Методическая статья

Исследование генетических зависимостей с помощью анализов на основе ТРИФОСФАТЫ Cas9 конкурс

DOI:

10.3791/58710

⸱

7 января 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Tumor Initiation and Maintenance Program, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, 2Blood Research Institute, Blood Center of Wisconsin, 3Department of Bioengineering, University of California, San Diego

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта рукопись описывает основанный ТРИФОСФАТЫ-Cas9 метод кластерного регулярно Interspaced короткие палиндром повторяет (ТРИФОСФАТЫ) для простого и оперативного расследования роли нескольких генов кандидат в острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) пролиферации в параллельно. Эта техника является масштабируемым и может быть применен в других рак клеточных линий, а также.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Джин возмущений исследования широко используются для изучения роли отдельных генов в патогенезе бод. Для достижения полной гена срыв, многие из этих исследований сделали использовать сложные гена нокаут моделей. Хотя эти исследования с нокаут мышей предлагают элегантный и проверенные временем системы для расследования взаимоотношений генотип фенотип, быстрый и масштабируемый метод для оценки кандидата генов, которые играют роль в AML пролиферации или выживания в моделях ПФТ поможет ускорить параллельных допроса нескольких генов кандидата. Последние достижения в технологии изменения генома резко повысили нашу способность выполнить генетических возмущений в беспрецедентных масштабах. Одна такая система генома редактирования является основанный ТРИФОСФАТЫ-Cas9 метод, который может использоваться для сделать быстрые и эффективные изменения в геноме целевой ячейки. Простоту и масштабируемость ТРИФОСФАТЫ/Cas9-опосредованной ген-удаления делает его одним из самых привлекательных методов допроса большого числа генов в фенотипических анализов. Здесь мы представляем простой анализа с использованием ТРИФОСФАТЫ/Cas9 при посредничестве ген нарушения в сочетании с высокой пропускной способностью на основе потока цитометрии конкуренции анализов расследовать роль генов, которые могут играть важную роль в распространении или выживания человека и мышиных ПФТ клеточных линий.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В последние несколько десятилетий стали свидетелями многочисленных исследований было сосредоточено на выявлении вклад основные молекулярные пути в патогенезе острый миелоидный лейкоз (ОМЛ). Традиционно ген нарушения в клетках AML была выполнена с использованием условной нокаут мышей или шпильки короткие РНК (индуцируемый). В то время как нокаут мышей предлагают сложную систему для пространственно временной контроль ген-удаления, генерации мышей Нокаут гена трудоемкий, длительным и дорогостоящим. Кроме того ген просвечивание с помощью рекомбинации стратегии не легко масштабируемой; Эти стратегии не хорошо подходят для допроса нескольких генов параллельно. После открытия РНК интерференции методы для нокдауна эндогенного мРНК, используя малые интерферирующие РНК (siRNA) или индуцируемый многие группы началась с использованием методов РНК интерференции для расследования роли конкретных генов в борьбе с отмыванием денег. Поскольку мышиных и человеческие клетки AML сложно transfect методами традиционной липидных трансфекции, большинство исследований работает lentivirally или retrovirally кодировке индуцируемый для изучения функции генов в клетках бод. Недавнее открытие кластеризованной регулярно interspaced короткие палиндром повторяется (ТРИФОСФАТЫ) и связанные Cas nucleases (ТРИФОСФАТЫ-Cas9) революционизировало ген ориентация технологии1,2,3. С помощью ТРИФОСФАТЫ-Cas9, конкретные гены или геномных регионов может быть удален, редактировать или с меткой эффективность и простота. ТРИФОСФАТЫ-Cas9-редактирование на основе гена теперь становится методом выбора для расследования взаимоотношений генотип фенотип в типах различных клеток, благодаря простоте, эффективности и широкого применения этой техники. Методы, основанные на ТРИФОСФАТЫ-Cas9 также становится методом выбора в борьбе с отмыванием денег, не только для допроса отдельных генов, но также, как способ для нескольких генов в выстроились или пула генетической экраны, направленных на расследование нескольких генов параллельно как потенциал AML-зависимости4,5,6.

