Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Родопсин транспорта пробирного анализа изображений высоким содержанием

5.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58703

⸱

16 января 2019 г.

 ,  , 
1Department of Ophthalmology, University of Pittsburgh, 2McGowan Institute for Regenerative Medicine, University of Pittsburgh

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы описали высоким содержанием изображений метод количественной оценки транспорта родопсин мутантов, связанные с пигментный ретинит. Несколько волны скоринга анализ был использован для количественного определения родопсин белка на поверхности клеток или всю ячейку.

Аннотация

Родопсин сворачиванию мутации приводят к смерти фоторецепторных стержня, которая проявляется как аутосомно-доминирующей пигментный ретинит (RP), прогрессивной ослепляющий болезнью, что не хватает эффективного лечения. Мы предполагаем, что цитотоксичность смятых родопсин мутант могут быть решены путем фармакологически стабилизации мутант родопсин белка. P23H мутации, среди других мутации родопсин II класса, кодирует структурно нестабильной родопсин Мутантный белок, который накапливается в эндоплазматический ретикулум (ER), тогда как дикого типа родопсин транспортируется к плазматической мембране в млекопитающих клетки. Мы ранее выполнена на основе свечения экрана высок объём (HTS) и определили группу фармакологической сопровождающих, которые спасли транспорта P23H родопсина из ER к плазматической мембраны. Здесь мы с помощью метода иммуноокрашивания следуют изображений высокой контент-анализа, количественно мутант родопсин белка сумма в клеточных и на плазматической мембраны. Этот метод является эффективным для определения истинной хиты от ложных срабатываний, после Хайтс и информативным Кроме того анализ изображений высоким содержанием позволили нам определить несколько параметров из одного эксперимента оценить фармакологических свойств каждого соединения. С помощью этого анализа, мы проанализировали влияние 11 различных соединений к шести RP связанные родопсин мутантов, получение 2-D фармакологические профиль для количественного и качественного понимания о структурной стабильности этих мутантов родопсин и эффективность различных соединений к этих мутантов.

Введение

Сворачиванию белков участвует в мышечной дистрофии, нейронной дегенерации, а также ослепляющего заболеваний, включая пигментный ретинит (RP)1. RP-это унаследованные и прогрессивного дегенерация сетчатки, связанных с мутациями в более чем 60 гены, влияющие на функции и гомеостаза стержня фоторецепторов или пигментированной сетчатки epitheliums (RPEs)2,3. Без эффективного лечения в настоящее время доступна для RP. Родопсин мутации приходится около 25-30% аутосомно-доминанта (ad) RP случаев. Среди более чем 150 родопсин мутации4 (человека ген мутации база данных http:/ www.hgmd.cf.ac.uk/), класс II мутации вызывают структурной нестабильность родопсин белок, который способствует стержень фоторецепторных смерти и зрение потери5,6,,78. P23H является наиболее частые мутацией родопсин в Северной Америке, который также является типичным примером класса II родопсин мутации9,10. Из-за присущего структурная нестабильность смятых родопсин накапливается в эндоплазматический ретикулум (ER) в клетках млекопитающих, тогда как родопсин дикого типа расположен на плазматической мембране5. Протеолиз родопсин P23H мутант экспонатов доминирующей негативные цитотоксичность, что не из-за haploinsufficiency, но связано с активацией ER связанные пути деградации белка и организации внешнего сегмента Прерванный стержня. Для облегчения стержень фоторецепторных клеток стресс, одна из стратегий заключается в стабилизации родной складывания мутант родопсина, используя фармакологические сопровождающий.

Для достижения этой цели, мы провели на основе ячеек высок объём экран (HTSs)11,12,13 с помощью анализа взаимодополняемости фрагмент β-галактозидазы для количественного определения мутант P23H родопсина, перевозимых на плазму мембрана. Надежный и простой протокол этот assay HTS позволило нам изучить деятельность около 79000 малых молекул для каждого экрана. Однако потому что этот assay HTS читает свечения сигналов, ложных срабатываний, включая ингибиторов β-Гал, цветные или цитотоксические соединений включены в хит список ожидающих быть идентифицирован вторичного анализа.

