Методическая статья

Количественное определение антител зависимых повышение Зика вируса в первичных клеток человека

8.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58691

⸱

18 января 2019 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Boston University School of Medicine, 2National Emerging Infectious Diseases Laborator, Boston University School of Medicine, 3Department of Entomology, Kansas State University

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем метод для оценки воздействия существующих иммунитет против вируса денге на Зика вирусной инфекции с помощью человеческой сыворотки, первичных клеток человека и инфекции количественной оценки количественных реального времени полимеразной цепной реакции.

Аннотация

Недавнее появление flavivirus Зика и неврологических осложнений, таких как синдром Гийена-Барре и микроцефалия новорожденных, принесла серьезные общественной безопасности. Среди факторов риска повышение антитела зависимые (ADE) представляет самую серьезную угрозу, как недавнее возрождение Зика вируса (ZIKV) является главным образом в районах, где население подвергается и находится в состоянии предварительной иммунитета в других тесно связанных flaviviruses, особенно вирус денге (DENV). Здесь мы описываем протокол для количественной оценки воздействия человеческой сыворотке антител против DENV на ZIKV инфекции в первичных клеток человека или клеточных линий.

Введение

Среди комаров-вирусных заболеваний Зика инфекции является одним из наиболее клинически важные1. Инфекции, вызванные flavivirus ZIKV, который, в большинстве случаев использует Aedes aegypti в качестве своей основной вектор1,2. Однако есть исследования, которые сообщили Aedes albopictus в качестве основного вектора в некоторых ZIKV вспышки3. Хотя инфекция протекает бессимптомно, во многих случаях, наиболее распространенными симптомами являются лихорадка, головная боль и мышечные боли2. Существует никакого лечения или вакцины для ZIKV инфекции и лечения доступны в основном благоприятной. Недавние вспышки ZIKV в Южной Америке привело к тяжелых случаев заболевания и увеличение приблизительно кратной неврологического расстройства в зародышах, названный микроцефалия2. Как Южная Америка является эндемиком несколько арбовирусов как вирус Западного Нила и DENV области, важно расследовать ли предварительного иммунитет к другим flavivirus(es) играет роль в тяжести ZIKV инфекций и болезней.

На протяжении веков вирусы развивались различные стратегии, чтобы увеличить свои шансы инфекционности для того, чтобы взять на себя принимающей ячейки машины и подавляющие противовирусное. Одним из наиболее интересных из всех является использование предварительно иммунных антител хост вирусами для повышения их репликации с явлением Аде4. ADE на всех четырех серотипы DENV был хорошо изученных и продемонстрировал увеличение вирусной титры и болезни результат5,6,7. В предыдущем исследовании в пробирке мы показали значительное повышение ZIKV репликации из-за существующих DENV иммунитета в первичной иммунные клетки человека8. Мы также продемонстрировали соответствующий метод в пробирке для количественной оценки существующих антител DENV возможность повышения ZIKV репликации в Главные ячейки.

Протокол, который мы разработали использует образцы сыворотки крови человека, которые тестируются для DENV обезвреживания в TCID-50 или assays налета сокращения нейтрализации тест (PRNT), наряду с ZIKV в биологически соответствующие клетки или клетки, полученные из тканей, которые могут заразить ZIKV.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Образцы сыворотки, используемые в данном исследовании были получены от человека участников когорте из Колумбии. Сбор проб был одобрен внутреннего обзора Совет (IRB) в Universidad de Памплона (Колумбия, Южная Америка) и Лос Potios больница8. Образцы предоставляются анонимно и следователи не имели доступа к информации о пациентах. Образцы сыворотки были проверены для DENV серотипа. Образцы были далее подтверждены для нейтрализации DENV инфекции в пробирке. Для управления были использованы образцы сыворотки от здоровых лиц (HC) из США.

Примечание: Этот протокол может использоваться для изучения Аде ZIKV репликации в любой тип клеток человека, выражая Fcγ рецепторов. Протокол состоит из трех частей (рис. 1).

1. Мобильный посева и инфекции установки

Примечание: Для этого конкретного исследования, человека первичной макрофаги или U937 миеломоноцитная клеточной линии (ATCC-CRL-1593.2) были использованы. Клетки были сохранены в RPMI среднего роста с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) при 37 ° C инкубатор с 5% двуокиси углерода (CO2). Все шаги были проведены в области биобезопасности уровня 2 кабинета по биобезопасности (BSL-2) в стерильных условиях.