В этой рукописи мы опишем простой конкурентных роста assay для измерения воздействия ген беспорядки на рост клеток ПФТ, основанный на стабильной ТРИФОСФАТЫ-Cas9-опосредованной ген редактирования следуют высок объём проточной цитометрии. Этот метод является простой, эффективной и масштабируемой пропускной способности среднего экспериментов для изучения роли нескольких генов параллельно в клетках бод.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. создания AML клеток линии клоны с высоким выражением стабильных и активного Cas9

  1. Производство Cas9 Лентивирусы
    1. День 0:6 293T клетки Клемная 4 x 10 в 10 мл DMEM с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), пенициллин и L-глютамина в 10 см блюдо культуры ткани в области биобезопасности уровня 2 (BSL2) сертифицированные капот культуры клеток. Поместите блюдо в инкубаторе 37 ° C.
    2. День 1: Покрытием 293T клетки должен быть 70-80% притока на 1 день. Выполните трансфекции, используя следующий протокол в послеобеденное время.
    3. Теплый трансфекции среднего, культуры средств массовой информации и трансфекции реагента до комнатной температуры. Размораживание всех требуемых плазмид для transfection.
    4. Mix 9 мкг psPAX2, 0,9 мкг pMD2.G и 9 мкг с 500 мкл трансфекции среды в 5 мл pLenti-Cas9 плазмид.
    5. Добавьте 1,7 мл среды трансфекции 14 мл круглая труба внизу. Добавьте 57 мкл Реагента трансфекции непосредственно в трансфекции среднего в трубе не прикасайтесь к стенке трубки.
    6. Аккуратно добавить смесь всего плазмида трансфекции реагент решение и смешайте нежно касания трубку на стороне. Инкубируйте смесь при комнатной температуре 20 – 30 мин. Тем временем измените носитель с семенами 293T пластины.
    7. Добавить смесь трансфекции каплям к пластине и осторожно покачайте пластину боком для эффективного смешивания. Место пластину в инкубаторе 37 ° C.
    8. День 2: Аспирационная супернатант от пластины трансфекции нежно что клетки не нарушается или смещены от пластины. Выбросите супернатант. Добавьте 10 мл свежего среде DMEM 10% путем сползать вниз осторожно от стороны пластины во избежание выбивании клетки.
    9. День 3: Собирайте вирус, содержащий супернатант от пластины трансфекции медленно, опираясь в стерильный шприц 10 см. После супернатант собирается в шприц, придают стерильные 0,45 мкм фильтром шприц и удерживайте шприц и фильтр более свежий, стерильные 15 мл полипропиленовые Конические трубки. Аккуратно окунуться шприц для фильтрации вирусов, содержащих супернатант через 0.45 мкм фильтром в 15 мл полипропиленовые Конические трубки.
    10. Хранить вирусный кондиционером среднего аликвоты по 2 мл в криопробирки 2 мл-80 ° c.
  2. Трансдукция ПФТ клеточных линий
    1. День -1: Развести 1 мг/мл рекомбинантного человеческого фибронектин фрагмент складе до 10 мкг/мл с стерильных фосфат амортизированное saline (PBS). В Гуд культуры клеток BSL2 одобрил пальто культуры ткани лечение 6 хорошо плита с 2 мл раствора рабочей фрагмент содержит рекомбинантного человеческого фибронектин 10 мкг/мл. Оберните пластину в цепляются обертка, чтобы избежать потери на испарение и хранить при комнатной температуре на ночь.
    2. День 0: Оттепель вирусный супернатанта, содержащие Cas9. Аспирационная рекомбинантного человеческого фибронектин фрагмент решение полностью с покрытием плиты непосредственно перед spinfection. Добавить 2 мл вирусных кондиционером среды с Cas9 к пластине и спина его на g 1300 x 90 мин при 35 ° C. Это помогает вирусные частицы, которые придают spinfected хорошо.
    3. Тем временем, граф клетки, чтобы быть преобразованы и спином вниз 2 х 106 клеток в 15 мл полипропиленовые Конические трубки. Аспирационная супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 2 мл свежего культуры средств массовой информации.
    4. После spinfection удалить все вирусные супернатант из spinfected хорошо и отбросить. Ретровирусные частицы от супернатант хорошо прикреплены к нижней части spinfected. Это хорошо, добавьте 2 x 106 клеток высокомобильна в 2 мл среды из шага выше.
    5. Спиновые пластину снова на 1300 x g очень кратко (1 – 2 мин) достаточно, чтобы позволить клетки поселиться в нижней части. Установите пластины обратно в инкубаторе и оставить на ночь для трансдукции с spinfected вирусных частиц, прилагается к колодцу.
    6. День 1: В зависимости от плотности клеток, добавьте больше среднего transduced клеток, чтобы избежать разрастания.