Традиционные иммуноокрашивания и флуоресценции тепловизионные методы использовались для лет для изучения родопсин транспорт в mammalian клеток5,14,,1516. Однако эти традиционные методы не может использоваться для количественного определения фармакологические эффекты более 10 соединений к родопсин транспорта, потому что надежный анализ изображений требуется большое количество изображений, снятых при условии высокой согласованностью, который является не исправимый традиционными методами обработки изображений. Здесь мы разработали на основе иммуноокрашивания высоким содержанием визуализации протокола как вторичного анализа для количественного определения клеток поверхности транспорта смятых родопсин мутантов11,13,17. Для обозначения родопсин на плазматической мембране, мы пропущен шаг permeabilization клеточной мембраны и immunostained родопсина мутантов моноклональных анти родопсина (B6-30), признавая N-терминальный epitope родопсина на внеклеточные стороне ячейки мембрана18. Чтобы визуализировать мутант родопсин всю ячейку, мы сплавили родопсин с Венеры флуоресцирование белками. По количественной оценки интенсивности флуоресценции в каналах различных флуоресцирования мы в состоянии получить несколько параметров из одного одного эксперимента, включая общее родопсин интенсивности в целом ячейке, на поверхности клеток и соотношение Родопсин флуоресцирования на поверхности клеток, в целом ячейке. Применяя этот метод, чтобы стабильные клетки, выражая в общей сложности шести смятых родопсин мутантов, мы можем создать профиль фармакологических нескольких сопровождающих малые молекулы к этих мутантов. В этом протоколе все клетки immunostained в пластине 384-Ну и образы с использованием автоматизированной системы обработки изображений под условие весьма последовательной обработки изображений. Анализ изображений выполняется для каждой скважины, содержащие изображения более чем 600 клеток, чтобы уменьшить вариации из-за гетерогенности клеток с различной клетки форму и белка выражение уровня. Процесс этот протокол приводится на рисунке 1. Преимуществом этого метода является, что мы получить изображения с высоким разрешением, а также количественной Многопараметрический от анализа на основе образа. В общем этот протокол может быть модифицировать и применять для количественного определения перевозки любой смятых мембраной протеина интереса.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Примечание: Транспорт родопсин assay.

1. Подготовка и культура клетки

  1. Возродите крио сохранились U2OS стабильной клеток выразить дикого типа (WT) или мутант мыши родопсин Венера синтеза белков. Оттепель клетки при 37 ° C, до тех пор, пока в ампулу остались только небольшие ледяные кристаллы.
    Примечание: U2OS клетки используются в настоящем Протоколе, поскольку для исследования в vitro имеется не фоторецепторных клеток линии и предварительно цилиарной биосинтеза родопсин регулируется аналогичными молекулярных механизмов в mammalian клетках. Кроме того U2OS клетки плотно прикрепить к нижней части пластины и имеют крупные клетки тела, поэтому они идеально подходят для assay транспорта родопсина. Семь U2OS стабильной клетки выражая WT, T4R, P23H, P53R, C110Y, D190N и P267L родопсина мутантов используются здесь как пример, чтобы показать качество и надежность анализа. Стабильные клетки, выражая другие мутанты родопсин или других мембранных белков может использоваться, в зависимости от цели исследования. Стабильные клетки, выражая человеческие родопсина может использоваться в этот assay, если доступно. Родопсин мыши был использован здесь, потому что мышь и белки человека родопсин долю 95% гомологии, и соединений, выявленных этот assay будет протестированных в естественных условиях с помощью мыши adRP модели, перевозящих родопсин P23H мутации8. Стабильные клетки были созданы как описано ранее,19. WT и мутантов родопсин стенограммы были количественно q-ПЦР, и клоны стабильной клеток, выражая аналогичные уровни WT и мутантов родопсин стенограммы были отобраны для этого анализа. Выражение родопсин белков был подтвержден immunoblot и иммуноокрашивания. Прохождение ячеек, которые используются в этом assay должно быть меньше 20.
  2. Каждая линия клеток передачи в 15 мл Конические трубки, содержащие 10 мл среднего роста (высокие глюкоза Дульбекко изменение средних (DMEM) с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) и 5 мкг/мл Plasmocin орла).
  3. Центрифуга трубки на 200 x g для 5 минут удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки лепешка с 5 мл средний рост клеток для каждой ячейки строки. Передачи каждой строки суспензию клеток в культуре ткани блюдо 60 мм и инкубировать при 37 ° C с 5% CO2.
  4. Субкультура клетки когда тканевой культуры блюдо достигает 90% слияния, как описано в ссылка12.

