Single-step очистка макромолекулярных комплексов с помощью РНК, биотин и фото горные компоновщика

Summary

РНК/белковых комплексов, очищенная с помощью Ботин стрептавидина стратегии являются этого eluted решение под денатурируя условия в форме неподобающе для дальнейшей очистки и функционального анализа. Здесь мы описываем изменения этой стратегии, которая использует фото горные компоновщика в РНК и нежный УФ элюции шаг, уступая родной и полностью функциональный РНК/белковых комплексов.

Abstract

На протяжении многих лет исключительно сильное и быстро формируется взаимодействие между биотина и стрептавидина успешно использовались для частичная очистка биологически важных РНК/белковых комплексов. Однако, эта стратегия страдает от одной основной недостаток, который ограничивает его широкого использования: биотин/стрептавидина взаимодействие может быть нарушена только при денатурации условий, которые также нарушают целостность eluted комплексов, следовательно исключающие их последующие функционального анализа и/или дальнейшей очистки другими методами. Кроме того образцы eluted часто загрязнены фон белки, связывающие nonspecifically с бисером стрептавидина, осложняет анализ комплексов очищенный Серебряный пятнать и масс-спектрометрии. Чтобы преодолеть эти ограничения, мы разработали вариант биотина/стрептавидина стратегии, в котором биотина прилагается к РНК субстрата через фото горные компоновщика и комплексы, иммобилизованных на стрептавидина бусины выборочно этого eluted решение в родной форме длинней волны УФ, оставив белки фон на бисер. Короткие РНК привязки субстратов могут быть синтезированы химически с биотина и фото горные компоновщик ковалентно прилагается к 5' концу РНК, тогда как дольше субстратов РНК могут быть предоставлены с двумя группами взаимодополняющих олигонуклеотида. Эти два варианта метода УФ элюции были протестированы для очистки U7 snRNP зависимых обработки комплексов, которые прилепится гистона пре мРНК в конце 3', и они оба оказались выгодно для других ранее развитых методов очищения. Образцы этого eluted УФ содержатся легко обнаружить количество U7 snRNP, который был свободным от крупных белковых загрязнений и подходит для прямого анализа по масс-спектрометрии и функциональных анализов. Описан метод можно легко адаптированы для очистки других комплексов связывания РНК и используется в сочетании с одно - и двуцепочечной ДНК привязки сайтов для очистки ДНК специфических белков и макромолекулярных комплексов.

Introduction

В эукариот РНК-полимераза II генерируемые мРНК прекурсоров (пре мРНК) проходят несколько событий созревания в ядре прежде чем стать полностью функциональной мРНК шаблоны для синтеза белка в цитоплазме. Одно из этих событий является 3' конца обработки. Для подавляющего большинства из пре мРНК 3' конца обработка включает расщепления в сочетании с сплайсингу. Эта реакция двухэтапный катализируемой относительно обильные комплекс состоящий из более чем 15 белки¹. В конце 3' животных зависит от репликации гистона пре мРНК обрабатываются другим механизмом, в которой ключевую роль играет U7 snRNP, низкие изобилии комплекс, состоящий из U7 мяРНК ~ 60 ну....

Protocol

1. Подготовка основания

Примечание: Короче, чем ~ 65 нуклеотидов РНК подложки может быть синтезирован химически с фото горные (pc) компоновщик (вместе именуемые как фото горные биотина или ПХД) ковалентно придает РНК 5' конца (СНГ конфигурация) и биотин (B). Субстраты РНК, содержащие значительно больше сайтов связывания должны быть созданный в пробирке , транскрипции T7 (или SP6) и впоследствии отожженная короткий дополнительный адаптер олигонуклеотида, содержащие ПХД группу на 5' конца (транс Конфигурация) (рис. 1).

1. Для привязки сайтов, состоящий из менее ~ 65 нуклеотидов, ....

Results

УФ элюции метод был протестирован с двумя химически синтезированных РНК субстратов ковалентно придает в конце 5' группу ПХД (СНГ конфигурация): pcB-SL (рис. 1) и ПХД dH3/5 м РНК (рис. 2). PcB-SL 31-нуклеотидов РНК содержит стволовые циклической структуры, следуют один мель хвост 5-нуклеотидов и ее последовательности идентичен 3' конца зрелых гистона мРНК (т.е., после расщепления гистона пре мРНК, U7 snRNP). Эта .......

Discussion

Метод, описанный здесь является простой и помимо включения фото горные компоновщика и УФ элюции шаг не отличаются от используемых методов, которые принимают преимущество чрезвычайно сильное взаимодействие между биотина и стрептавидина. УФ элюции шаг является очень эффективным, обычно выпускает более чем 75% иммобилизованных РНК и связанных белков из бисера стрептавидина, оставив высокий фон белков, которые неспецифически связывают с бисером. Устраняя этот фон, УФ элюции шаг дает удивительно чистые образцы подходит для пр.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Стрептавидин-Агароза	Sigma	S1638-5ML
Высокоинтенсивная, длинноволновая УФ-лампа	Cole-Parmer	UX-97600-00
Сменная лампа	Cole-Parmer	UX-97600-19	100 Вт ртутная лампа H44GS-100M, излучающая 366 нм УФ-свет (Sylvania)
РНК и олигонуклеотиды, содержащие биотин и фоторасщепляемый линкер в cis	Dharmacon (Лафайетт, Колорадо) или Integrated DNA Technologies, Inc. (Коралвилль, Айова)		Запросить коммерческое предложение в Dharmacon
Beckman GH 3.8 Bucket
Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase)	Promega	P1300
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase)	Promega	P1280
Pierce Silver Stain Kit	ThermoFisher Scientific	24612