    7. День 2: Поскольку плазмида pLenti-Cas9 маркер сопротивления Blasticidin, добавьте Blasticidin в дозе 10 мкг/мл transduced и untransduced (управления) MOLM13 или мыши MLL-AF9 лейкозных клеток для отбора Cas9 выражая клетки.
      Примечание: Blasticidin выбор Cas9-преобразованы MOLM13 или MLL-AF9 лейкозных клеток считается завершенным, когда были ликвидированы все клетки untransduced управления. Для клеточных линий, за исключением MOLM13 и MLL-AF9 лейкоз кривой отклика дозы должны быть выполнены перед этот эксперимент, так что оптимальная доза может применяться. Титрование вирусный супернатант могут также выполняться при низкой трансдукция ставки.
  3. Клон выбор высоких Cas9 выражая клеток.
    Примечание: Мы заметили, что в некоторых ПФТ клеточных линий, клон выбор не может быть необходимым: основная Cas9-Blasticidin выбран населения уже имеет высокую эффективность изменения генома. В этом случае можно пропустить шаг 1.3 и перейти к шагу 1.4 для оценки выражения Cas9 в клетках ПФТ массовых Cas9-blasticidin, Западный blotting. По-прежнему было бы важное значение для оценки эффективности редактирования гена в этих массовых Cas9-AML клеток (шаг 1.5) прежде чем приступить к конкуренции анализов. Мы предположить, что выбор одного высокого Cas9 клонов уменьшает изменчивости генома редактирования, который является особенно важным при тестировании ряда различных единого руководства РНК (sgRNAs).
    1. Выполните одноклеточных, своего рода Cas9-Blasticidin выбран MOLM13 и MLL-AF9 клеток лейкемии, отныне называется MOLM13-Cas9 и MLL-AF9-Cas9 клеток, соответственно, с помощью СУИМ сортировщик, содержащихся в капюшоне BSL2 одобрил. Сортировка может быть выполнена в 5 – 10 круглым дном культуры ткани 96 хорошо обработанные пластины.
    2. Однажды один MOLM13-Cas9 и клоны MLL-AF9-Cas9 были собраны и индивидуально именем, разверните 10 – 20 клоны с 10 мкг/мл Blasticidin в культуре средств массовой информации для обеспечения поддержания Cas9 выражения.
  4. Выражение проверить стабильного белка Cas9, immunoblotting.
    1. Сделайте ядерные экстракты всех клонов Blasticidin выбран MOLM13 и MLL-AF9 лейкоза, с использованием ядерных добыча комплект согласно протоколу производителя. Проверьте Cas9 выражение протеина с использованием анти флага м2 антитела с Cas9 в pLenti-Cas9 плазмиды связан с N-терминальный флаг epitope.
    2. Загрузите 50 мкг общего белка из каждой ядерной экстракт на 10%, бис-трис гель и Побегите гель на 120 V до верхней полосы хорошо отделены.
    3. Блокировать мембраны с 5% раствором молока в TBST буфер для 1 h.
    4. Проинкубируйте мембрану с 1:1,000 разбавления антитела анти флаг м2 в конечной концентрации 1 мкг/мл при температуре 4 ° C на ночь.
    5. Следующий день, Промойте мембрану с TBST буфер и проинкубируйте с ПХ конъюгированных анти мыши вторичное антитело на ослабление 1:5,000 (конечной концентрации 0,16 мкг/мл) при комнатной температуре в течение 1 ч.
    6. Промойте мембрану тщательно с TBST и развивать пятно с помощью ECL субстрата.
    7. Выберите 3 – 4 клоны с высшим выражением белка Cas9, как видно, Западный blotting для дальнейшего функционального анализа (рис. 1).
  5. Обеспечение высокой Cas9 активностью в отдельных клонов
    1. Подготовка лентивирусные супернатант от вектор кодирования sgRNA с sgRNAs, ориентация человека или мыши AAVS1-избежании локус, как описано в шаге 1.1.
    2. Передают Топ Cas9-выражая MOLM13 или MLL-AF9 лейкоз клоны с лентивирусные супернатант анти AAVS1 sgRNA, с помощью метода spinfection, описанного выше. Выберите с 2,5 мкг/мл Puromycin для 4 дней.
    3. Очищайте геномной ДНК от лейкемии клоны MOLM13-Cas9 или MLL-AF9-Cas9 после Puromycin выделение с соответствующих одичал тип элементов управления с использованием геномной ДНК добыча комплект в соответствии с инструкциями производителя. Использование 50 нг ДНК как шаблон для выполнения ПЦР с AAVS1_test_primers с помощью 2 x мастер смеси Taq-полимеразы и ПЦР программы, перечисленные в таблице 1.
    4. Запуск продукта ПЦР на 2% агарозном геле и гель Очистить полосе пары 268, используя набор извлечения геля согласно протоколу производителя. Сэнгер последовательности гель очищенный продукт PCR, используя праймер AAVS1_target-frag_F.
    5. Оцените эффективность редактирования путем сравнения AAVS1 отредактированы и wildtype последовательностей с использованием онлайн веб-инструменты (рис. 2).