2. Заполнение клеток на 5000 ячеек на колодец

Примечание: Выполните следующие процедуры в культуре ткани капюшоном.

  1. Относитесь к пластине с поли лизин.
    1. Один день перед посевом клетки, лечить черная стена и снимите днище 384-колодец с 20 мкл/хорошо поли лизин решения для 30 мин.
    2. Аспирационная жидкости и разрешить все скважины для просушки на 1 ч. положить обратно крышку плита и хранить пластину на 4 ° C на ночь для заполнения ячейки.
  2. Готовят суспензию клеток.
    1. Культура каждой ячейки строки среднего роста в тканевой культуры блюдо 100 мм до 90% слияния.
    2. Вымойте каждое блюдо с-фосфатный буфер (PBS) и отсоединить клеток в 1 мл 0,05% трипсина в 37 ° C.
    3. Ресуспензируйте каждой линии клеток в 10 мл пробирного среды (DMEM высокой глюкозы с 10% FBS, 100 единиц/мл пенициллина и стрептомицина 100 мкг/мл).
    4. Подсчитать количество ячеек и разбавленных каждой линии клеток до 1.25 x 105 клеток/мл с Пробирной среднего.
  3. Семя клетки.
    1. Использование электронных многоканальные пипетки или Дозатор автоматизированный реагент обойтись 40 мкл/колодец суспензию клеток для трех столбцов в клеточной линии и заливки колонки 1-21 384-ну пластины (рис. 2).
    2. Добавить 40 мкл/хорошо U2OS (P23H-родопсин-Венера) столбцы 22-23 и 40 мкл/хорошо U2OS (родопсин-Венера) столбцу 24, как элементы управления.
    3. Центрифуга пластину на 300 x g 30 s, чтобы сбить все клетки в нижней части пластины 384-хорошо.
      Примечание: Избегайте физического шока к плите после заполнения ячейки. В противном случае клетки будут раздавлены в одном углу каждой скважины, и пластины не будет подходящим для отображения с высоким содержанием.
    4. Инкубируйте 384-ну пластины при 37 ° C с 5% CO2 на 3 ч для клетки, чтобы прикрепить к нижней части пластины.

3. Лечение клетки с соединениями

  1. Создание карты пластины с условия лечения, как показано на рисунке 2.
  2. Подготовка 300 мкл 5 x рабочие решения до 15 соединений в 96-луночных пластине.
    1. Разбавьте cps 1 до 15 с Пробирной среднего в пять раз их окончательного концентраций в скважинах A1 для G2 96-луночных пластины (рисунок 2A). Добавьте 300 мкл пробирного среды в хорошо H2.
      Примечание: Конечная концентрация каждого соединения используется в наиболее эффективной концентрации для спасения транспортного P23H родопсина HTS12,13.
    2. 100 мкл на хорошо 2% диметилсульфоксида (ДМСО) и 25 мкм 9 -СНГ-сетчатки, которые разводят в Пробирной средне колонках 11 и 12, соответственно. Добавить 9 -СНГ-сетчатки в тусклом свете.
  3. Добавление 10 мкл на хорошо 5 x работает решения пластину 384-ну культивируемых клеток (рис. 2B).
    1. Используйте электронные многоканальные пипетки для добавления строки A, C, E, G, I, K, M и O соединениями 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 и 15 из столбцов 1 до 21 (рис. 2). Добавить соединениями 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 и M строкам B, D, F, H, J, L, N и P от столбцов 1 до 21.
    2. Добавьте 10 мкл на хорошо 2% ДМСО в столбцы 22 и 24. 10 мкл на хорошо 25 мкм 9 -СНГ-сетчатки к столбцу 23.
      Примечание: ДМСО используется как элемент управления автомобиля потому, что все соединения первоначально растворяются в ДМСО как запасы. Колонка, 22, содержащие клетки ДМСО лечение выражая P23H родопсина используется как элемент 0%. 9 -СНГ-обработанные клетки сетчатки, выражая P23H родопсина используется как элемент 100%.
  4. Крышка 384-колодец с алюминиевой фольгой и инкубировать пластины при 37 ° C в течение 24 ч.

4. иммуноокрашивания без мембраны Permeabilization пятно родопсин белка на поверхности клеток.

Примечание: Избегайте любых моющих средств в процессе всей иммуноокрашивания держать клеточной мембраны неповрежденными.