  1. Семенной 3 х 104 клетки на хорошо в стерильных плоским-96-луночных днище наряду с 100 мкл среднего и поместите их в инкубатора 37 ° C с 5% CO2.
  2. После посева клетки, оттепель образцы сыворотки при комнатной температуре и сделать десятикратного серийных разведений (т.е., 1/10, 1/100, 1/1000, 1/10 000), смешивая образцов в среде, свободной от сыворотки. Аликвота разведений в стерильных 96-луночных плиту. Используйте этот вирус без сыворотки как дополнительный элемент управления.
  3. Размораживание ZIKV запас при 37 ° C в ванну воды для 1-2 мин и быстро перевести их на льду для использования в будущем.
  4. Добавьте разносторонность 0.1 эквивалентное количество инфекции (МВД) ZIKV штамма MR766 в сыворотке аликвоты.
    Примечание: Убедитесь, что коэффициент разрежения остается неизменным, и общий объем составляет ~ 200 мкл; Это достаточно для triplicates каждого курса лечения. Держите три скважины неинфицированных для использования в качестве отрицательного контроля для анализа ниже по течению.
  5. Инкубируйте разведения сыворотки вирусом добавлен в инкубаторе 37 ° C с 5% CO2 на 1 час для того чтобы позволить DENV антител к образует комплексы с Зика вирионы (для удобства, именуемый в дальнейшем «иммунные комплексы»).
  6. Аспирационная СМИ из клеток, которые были посеяны в 96-луночных пластины с плоским дном. Вымойте клетки с стерильных 1 x фосфат амортизированное saline (ПБС).
  7. Добавьте 50 мкл иммунных комплексов для каждой скважины и инкубировать их в инкубаторе 37 ° C с 5% CO2 на 2 ч.
  8. После 2 ч инкубации, аспирационная СМИ, содержащий иммунных комплексов из клеток, используя многоканальный Пипетка и вымыть клетки 2 x с ПБС полностью удалить иммунных комплексов и любой неприсоединенной вирионов.
  9. 100 мкл свежей полной СМИ, с 10% FBS каждому хорошо и инкубации клеток в инкубаторе 37 ° C с 5% CO2 в течение 48 часов.

2. РНК добыча

  1. Снять пластину 96-луночных из инкубатора и передать его на биобезопасности кабинета.
  2. Аспирационная СМИ, вымыть клетки 2 x с ПБС и приступить к добыче РНК.
    Примечание: РНК могут быть извлечены любым методом выбора (см. Таблицу материалов).
  3. 250 мкл буфера lysis клетки с 10% β-меркаптоэтанол за хорошо. Пипетка буфера вверх и вниз по крайней мере 5 x вместе с царапин кончиком пипетки для ускорения процедуры лизис клетки.
  4. Передать новые, помечены, стерильные 1.5 мл пробирок lysates клетки.
  5. Добавьте равное количество 70% этанола (250 мкл). Пипетка вверх и вниз 4 x - 5 x до тех пор, пока смесь не станет ясно.
  6. Передача смеси (~ 500 мкл) помечены столбцы на основе силики в 2 мл коллекции трубок и центрифуги на 15000 x g для 30 s. отменить через поток и сохранить столбцы в том же коллекции трубок.
  7. 700 мкл буфера мытья 1 для каждого столбца и центрифуги на 15000 x g для 30 s. отменить через поток и сохранить столбцы в том же коллекции трубок.
  8. Добавьте 500 мкл буфера 2 мыть в каждой колонке и центрифуги на 15000 x g для 30 s. удалить супернатант. Повторите этот шаг 2 x.
  9. Столбцы для новой коллекции трубы 2 мл и центрифуги на 15000 x g на 2 мин убедитесь, что столбцы на основе силики получить абсолютно сухой, и существует не этанола слева от мытья буфера 2 передачи.
  10. Сбросить 2 мл пробирок и место столбцы в новых, стерильные, помечены, 1.5 мл пробирок восстановления.
  11. Мкл подогретую (42 ° С) 30 РНКазы свободной воды в центре каждого столбца и центрифуги на 15000 x g за 1 мин.
  12. Восстановить eluted РНК и количественной оценки образцов, используя спектрофотометр на 260 Нм длины волны.
    Примечание: В идеале определить чистоту РНК, вычисляя соотношение между значения поглощения на 260 Нм и 280 Нм. Очищенный РНК 260/280 соотношение идеально между 1.8-2.0.