2. клонирование и трансдукция sgRNAs в клетках AML-Cas9

  1. Средне-пропускная способность клонирование sgRNAs
    1. Дизайн 4-6 sgRNAs для гена интереса, используя веб-ТРИФОСФАТЫ дизайн программного обеспечения. Существует ряд ТРИФОСФАТЫ дизайн инструментов доступны онлайн такие, как http://crispr.mit.edu/ которые генерируют sgRNA последовательности на основе входной последовательности ДНК.
      1. Введите соответствующие сведения в поля со звездочками. Нажмите на целевой генома sgRNA дизайн. Вставьте в поле последовательность последовательности целевых объектов и нажмите на кнопку " Отправить ".
    2. Для клонирования в pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W sgRNA выражение плазмида, вставьте нуклеотидов «CACC» в смысле oligo и «AAAC» для обратного дополняет антисмысловых oligo перед заказом. Порядок смешиванием и анти чувство oligos в плиту 96-луночных помечены Oligo-микс от компании синтеза олигонуклеотида.
      Примечание: Мы сделали использование pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W плазмида, который имеет BbsI ограничение сайт для sgRNA клонирования. В случае, если используются другие sgRNA выражение плазмид, свесы, используемые для sgRNA олигонуклеотидов должны быть изменены соответственно.
    3. Возьмите отдельный U 96-луночных днище помечены Отжига пластины. Сделать мастер смесь 1 мкл T4 ПНК, 1 мкл 10 x буфер лигирование T4 ДНК и 6 мкл воды на отжиг реакции.
    4. Мкл 8 мастер смеси для каждой скважины отжига пластины. Добавьте 1 мкл, 100 мкм, смысл и антисмысловых oligo (или 2 мкл смешанные чувства анти смысл oligos), главный микс. Пипетка 2-3 раза осторожно смешать хорошо, спина пластину кратко для получения смеси в нижней части скважины.
    5. Используйте следующие отжига программу на машине ПЦР: 30 минут при 37 ° C, 2 мин 30 сек при 95 ° C следуют медленного охлаждения до 22 ° C со скоростью 0,1 ° C/сек. После отжига, возьмите свежий 96-луночных тарелку помечены Разбавленным OligoMix. В этой плиты разбавляют фосфорилированных и отожженной oligos от выше реакции с водой (1: 200) с помощью многоканальных дозаторов.
    6. Digest 5 мкг pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W вектор с 1,5 мкл BbsI энзима ограничения (10 000 единиц/мл) с помощью соответствующего буфера при 37 ° C 2 h для линеаризации для перевязки позже.
    7. Возьмите свежие 96 хорошо тарелку помечены Лигирование пластины и добавить 20 нг BbsI переваривается pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W вектор одной скважины за желаемого sgRNA лигирование. К этому добавьте 2 мкл фосфорилированных, отожженная oligos от пластине Разведен OligoMix .
    8. Добавьте 1 мкл 10 x T4 лигаза буфера и 1 мкл фермента ДНК лигаза T4. Аккуратно Пипетка с многоканальные пипетки и инкубировать лигирование смеси при комнатной температуре в течение 2 ч.
      Примечание: Перешнуровка смеси могут храниться при-20 ° C для преобразования шаг позднее.
    9. Тем временем оттепели 90 мкл химически сведущее Escherichia coli клеток на льду 10 мин до конца шага перевязки.
    10. С помощью многоканальных дозаторов, сделайте 10 мкл аликвоты компетентных клеток в каждой скважине отдельной 96 хорошо пластины.
    11. Добавить смесь перевязка из шага 2.1.8 в хорошо содержащие сведущие клетки, Пипетка вверх и вниз осторожно и проинкубируйте втечение 10 мин при комнатной температуре.