  1. Подготовить параформальдегида 4% (PFA) путем разбавления 16% PFA с PBS в соотношении 1:4 тома в химической зонта. Передача 4% ПФА в водоеме реагента.
  2. Выньте пластину 384-Ну в темной комнате с тусклый красный свет. Используйте 8-канальный аспиратор, подключенных к бутылке вакуума коллекции для нежно аспирационная среды. Использование электронных многоканальные пипетки для добавления 20 мкл на хорошо свежеприготовленные 4% PFA всего 384-ну пластины и проинкубируйте втечение 20 мин при комнатной температуре. Чтобы избежать мобильный отряд, всегда укажите советы Аспиратор той же стороне каждой скважины во время чаяния. Не прикасайтесь к области середине нижней каждой скважины. При съемке изображений, выберите поля, чтобы избежать региона тронут Аспиратор. Для инкубаций длиннее 10 минут крышка 384-хорошо с ее крышкой, чтобы избежать испарения.
    Примечание: Клетки фиксируются в темной комнате, чтобы избежать Фотообесцвечивание восстановленный isorhodopsin, которые будут влиять на результат 100% контроля. После фиксации 384-ну пластина может быть вывезены под нормальный свет.
  3. Используйте 8-канальный Аспиратор аспирационная ПФА в каждой скважине и использовать электронные многоканальные пипетки для добавьте 50 мкл на хорошо PBS. Повторите еще два раза для выполнения трех автомойки с PBS.
    Предупреждение: Отходы жидкости содержащие PFA собраны в бутылке ограничен и должен быть утилизирован в качестве опасных химических отходов после эксперимента.
  4. Заблокировать ячейки, добавив 20 мкл на хорошо 5% козьего сыворотки пластину всего 384-Ну и инкубации при комнатной температуре за 30 мин.
  5. Аспирационная 5% козьего сыворотки и мкл 15 за хорошо 20 мкг-1 мл B6-30 анти родопсин антител в сыворотке крови козла 1% для строки A O. Добавить 15 мкл за хорошо 1% козьего сыворотки для строки P для вторичных антител только контрольной группы.
  6. Инкубируйте 384-ну пластины при комнатной температуре за 90 минут или при температуре 4 ° C на ночь. Крышка 384-колодец с алюминиевой фольгой, чтобы избежать Фотообесцвечивание флуорофоров.
  7. Промойте пластины 3 раза с 50 мкл на хорошо PBS.
  8. Аспирационная PBS и 15 мкл на хорошо 5 мкг мл-1 Cy3-конъюгированных коза анти мыши IgG антитела. Крышка 384-колодец с алюминиевой фольгой и инкубации при комнатной температуре в течение 1 ч или при температуре 4 ° C на ночь.
  9. Промойте пластины 3 раза с 50 мкл на хорошо PBS. Добавьте 50 мкл на хорошо PBS, содержащие 1 мкг мл-1 Hoechst 33342 пятно ядер при комнатной температуре в течение 15 мин.
  10. Уплотнение 384-ну пластины с прозрачной пленки до изображений. Крышка 384-колодец с алюминиевой фольгой и хранить при 4 ° C на срок до недели, если изображения принимаются немедленно.

5. Визуализация.

Примечание: Эта процедура обработки изображений высоким содержанием приспособлен к тепловизионной системы, перечисленные в Таблице материал. Процедуры могут быть различными, если с помощью других систем тепловидения высоким содержанием.