3. Количественная реального времени полимеразная цепная реакция

Примечание: Количественные реального времени полимеразной цепной реакции (qRT ПЦР) может осуществляться с помощью любой SYBR Зеленый микс, который обычно состоит из SYBR зеленый я покрасить, полимеразы дна Taq, deoxynucleotide трифосфаты (дНТФ) и пассивной красителя. Любые ПЦР машины способны обнаружения SYBR зеленый может использоваться для выполнения реакции и получения данных. Для этого эксперимента, Комплект ПЦР-одноэтапный была использована, которая была коктейль зеленый SYBR I, ROX краситель, Taq ДНК полимеразы, дНТФ и дополнительные смесь обратной транскриптазы (см. Таблицу материалов). Праймеры направленных против регионе конверт и используется в данном исследовании для количественного определения геномной уровней ZIKV CCGCTGCCCAACACAAG для ZIKV-qF и CCACTAACGTTCTTTTGCAGACAT для ZIKV-qR. Как элемент управления человека β-2-микроглобулина (B2M) измеряется и используется для нормализации выражение ZIKV (уборка гена). CTCCGTGGCCTTAGCTGTG для B2M-qF и TTTGGAGTACGCTGGATAGCCT для B2M-qR последовательностей праймера для количественного определения экспрессии генов B2M, используемое в настоящем исследовании. Обеспечить, чтобы положить три технических репликация для каждого образца для ZIKV и B2M генов. Настройка RT-PCR кратко описывается ниже.

  1. RT-PCR установки
    1. Использование 100 нг РНК на сэмпл.
    2. 1 мкл от 10 мкм запасов праймеров прямого и обратного определенного гена для каждой реакции.
    3. 0,25 мкл обратной транскриптазы смеси на сэмпл.
    4. Для каждой индивидуальной реакции мкл 12,5 SYBR Зеленый микс.
    5. До 25 мкл воды. Сделайте мастер смешать все вышеупомянутые реагентов, за исключением РНК, аликвота в пластину 96-луночных PCR, и добавить РНК последний.
    6. Уплотнение пластину с прозрачной липкой лентой.
    7. Центрифуга пластину на 1000 x g 1 мин смешивать реагенты.
    8. Установите пластину в машину ПЦР.
  2. RT-PCR профиль
    Примечание: Используйте профиль RT-PCR, показано в таблице 1 .
    1. Проинкубируйте образцы при 50 ° C за 10 мин для того, чтобы обеспечить синтез комплементарной ДНК — (cDNA кДНК).
    2. После синтеза cDNA активируйте полимеразы дна Taq на 95 ° C за 5 мин.
    3. Выполните 40 циклов денатурации на 95 ° C 10 s и отжига праймера и расширение при 60 ° C за 30 s.
    4. Положите шаг кривой дополнительная расплава (65° C) в конце.
  3. Анализ данных
    1. Следить за кривой расплава, щелкнув вкладку кривой расплава в программе, используемой для запуска машины ПЦР, который, в идеале, показывает один пик во всех образцах для определенного гена подтвердить наличие только одного ампликон и усиление значения более чем 1.6 Если algori THM считает 2 100% усиления значения (значение усиления варьируется в зависимости от алгоритма, используемого в машину ПЦР). Убедитесь, что для использования с шагом 0.5 ° C температуры между шаги и минимальная выдержка из 10 s в протоколе кривой расплава, для достижения оптимальных результатов.
    2. Убедившись, что есть один ампликон и хорошее усиление значения, сначала нажмите на вкладке данные количественной оценки, чтобы получить количественные цикла (Ct/Cq значение) каждого образца и экспортировать в Microsoft Excel.
    3. Используя таблицу, вычислить среднее значение каждого образца, используя значение Ct. Далее нажмите в формулах и выберите пункт среднее. Средние значения CT каждого образца (репликации) используются для дальнейшего анализа.
    4. Далее, вычислить ΔCt, используя формулу ΔCt = средняя Ct целевого гена - средний Ct гена управления (в данном случае, ΔCt = средняя Ct ZIKV гена - средний Ct B2M гена).
    5. Рассчитать ΔΔCt для нормализации данных (в данном случае, ΔΔCt = ΔCt ZIKV образцы - B2M образцов).
    6. Вычислить раз увеличение экспрессии генов, введя формулу 2^-(ΔΔCt) для каждого единого ΔΔCt нормализовать значения. Результаты увеличения раза для выполнения статистических тестов могут быть получены, как описано в предыдущих исследованиях9,10.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На рисунке 1является пошаговое схематичных иллюстрацией всех шагов для выполнения протокола Аде. Это схема показаны всю процедуру Аде ZIKV из-за существующих иммунитет к DENV. Рисунок 2 показывает как человеческой сыворотки, образцы были разделены на три различные группы: DENV инфекция подтверждена образцы называются DENV-инфицированных группы, DENV антитела подтвердил образцы называют DENV-подвергаются группы и здоровой sera физ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Перекрестной реактивности DENV антител, ведущих к Аде другие серотипы DENV препятствовало разработке эффективной вакцины против11. ZIKV принадлежит к той же семье, Флавивирусы и имеет значительную гомологию с другими flaviviruses, особенно DENV12. Основной целью нейтрализующих антител для ZIKV и DENV является белок конверт, который разделяет очень высокой структурной и четвертичные последовательности гомологии между двух вирусов13,

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего объявить.