    12. Пипетка 5 мкл бактерии ДНК смесь непосредственно из выше реакции в 6 хорошо пластины, содержащий LB-агар с 100 мкг/мл ампициллина. Повторите для каждого преобразования реакций.
    13. Тарелка каждого преобразования реакции в отдельно помечены хорошо 6-ну пластины. Добавьте примерно 5 – 8 стеклянные бусины каждому хорошо и встряхнуть весь 6-ну пластины 8 – 10 раз в круговом движении.
    14. Выбрать один колоний 1 – 2 от каждой скважины с кончиком пипетки стерильные 20 мкл и полоска в тщательно помечены пятно на стерильные 10 см Петри с LB агар и 100 мг/мл ампициллина. После мелирование в пластину фунтов, просто выкинуть кончик для клон мелирование в 3 мл LB-ампициллина содержащих среды в 14 мл круглая труба внизу отмечена с соответствующим номером бактериальных клон.
    15. Отправить пластину бактериальных непосредственно для Сэнгер виртуализации вперед грунтом человека U6 промоутер.
    16. После подтверждения последовательности клонированной sgRNAs очищают ДНК из соответствующего 14 мл трубки с помощью мини-подготовка комплекта согласно инструкциям производителя.
    17. Измерьте концентрацию и качество каждого из мини парфюмерные спектрофотометром. Нормализация каждой мини-подготовка к концентрации 15 нг/мкл и пипетки в 96 хорошо плиту помечены sgRNA клоны пластины.
      Примечание: Эта пластинка может хранить при-20 ° C или используется непосредственно для приготовления вирус.
  2. Вирусная производство sgRNA конструкций и трансдукция
    1. Для производства sgRNA лентивирусные частиц в 96-луночных формате, выполните «индуцируемый/sgRNA/ORF высокой пропускной способности вирусный производства (96 хорошо) «протокол от платформы генетических возмущений (web портал GPP) широкой института (URL-адрес: https:// Portals.broadinstitute.org/GPP/Public/Resources/Protocols).
    2. Передача 200 мкл вирусных супернатант в стерильные пробирки и немедленно заморозить при температуре-80 ° С.
    3. День -1: Пальто плоское дно Non ткани Культура лечение 96 также пластины с 100 мкл рекомбинантного человеческого фибронектин фрагмента в концентрации 10 мкг/мл в капюшоне культуры клеток BSL2. Оберните пластину с помощью цепляются обертка, чтобы избежать потери на испарение и оставить его на скамейке на ночь.
    4. День 0: Удалите фрагмент содержит рекомбинантного человеческого фибронектин из каждой скважины. Оттепель вирусный супернатант каждого sgRNA при комнатной температуре. 50 мкл вирусных супернатант от каждой трубы к каждому покрытием и трансдукция пластины. Спиновые трансдукции пластины на 1300 g x 90 мин при 35 ° C.
    5. В конце spinfection граф MOLM13-Cas9 (клон B3) клетки от культуры колбу. Используйте 10 000 ячеек на хорошо объема 100 мкл. Подсчет ячеек для всех скважин трансдукции, учитывая мертвого объема.
    6. После spinfection 90 мин удалите супернатант из всех скважин, используя многоканальные пипетки скорректирована по 50 мкл медленно наклоняя тарелку. 100 мкл культуры клеток MOLM13-Cas9 клон B3, чтобы каждый хорошо медленно скольжения вниз от обода.
    7. Спиновые пластину на 1300 x g на 2 мин при 35 ° C до пусть оседают на дно клетки. Передать плита класса инкубатора 37 ° C тканевой культуры.
    8. День 1: Добавьте 100 мкл свежих средних каждый хорошо содержащие sgRNA преобразованы Cas9-MOLM13 или Cas9-MLL-AF9 лейкемии клеток, таким образом, что окончательное средний объем составляет 200 мкл.