  1. Снимите крышку и положить 384-ну пластины в высоким содержанием Тепловизор с A1 расположен в верхнем левом углу плиты.
  2. Открываете изображение приобретение программного обеспечения для настройки параметров для захвата изображений.
    1. Откройте окно пластины приобретение установки и создать новый параметр или загрузить существующий файл установки.
    2. Выберите цель 20 x и созданы пиксель биннинга как 2 таким образом откалиброванные пикселей размер 0,80 x 0,80 мкм. Установите линии сканирования как 2000 и размер изображения (W x H) как 1000 x 1000 пикселей (800.00 x 800.00 мкм) на сайте.
    3. Выберите тип пластины к записи образа. Используйте информацию, предоставленную изготовителем 384-ну пластины для заполнения размеров плиты.
    4. Выберите скважин для отображаемого 384-ну пластины.
    5. Выберите четыре сайты, чтобы быть imaged за хорошо. Избегайте стороне хорошо тронут стремление советы.
    6. Выберите возбуждения лазеры как 405, 488 и 561 Нм. Выберите Фильтры выбросов для DAPI, FITC и Техас красный каналы. Оптимизировать мощность лазера и выгоды каждого канала для обеспечения яркость изображения, взятые из скважин положительный контроль меньше чем порог насыщения.
    7. Установите фокус на скважины для автофокусировки. Выбор первой скважины, приобретенных как первоначальный хорошо для поиска образцов. Набор сайт автофокусом для всех сайтов.
    8. Выберите четыре средние значения в строке для каждого канала. Оптимизируйте значением Z-смещения для каждого канала.
    9. Теста, который 2-3 скважины на диагонали углах 384 хорошо пластины, чтобы убедиться, что изображения на фокус для всех протестированных скважин, изображения со всех сайтов в хорошо иметь ячейки с более чем 40% слияния и интенсивностью флюоресценции всех каналов, около половины насыщены в 100% контроль скважины.
    10. Сохраните метод приобретения изображений.
  3. Выполните всю тарелку. Смотрите томографа, до тех пор, пока он закончит, захват изображений из первого столбца пластины перепроверить качество изображения перед отъездом томографа. Вынуть пластину 384-хорошо и хранить при 4 ° C для использования в будущем.
    Примечание: В зависимости от количества объектов, выбранных в колодец и каналы получения, занимает 40 мин до 3 ч до конца изображений одной пластины 384-хорошо.

6. изображения анализ.