Благодарности

Эта работа была щедро поддержали 1R21AI129881-01 (до T.M.C.), начальное финансирование от национальных возникающих инфекционных заболеваний лабораторий и школы медицины Университета Бостона.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота GEMINI100-106
iCycler BioRad785BR02188Модель. CFX96 Модуль оптики
Microfuge 18 ЦентрифугаBeckman Coulter 367160
Nanodrop-1000Термонаучный 1072
Quantifast SYBR-Одноступенчатый набор для ОТ-ПЦР Qiagen 204154Используется для набора
выделения РНК RNeasy в 1 этап Qiagen 74106Используется для выделения РНК
RPMI-medium Gibco11875093
для

Ссылки

  1. Hayes, E. B. Zika virus outside Africa. Emerging Infectious Diseases. 15, 1347-1350 (2009).
  2. Grard, G., et al. Zika virus in Gabon (Central Africa) - 2007: a new threat from Aedes albopictus. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (2), 2681(2014).
  3. Fauci, A. S., Morens, D. M. Zika Virus in the Americas--Yet Another Arbovirus Threat. New England Journal of Medicine. 374 (7), 601-604 (2016).
  4. Hawkes, R. A. Enhancement of the Infectivity of Arboviruses by Specific Antisera Produced in Domestic Fowls. Australian Journal of Experimental Biology and Medical Science. 42, 465-482 (1964).
  5. Musso, D., Gubler, D. J. Zika Virus. Clinical Microbiology Reviews. 29 (3), 487-524 (2016).
  6. Vaughn, D. W., et al. Dengue viremia titer, antibody response pattern, and virus serotype correlate with disease severity. The Journal of Infectious Diseases. 181 (1), 2-9 (2000).
  7. Khandia, R., et al. Modulation of Dengue/Zika Virus Pathogenicity by Antibody-Dependent Enhancement and Strategies to Protect Against Enhancement in Zika Virus Infection. Frontiers of Immunology. 9, 597(2018).
  8. Londono-Renteria, B., et al. A relevant in vitro human model for the study of Zika virus antibody-dependent enhancement. Journal of General Virology. 98 (7), 1702-1712 (2017).
  9. Ganger, M. T., Dietz, G. D., Ewing, S. J. A common base method for analysis of qPCR data and the application of simple blocking in qPCR experiments. BMC Bioinformatics. 18 (1), 534(2017).
  10. Renn, L. A., et al. High-throughput quantitative real-time RT-PCR assay for determining expression profiles of types I and III interferon subtypes. Journal of Visualized Experiments. (97), e52650(2015).
  11. McArthur, M. A., et al. Dengue vaccines: recent developments, ongoing challenges and current candidates. Expert Review of Vaccines. 12 (8), 933-953 (2013).
  12. Priyamvada, L., et al. Humoral cross-reactivity between Zika and dengue viruses: implications for protection and pathology. Emerging Microbes and Infections. 6 (5), 33(2017).
  13. Dai, L., et al. Molecular basis of antibody-mediated neutralization and protection against flavivirus. IUBMB Life. 68 (10), 783-791 (2016).
  14. Dai, L., et al. Structures of the Zika Virus Envelope Protein and Its Complex with a Flavivirus Broadly Protective Antibody. Cell Host & Microbe. 19 (5), 696-704 (2016).
  15. Sirohi, D., et al. The 3.8 A resolution cryo-EM structure of Zika virus. Science. 352 (6284), 467-470 (2016).
  16. George, J., et al. Prior Exposure to Zika Virus Significantly Enhances Peak Dengue-2 Viremia in Rhesus Macaques. Scientific Reports. 7 (1), 10498(2017).
  17. Morens, D. M., Halstead, S. B. Measurement of antibody-dependent infection enhancement of four dengue virus serotypes by monoclonal and polyclonal antibodies. Journal of General Virology. 71, Pt 12 2909-2914 (1990).
  18. Dejnirattisai, W., et al. Cross-reacting antibodies enhance dengue virus infection in humans. Science. 328 (5979), 745-748 (2010).
  19. Priyamvada, L., et al. Human antibody responses after dengue virus infection are highly cross-reactive to Zika virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (28), 7852-7857 (2016).
  20. Charles, A. S., Christofferson, R. C. Utility of a Dengue-Derived Monoclonal Antibody to Enhance Zika Infection In Vitro. PLoS Currents. 8, (2016).
  21. Swanstrom, J. A., et al. Dengue Virus Envelope Dimer Epitope Monoclonal Antibodies Isolated from Dengue Patients Are Protective against Zika Virus. MBio. 7 (4), (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи