Дополнительное использование микроскопических методов и флуоресценции Чтение в изучении Cryptococcus-Amoeba Взаимодействия

Summary

В этой статье подробно описывается протокол для подготовки совместной культуры криптококковых клеток и амеб, которые изучаются с использованием неподвижных флуоресцентных изображений и изображений электронного микроскопа с высоким разрешением передачи. Здесь показано, как количественные данные могут дополнять такую качественную информацию.

Abstract

Для имитации инфекции криптококка амеба, которая является естественным хищником криптококковых клеток в окружающей среде, может быть использована в качестве модели для макрофагов. Этот хищный организм, похожий на макрофаги, использует фагоцитоз, чтобы убить интернализированные клетки. С помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа, изображения, изображающие интерактивные моменты между криптококковых клеток и амебы, захвачены. Разрешение мощности электронного микроскопа также помогает выявить ультраструктурные детали криптококковых клеток, когда в ловушке внутри амебы пищи vacuole. Поскольку фагоцитоз является непрерывным процессом, количественные данные затем интегрируются в анализ, чтобы объяснить, что происходит в момент захвата изображения. Чтобы быть конкретным, относительные флуоресценции единицы считываются для того, чтобы количественно эффективность амебы в интернализации криптококковых клеток. Для этой цели, криптококковые клетки окрашены красителем, что делает их флуоресценции раз в ловушке внутри кислой среде пищи vacuole. При использовании вместе, информация, собранная с помощью таких методов может предоставить важную информацию, чтобы помочь сделать выводы о поведении и судьбе клеток, когда интернализированы амебы и, возможно, другими фагоцитическими клетками.

Introduction

Микробы развивались с течением времени, чтобы занять и процветать в различных экологических нишах, таких как открытые физические границы почвы и воды, среди других¹. В этих нишах микробы часто участвуют в прямой конкуренции за ограниченные ресурсы; важно, для питательных веществ, которые они используют для поддержки их роста или пространства, которые они должны учитывать расширение населения^2,3. В некоторых случаях, некоторые голозоики организмов, как амеба может даже предшествовать на криптококковых клеток, как способ извлечения питательных веществ из их биомассы⁴

Protocol

Cryptococcus neoformans и некоторые штаммы Acanthamoeba castellanii считаются патогенами уровня биобезопасности 2 (BSL-2); Таким образом, исследователи должны принять надлежащие меры предосторожности при работе с этими организмами. Например, лабораторный персонал должен иметь специальную подготовку и средства индивидуальной защиты (СИЗ), такие как лабораторные пальто, перчатки и защита глаз. Кабинет биологической безопасности (уровень-2) следует использовать для процедур, которые могут вызвать инфекцию^14.

1. Культивирование и стандартизация грибковых клеток (изменено из Маду и др. ^15....

Results

Микробы являются микроскопическими организмами, которые не могут быть восприняты невооруженным глазом. Однако их воздействие может привести к наблюдаемым клинически очевидным заболеваниям, таким как кожные инфекции. При изучении некоторых аспектов микробов, начиная от их морфологии, побочных продуктов и взаимодействий, будучи в состоянии обеспечить живописные и видео доказательства имеет первостепенное значение.

Сначала мы попыт.......

Discussion

В статье были успешно использованы различные методы, чтобы выявить возможный результат, который может возникнуть при взаимодействии амебы с криптококковой клетки. Кроме того, нам было интересно показать влияние 3-гидрокси жирных кислот на исход взаимодействия Cryptococcus-amoeba.

Первым используемым методом была конфокальная микроскопия, которая визуализировать неподвижные изображения. Основным недостатком этого метода здесь было то, что он только дал нам информацию, которая ограниче.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-диазабицикло-[2.2.2]-октановое число	Sigma-Aldrich	D27802-1,5-мл
пластиковая трубка	Thermo Fisher Scientific	69715-15-мл
Центрифужная пробирка		Thermo Fisher Scientific	7252018-50
мл	Thermo Fisher Scientific
1132017-8-луночный камерный предметный стек	Thermo Fisher Scientific		1109650-ацетон
	Merck
SAAR1022040LC-амеба штамма	ATCCÒ	30234TM	-
ATCC medium 712	ATCCÒ	712TM	Amoeba medium
Black 96-луночная микротитровая пластина	Thermo Fisher Scientific		152089-Centrifuge
	Hermle	-	-
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432-Конфокальный
микроскоп	Nikon	TE 2000-Эпоксидная
смола:
[1] NSA	[1] ALS[	1] R1054	-
[2] DER 736	[2] ALS[	2] R1073	-
[3] смола ERL Y221	[3] ALS[	3] R1047R	-
[4] S1 (2-диметиламиноэтанол)	[4] ALS	[4] R1067-Флуоресцеин
изотиоцианат	Sigma-Aldrich	F4274-Муравьиная
кислота	Sigma-Aldrich
489441-Fluoroskan Ascent FL	Thermo Fisher Scientific	374-91038C	Считыватель микропланшетов
Глюкоза	Sigma-Aldrich	G8270-Глутаральдегид
	ALS	R1009	-
Гемоцитометр	Boeco	-	-
Цитрат свинца	ALS	R1209-Жидкостная
хроматография Масс-спектрометр	Thermo Fisher	Scientific-Methanol
	Sigma-Aldrich	R 34,860-Орбитальный
шейкер	Lasec	-	-
Тетраоксид осмия	ALS	R1015-pHrodo
Green Zymosan A BioParticles	Life Technologies	P35365	Это pH-чувствительный краситель
Физиологический буферный раствор	Sigma-Aldrich	P4417-50TAB-Ротационный
шейкер	Labcon	-	-
Буфер фосфата натрия:
[1] дигидрат гидроортофосфата натрия	[1] Merck	[1] 106580	-
[2] дигидрат дигидрогидрофосфата натрия	[2] Merck	[2] 106345
Просвечивающий электронный микроскоп	Philips	Philips EM 100	- T
Трипан синий	Sigma-Aldrich	T8154-Ультрамикротом
	Leica	EM UC7-Уранилацетат
	ALS	R1260A-Вакуумный
эксикатор	Lasec	-	-
Флакон	Сигма-Олдрич	29651-U-YNB
	Lasec	239210-YPD
агар	Sigma-Aldrich	Y-1500	-