3. конкурентоспособные роста Assay

  1. День 3: 72 h (день 3) пост трансдукции, проверьте процент sgRNA, содержащие BFP клеток в каждой скважине подачей cytometry (СУИМ). Использование красителя жизнеспособность клеток Марк и исключить мертвые клетки из анализа.
  2. Далее, повторно покрытие доли клеток в новой скважины с свежие среднего после каждого СУИМ анализа во избежание разрастание в assay.
  3. Повторяйте каждые 2-3 дня анализ СУИМ проверить относительную долю BFP положительных (BFP + ve) клеток, по сравнению с BFP отрицательные (БПС ve) (рис. 3). Анализируйте процент положительных клеток BFP для каждой точки времени (с использованием FlowJo или аналогичного программного обеспечения для анализа FACS).
    1. Перетащите файлы Fcs для каждого образца FlowJo программного обеспечения. Дважды щелкните на любой один образец файла и сюжет дот-блот вперед разброса (FSC) против стороны точечной (SSC) с FSC по оси X и SSC на оси Y. Ворота всех клеток.
    2. Дважды щелкните на закрытом клетки и печати их на жизнеспособность пятно (на оси Y) vs. FSC высота (H) или области (A) дот-блот. Ворота жизнеспособность пятно отрицательные клетки (live).
    3. Дважды щелкните на закрытом живых клеток и сюжет BFP (на оси Y) vs. FSC (A) на оси X. Ворота BFP + ve клеток. Применить все эти ворота для всех образцов, перетащив выбранный образец для Всех образцов на вкладке группы .
    4. Щелкните Редактор таблиц , чтобы сделать таблицу анализа всех образцов. Перетащите BFP + ve рассчитывать от одного образца в таблице и нажмите на кнопку дисплей в Редактор таблиц для создания пакета отчета всех образцов с таблицей отображения процент BFP + ve клеток. Сохраните таблицу как xls.
  4. Рассчитать пропорциональное увеличение или уменьшение % BFP позитивных клеток в живых клеток населения с течением времени и сравнить этот показатель соотношения BFP позитивных клеток в sgRNAs управления (например Люцифераза, яичница или GFP sgRNA).
  5. Участок соотношение позитивных клеток BFP для различных sgRNAs, включая gene(s) интерес, а также элементы управления, используя день 3 в качестве базового.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В нашем исследовании мы сначала преобразованы MOLM13 человека ПФТ клеток линии, которая несет транслокации MLL-AF9 с высоким титр вируса кодирования лентивирусные плазмида Cas9-blasticidin. В наших руках массовых несортированные MOLM13-Cas9 клетки не отображать выражение высокого уровня Cas9, Западный blotting и также не выполняют хорошо, когда assayed для эффективного редактирования-с помощью метода гена описано выше7. Таким образом мы приступили к созданию клонов...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой рукописи мы описываем подробный протокол для проведения пробирного ТРИФОСФАТЫ-Cas9 основе конкурентоспособных роста расследовать роль генов кандидата в AML клеточных линий с помощью проточной цитометрии в клетках человека/мышиных AML (рис. 5). Цель анализа требуется определить эффект удаления гена на поддержание пролиферации клеток ПФТ более двух-трех недель на пропускной способности среднего масштаба. Некоторые важнейшие шаги необходимо тщательно следовать для облегчения наращивания ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.J.D является консультантом A2A Фармацевтика (Нью-Джерси) и Salgomed терапии (Сан-Диего). Другие авторы имеют конфликты не объявить.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Плазмиды pCW-Cas9 был подарок от Eric Lander и Дэвид Сабатини (плазмида # 50661 Addgene) и pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W плазмиды от Юса лаборатории (плазмида #67974 Addgene. Мы хотели бы поблагодарить проточной цитометрии ядро SBP медицинского открытия Института за своевременную помощь с анализа потока и сортировки. Мы хотели бы отметить поддержку леди Тата Мемориальный фонд до н.э. Мы хотели бы также отметить поддержку следующие источники финансирования: NIH/NCI Р30 CA030199 рака центр при поддержке гранта, Сан-Диего NCI рака центров (C3) и V-фонд #PTC2017to A.J.D.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
FLAG-M2 Антителоsigma-aldrichF3165, лот # SLBS3530V
Антитело против мышиInvitrogen31446, лот # TA2514341
SuperSignal West Femto Подложка максимальной чувствительностиThermo Fisher34095
ChemiDoc Imaging SystemBIO RAD17001401
центрифуга Sorvall Legend RT ThermoScientific
БластицидинThermo FisherR21001
SYTOX RedThermo FisherS34859
Opti-MEMThermo Fisher31985062
DMEMThermo Fisher11965-092
RPMIThermo Fisher11875-093
Пенициллин-стрептомицинThermo Fisher15140122
L-глютамин (200 мМ)Thermo Fisher25030081
фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS)SAFC12303C
вектор одиночной гРНКAddgene #67974pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W
CelLytic Nuclear Extraction kitsigma-alorichNXTRACT
XtremeGENE 9sigma-alorich6365787001
Проточный цитометр РетронектинТакараT100B
BD Biosciences
T4 PNKNEBioLabsM0201S
T4 Буфер для лигирования ДНКNEBioLabsB0202S
T4 ДНК-лигаза ферментNEBioLabsM0202S
АмпициллинФишера научныйBP1760-25
LB агарFisher scientificBP9724-500
LB BrothFisher scientificBP9731-500
Qiagen мини-набордля подготовки Qiagen27104
NanoDrop спектрофотометрThermo Fisher NanoDropOne
рекомбинантный мышиный IL-3Peprotech213-13
Рекомбинантный мышиный IL-6Peprotech216-16
Мышиный рекомбинантный M-CSFPeprotech315-02
Стабильные компетентные клеткиNEBiolabsC3040I
10 см Чашки для культуры тканейFisher Scientific353003
Раствор для лизиса клетокQiagen158906
Раствор для осаждения белкаQiagen158910
Раствор для гидратации ДНКQiagen158914
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704
BbSINew England BioLabsR0539S
APEX 2.0x Taq Red Master Mix KitGenessee Scientific42-138
PuromycinFisher ScientificBP2956100
50 мл полипропиленовые конические пробиркиFisher scientific1495949A
15 мл полипропиленовые конические трубкиFisher scientific1495970C