  1. Извлеките данные изображения, с помощью программного обеспечения для анализа изображений высоким содержанием. Выберите один из 100% контроля скважин (графа 23) для настройки параметров.
  2. Выберите Мульти волны клеток забил как метод анализа и настройки.
    1. Определите ядер, используя изображения из DAPI канала. Предварительный просмотр, чтобы убедиться, что определенные ядер фигуры в выбранной хорошо подходит хорошо с образами ядра.
    2. Определите форму ячейки в FITC канала, где образы родопсин Венера.
    3. Определите области поверхности пятен родопсин клеток в Техас красный канал.
    4. Проверьте текущий алгоритм в 5 скважинах для определения, если параметры оптимизированы. Сохранить настройки и закрыть окно настройки .
  3. Выполните все скважины с методом оптимизации анализа.
  4. Экспортируйте Объект номер нетронутыми мобильный номер. Экспортируйте Средней интенсивности FITC канала родопсин-Венера интенсивности (родопсин-Венера INT). Экспортируйте Средней интенсивности Техас красный канал родопсин интенсивности на поверхности клеток (родопсин INT на поверхности клеток).
  5. Откройте экспортированные данные в программу электронных таблиц. Разделите родопсин интенсивности на поверхности клеток родопсин Венера INT как MEM-общее соотношение. Рассчитать Z'-факторов для каждого параметра, чтобы оценить качество анализа. Z′ = 1−3X (STD100% контроль+STD0% управления) / | Означает100% контроль−Meanуправления 0%|.
    Примечание: Z'-фактор превышает 0 указывает умеренной пробирного достаточно высоким содержанием экрана и Z' фактор между 0,5 и 1 предлагает выдающиеся assay для высокой пропускной способности экрана20,21.
  6. Используйте программу электронной таблицы для создания двух цветные тепловую карту для каждого параметра. Организовать имя клеточных линий на оси x и соединений на оси y.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мы были характерны родопсин транспорта с тремя параметрами: интенсивность родопсин Венера в клеточных (родопсин-Венера INT), интенсивность иммуноокрашивания родопсина на плазматической мембране (родопсин INT на поверхности клеток) и соотношение Родопсин пятно на поверхности клеток к интенсивности родопсин Венера в клеточных (MEM-всего отношение). Представитель результат анализа транспорта родопсин показан на рис. 3 и рис. 4. С по...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы показали высоким содержанием изображений пробирного используется для квалификации хитов от Хайтс Только автоматизации, участвующих в этих протоколах является высоким содержанием томографа. Иммуноокрашивания и флуоресценции изображений родопсина обычно используются характеризовать локализации родопсин5,14,,1516. Однако количественная оценка изображений, снятых традиционными методами обр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы благодарим д-р Марк э. Schurdak и обнаружения наркотиков университета Питтсбурга институт высоким содержанием тепловизор и начального обучения. Д-р Krzysztof Palczewski (Университет Кейс Вестерн Резерв) щедро поделился 4 1 d и B630 антитела анти родопсина. Плазмиды, содержащие cDNA мыши родопсин Венера конструкции разделяют доктор Невин Ламберт (Augusta университет). Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения грант EY024992 ус и P30EY008098 из Питтсбургского университета видение исследования основных грант.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Клетки U2OS (родопсин-Венера)NAСтабильные клетки, полученные из клеток U2OS
Клетки U2OS (T4R-родопсин-Венера)NAСтабильные клетки, полученные из клеток
U2OS (P23H-родопсин-Венера) клетки NANA Стабильные клетки, полученные из клеток U2OS
P53R-родопсин-Венера)NANA Стабильные клетки, полученные из клеток U2OS
Клетки U2OS (C110Y-родопсин-Венера)NANAСтабильные клетки, полученные из клеток U2OS
U2OS (D190N-родопсин-Венера)клетки NANAСтабильные клетки, полученные из клеток U2OS
(P267L-родопсин-Венера) клетки NANA Стабильные клетки, полученные из клеток U2OS
DMEM с высоким содержанием глюкозы GeneseeScientific25-500С L-глутамином, натрием пируват
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Gibco16140071Термоинактивированный
плазмоцинInvivoGenant-mptРеагент для элиминации микоплазмы
Пенициллин-стрептомицин (100X)Gibco15140122100X концентрированные растворы антибиотиков для предотвращения бактериального загрязнения клеточных культур
Trypsin-EDTAGenesee Scientific25-5100,25%, 1 мМ ЭДТА в HBSS без раствора
поли-L-лизинаSigma-AldrichP4707-50MLМоль массой 70 000-150 000, 0,01%, стерильно-фильтрованный, Биореагент, подходит для клеточной культуры
CellCarrier-384 Ultra MicroplatesPerkinElmer6057300384-луночные тканевые обработанные микропланшеты с черными стенками лунок и оптически чистым циклическим олефиновым дном для визуализации клеток при анализе
высокого содержанияСтерильный 96-луночный планшетEppendorf30730119Тканевая культура, обработанная крышкой с плоским дном, стерильная, без обнаруживаемых пирогенов, рназы, ДНКазы и ДНК. Нецитотоксический
фосфатный буферизованный саилин (PBS)InvitrogenAM962510 x PBS Buffer, pH 7,4
DMSOSigma-AldrichD4540>99,5%, клеточная культура протестирована
9-цис-ретинальноеSigma-AldrichR5754
протестированоSelleckchem/Life Chemicals/Custom синтезированныеNAбыли приобретены у различные поставщики или специально синтезированное
антитело против родопсина B6-30NovusNBP2-25160Подарок от доктора Кшиштофа Пальчевски
Cy3-конъюгированное козье вторичное антитело против мышиJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc115-165-146
16% параформальдегидThermo Fisher Scientific28908без метанола
10% нормальная козья сывороткаThermo Fisher Scientific50062ZБлокирующий буфер
Hoechst 33342, ТригидрокInvitrogenH3570Раствор для ядерного окрашивания
Формирователь изображений с высоким содержаниемМолекулярные устройстваImageXpressImageXpress® Микроконфокальная система визуализации с высоким содержанием
MetaXpress Программное обеспечение для получения и анализа изображений с высоким содержаниемМолекулярные устройстваMetaXpressПрограммное обеспечение для получения и анализа изображений с высоким содержанием
Многоканальная пипетка (0,5-10 &; L)Rainin17013802ручной 8-канальный пипетка, 0,5-10 и микро; L
Многоканальный дозатор (0,5-10cRainin17013805ручной 8-канальный пипетка, 20-200 &; L
Электронный многоканальный дозатор (10-200 μ L)Thermo Scientific14-3879-56BTЭлектронный многоканальный пипетка для 96- и 384-луночного микропланшетного пипетирования
50 мл Резервуар для реагентовGenesee Scientific28-125Резерв реагентов для многоканального дозирования пиппет
8-канальный аспираторABC ScientificEV5038-канальный адаптер из нержавеющей стали для аспирации жидкостей с 96- или 384-луночных планшетов
Excel программное обеспечение для работы с электронными таблицамиMicrosoftExcel2016Программное обеспечение для анализа электронных таблиц и создания тепловых карт
Origin2018 Программное обеспечение для анализа научных данных и построения графиковOriginLabOrigin2018Программное обеспечение для анализа данных для создания кривых реакции на дозу
( клетки кальция и магния соединение соединения

