Trieste к R.Bulla.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
100&тонкие; &микро; m поровый фильтрBD Falcon352360
Раствор амфотерицина B (фунгизозон)Sigma-Aldrich 1397-89-3
основы FGFИммунологические наукиGRF-15595
Хлорид кальцияSigma-Aldrich C-4901
Коллагеназа типа IWorthington Biochemical Corporation, DBAMX1D12644
D-глюкозаSigma-Aldrich 50-99-7
ДНКаза И Roche10 104 159 001
EDTASigma-Aldrich 60-00-4
EGFImmunological SciencesGRF-10544
FAST DiIМолекулярные зонды, Invitrogen, Thermo Fisher ScientificD7756
Фетальная бычья сывороткаGibco,  Thermo Fisher Scientific10270-106
ФибронектинRoche11051407001
колба для клеточных культурCorning430639Стерильный, вентилируемый
раствор гентамицинаSigma-Aldrich G1397-10ML
Хэнк s Сбалансированный солевой раствор (HBBS) Сигма-Олдрич H6648Дополнен ЭДТА, глюкозой, пенициллин-стрептамицином, гентамицином и фунгизоном
Высокомолекулярная гиалуроновая кислотаДобрый подарок от профессора Ивана Донати
Эндотелиальная сыворотка человека свободная среда Gibco,  Thermo Fisher Scientific11111-044с добавкой EGF (5  нг/мл), основной FGF (10&тонкие; нг/мл), и  1% пенициллин – стрептомицин (Sigma-Aldrich)
Магния хлоридCarlo Erba13446-18-9
Medium 199 с Hank' ссолью Sigma-Aldrich M7653
Пенициллин-стрептомицинСигма-Олдрич P0781
Покадровая микроскопия Nikon Система визуализации BioStation IM-Q
Titertek Multiskan ELISA ReaderFlow Labs
TrypsinSigma-Aldrich Т4674

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zamboni, F., Vieira, S., Reis, R. L., Oliveira, J. M., Collins, M. N. The potential of hyaluronic acid in immunoprotection and immunomodulation: Chemistry, processing and function. Progress in Materials Science. 97, 97-122 (2018).
  2. Lorusso, G., Ruegg, C. The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1091-1103 (2008).
  3. Ricklin, D., Hajishengallis, G., Yang, K., Lambris, J. D. Complement: a key system for immune surveillance and homeostasis. Nature Immunology. 11 (9), 785-797 (2010).
  4. Bulla, R., et al. C1q acts in the tumour microenvironment as a cancer-promoting factor independently of complement activation. Nature Communications. 7, 10346(2016).
  5. Winslow, S., Leandersson, K., Edsjo, A., Larsson, C. Prognostic stromal gene signatures in breast cancer. Breast Cancer Research. 17, 23(2015).
  6. Collins, M. N., Birkinshaw, C. Hyaluronic acid solutions: A processing method for efficient chemical modification. Journal of Applied Polymer Science. 130 (1), 145-152 (2013).
  7. Itano, N. Simple primary structure, complex turnover regulation and multiple roles of hyaluronan. Journal of Biochemistry. 144 (2), 131-137 (2008).
  8. Agostinis, C., et al. An alternative role of C1q in cell migration and tissue remodeling: contribution to trophoblast invasion and placental development. Journal of Immunology. 185 (7), 4420-4429 (2010).
  9. Agostinis, C., et al. Complement Protein C1q Binds to Hyaluronic Acid in the Malignant Pleural Mesothelioma Microenvironment and Promotes Tumor Growth. Frontiers in Immunology. 8, 1559(2017).
  10. Bossi, F., et al. C1q as a unique player in angiogenesis with therapeutic implication in wound healing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4209-4214 (2014).
  11. Hosszu, K. K., et al. Cell surface expression and function of the macromolecular c1 complex on the surface of human monocytes. Frontiers in Immunology. 3, 38(2012).
  12. Laurent, T. C., Fraser, J. R. Hyaluronan. Journal of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 6 (7), 2397-2404 (1992).
  13. Gaboriaud, C., et al. The crystal structure of the globular head of complement protein C1q provides a basis for its versatile recognition properties. Journal of Biological Chemistry. 278 (47), 46974-46982 (2003).
  14. Lam, J., Truong, N. F., Segura, T. Design of cell-matrix interactions in hyaluronic acid hydrogel scaffolds. Acta Biomaterialia. 10 (4), 1571-1580 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Extracellular MatrixTumor MicroenvironmentEnzyme Linked Immunosorbent AssayFluorescent Cell LabelingStandard Curve GenerationCoating ProcedureCell Adhesion Assay

Похожие статьи