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Method. 10 (10), 957-963 (2013).
  2. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096(2014).
  3. Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
  4. Shi, J., et al. Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nature Biotechnology. 33 (6), 661-667 (2015).
  5. Kuhn, M. W., et al. Targeting Chromatin Regulators Inhibits Leukemogenic Gene Expression in NPM1 Mutant Leukemia. Cancer Discovery. 6 (10), 1166-1181 (2016).
  6. Erb, M. A., et al. Transcription control by the ENL YEATS domain in acute leukaemia. Nature. 543 (7644), 270-274 (2017).
  7. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  8. Brinkman, E. K., et al. Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing. Nucleic Acids Research. 46 (10), 58(2018).
  9. Nguyen, A. T., Zhang, Y. The diverse functions of Dot1 and H3K79 methylation. Genes & Development. 25 (13), 1345-1358 (2011).
  10. Vlaming, H., van Leeuwen, F. The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L. Chromosoma. 125 (4), 593-605 (2016).
  11. Bernt, K. M., et al. MLL-rearranged leukemia is dependent on aberrant H3K79 methylation by DOT1L. Cancer Cell. 20 (1), 66-78 (2011).
  12. Daigle, S. R., et al. Selective killing of mixed lineage leukemia cells by a potent small-molecule DOT1L inhibitor. Cancer Cell. 20 (1), 53-65 (2011).
  13. Jo, S. Y., Granowicz, E. M., Maillard, I., Thomas, D., Hess, J. L. Requirement for Dot1l in murine postnatal hematopoiesis and leukemogenesis by MLL translocation. Blood. 117 (18), 4759-4768 (2011).
  14. Nguyen, A. T., Taranova, O., He, J., Zhang, Y. DOT1L, the H3K79 methyltransferase, is required for MLL-AF9-mediated leukemogenesis. Blood. 117 (25), 6912-6922 (2011).
  15. Zuber, J., et al. Toolkit for evaluating genes required for proliferation and survival using tetracycline-regulated RNAi. Nature Biotechnology. 29 (1), 79-83 (2011).
  16. Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
  17. Li, M. J., Rossi, J. J. Lentivirus transduction of hematopoietic cells. CSH Protocols. 2007, pdb prot4755 (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Flow CytometryCompetition AssayGene KnockoutAML Cell LinesSingle Guide RNALentiviral TransductionBFP Positive CellsFlow Cytometry Analysis

Похожие статьи