Ссылки

  1. Gregersen, N., Bross, P., Vang, S., Christensen, J. H. Protein misfolding and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 7, 103-124 (2006).
  2. Daiger, S. P., Bowne, S. J., Sullivan, L. S. Perspective on genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Archives of Ophthalmology. 125 (2), 151-158 (2007).
  3. Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. Genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).
  4. Stenson, P. D., et al. The Human Gene Mutation Database: towards a comprehensive repository of inherited mutation data for medical research, genetic diagnosis and next-generation sequencing studies. Human Genetics. 136 (6), 665-677 (2017).
  5. Sung, C. H., Schneider, B. G., Agarwal, N., Papermaster, D. S., Nathans, J. Functional heterogeneity of mutant rhodopsins responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (19), 8840-8844 (1991).
  6. Athanasiou, D., et al. The molecular and cellular basis of rhodopsin retinitis pigmentosa reveals potential strategies for therapy. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 1-23 (2018).
  7. Chiang, W. C., et al. Robust Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation of Rhodopsin Precedes Retinal Degeneration. Molecular Neurobiology. 52 (1), 679-695 (2015).
  8. Sakami, S., et al. Probing mechanisms of photoreceptor degeneration in a new mouse model of the common form of autosomal dominant retinitis pigmentosa due to P23H opsin mutations. Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10551-10567 (2011).
  9. Dryja, T. P., et al. Mutations within the rhodopsin gene in patients with autosomal dominant retinitis pigmentosa. New England Journal of Medicine. 323 (19), 1302-1307 (1990).
  10. Sohocki, M. M., et al. Prevalence of mutations causing retinitis pigmentosa and other inherited retinopathies. Human Mutation. 17 (1), 42-51 (2001).
  11. Chen, Y., et al. A novel small molecule chaperone of rod opsin and its potential therapy for retinal degeneration. Nature Communications. 9 (1), 1976 (2018).
  12. Chen, Y., Tang, H. High-throughput screening assays to identify small molecules preventing photoreceptor degeneration caused by the rhodopsin P23H mutation. Methods in Molecular Biology. 1271, 369-390 (2015).
  13. Chen, Y., et al. A High-Throughput Drug Screening Strategy for Detecting Rhodopsin P23H Mutant Rescue and Degradation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (4), 2553-2567 (2015).
  14. Noorwez, S. M., et al. Pharmacological chaperone-mediated in vivo folding and stabilization of the P23H-opsin mutant associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa. Journal of Biological Chemistry. 278 (16), 14442-14450 (2003).
  15. Saliba, R. S., Munro, P. M., Luthert, P. J., Cheetham, M. E. The cellular fate of mutant rhodopsin: quality control, degradation and aggresome formation. Journal of Cell Science. 115, 2907-2918 (2002).
  16. Kaushal, S., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin. 7. Point mutations associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa. Biochemistry. 33 (20), 6121-6128 (1994).
  17. Chen, Y., Brooks, M. J., Gieser, L., Swaroop, A., Palczewski, K. Transcriptome profiling of NIH3T3 cell lines expressing opsin and the P23H opsin mutant identifies candidate drugs for the treatment of retinitis pigmentosa. Pharmacological Research. 115, 1-13 (2016).
  18. Adamus, G., et al. Anti-rhodopsin monoclonal antibodies of defined specificity: characterization and application. Vision Research. 31 (1), 17-31 (1991).
  19. Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (9), pdb prot5480 (2010).
  20. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  21. Bray, M. A., Carpenter, A., et al. Advanced Assay Development Guidelines for Image-Based High Content Screening and Analysis. Assay Guidance Manual. Sittampalam, G. S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. Bethesda (MD). (2004).
  22. Sung, C. H., Davenport, C. M., Nathans, J. Rhodopsin mutations responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Clustering of functional classes along the polypeptide chain. Journal of Biological Chemistry. 268 (35), 26645-26649 (1993).
  23. Krebs, M. P., et al. Molecular mechanisms of rhodopsin retinitis pigmentosa and the efficacy of pharmacological rescue. Journal of Molecular Biology. 395 (5), 1063-1078 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

P23H
Родопсин транспорта пробирного анализа изображений высоким содержанием
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.