Методическая статья

Immunohistopathologic исследование фолиевая кислота рецепторов бета макрофагов и сосудистой иммунной микроокружения в гигантоклеточная артериальный профиля

DOI:

10.3791/58713

⸱

8 февраля 2019 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Penn State University, 2Department of Pathology, Penn State University, 3Penn State College of Medicine, 4Department of Oncology, Wayne State University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол иллюстрирует использование гистопатологические осмотра и иммуногистохимии профиль макрофагов бета рецепторов фолиевой кислоты и ее отношения с общей иммунных клеток проникнуть в биопсии височной артерии в гигантоклеточная артериальный.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гигантоклеточная артериит (ГКА) является хронической болезнью, связанный иммунной опосредованного артерий среднего и большого размера, затрагивает пожилых людей. GCA манифесты с артритом и окклюзионной симптомы головной боли, инсульта или потери зрения. Макрофаги и лимфоциты Т-хелперами проникнуть сосудистой стенки и производят про воспалительной реакции, которые ведут к судну ущерб и ишемии. На сегодняшний день, есть нет ГЦА биомаркеров, который может контролировать болезнь деятельность и руководство лечебных ответ.

Фолиевая кислота рецепторов бета (FRB) является glycosylphosphatidylinositol белок, который является якорь на клеточные мембраны и обычно выражается в линии миеломоноцитная и в большинстве клеток миелоидной лейкемии как опухоли и ревматоидные синовиальной макрофагов, где его выражение коррелирует с тяжести заболевания. FRB возможность привязать фолиевой кислоты соединений, фолиевой кислоты конъюгатов и antifolate наркотиков сделала его druggable цель в рак и воспалительные болезни исследований. В настоящем докладе описываются гистопатологические и иммуногистохимических методов, используемых для оценки выражения и распределение FRB по отношению к GCAimmunopathology.

Формалин исправлена и парафин врезанных височной артерии биопсий ГКА и нормального управления окрашивали гематоксилином и эозином пересмотреть Гистология ткани и определить патогномоничных функции. Иммуногистохимия была использована для выявления FRB, CD68 и CD3 выражение. Микроскопический анализ проводился для количественного определения количество положительно окрашенных клеток на 10 выбранных секций высокой мощности поля и их местоположения в стенке артерий.

Воспаление Lymphohistiocytic (ЛГ) в сопровождении гиперплазия интимы и нарушается упругой пластинки был замечен в ЗКО с ничего не найдено в элементах управления. LH инфильтрат состоит из примерно 60% лимфоцитов и 40% макрофагов. FRB выражение ограничивался макрофагов, состоящий из 31% всего населения CD68 + макрофагов и локализованные для средств массовой информации и адвентиции. Не FRB был замечен в элементах управления.

Этот протокол продемонстрировал шаблон различных численных и пространственной FRB макрофага по отношению к сосудистой иммунной микроокружения в ЗКО.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гигантоклеточная артериит (ВКА) является воспалительным заболеванием средне крупных артерий, ориентация аорты и ее ветвей и затрагивает пожилых людей. Она представляет с умеренной до тяжелой ишемических осложнений, таких как головные боли, боли в челюсти, потеря зрения, инсульта и тканей гангрены. Диагноз подтверждается высоким воспалительные маркеры как скорость оседания эритроцитов (СОЭ) и собственный гистопатологические картины на височной артерии биопсии (вкладка)1. ГКА является наиболее распространенным взрослых васкулит, и доступность височной артерии, полученные для диагностики представляет преимущество над другими специализирующемуся, таким образом позволяя один для изучения его патогенез более легко. Типичные результаты на закладке включают инфильтрата гистиоциты/макрофагов и Т-лимфоцитов, нашли на всех уровнях сосудистой интимы туника, СМИ и адвентиции с параллельной разрушения упругой пластинки, которая обычно отделяет эти 2отсеках. Текущий доказательства свидетельствуют, что ВКА включает неизвестный антиген, который активирует дендритные клетки в адвентиции сосудов, следуют найма помощника клетки T (Th), специально Th1 и Th17 подтипы, которые выделяют интерлейкина-17 и Интерферон гамма (МГС) соответственно. ИФГ затем новобранцев и активирует макрофаги производить цитокинов и протеаз. К ним относятся провоспалительных цитокинов; включая Ил-12, которая взаимно активирует клетки Th1, обеспечивая тем самым положительной обратной связью; фактор некроза опухоли и интерлейкина-6, вызывающие артрит и металлопротеаз и лихорадки, которые повреждают упругой пластинки. Глюкокортикоидов (GC), которые являются стандартной терапии хронической, частично управлять цитокина пути ослабления Th17/Ил-17, но не Th1/IFG руку иммунный ответ3,4. К сожалению прекращение GC приводит к рецидиву болезни. В качестве альтернативного механизма метотрексат был многоцелевых ГЦА лечения, но желаемого клинические конечные точки не были достигнуты последовательно, хотя более чувствительных биомаркеров не были использованы для терапевтического мониторинга5,6 . В 2017 году интерлейкин 6 окон, tocilizumab, был одобрен для лечения вка, как доказано эффективно болезнями и стероидных щадящие эффекты7,8.

На сегодняшний день, есть нет хороших biomarkers для ЗКО. В результате трудно контролировать активность заболевания и титровать дозы доступных препаратов, чтобы избежать неблагоприятных последствий и уменьшить бремя расходов для общества. Таким образом важно, чтобы искать кандидата биомаркеров, что коррелирует с активностью болезни, обеспечивают новые идеи по патогенезу и помощи в терапевтических решений.

Dysregulation активация макрофагов является решающим фактором в патогенезе ЗКО. Таким образом могут быть эффективным средством лечения вка, избирательного отношения к Активированные макрофаги. Фолиевая кислота рецепторов бета (FRB) является glycosyl фосфатидилинозитол гликопротеин, которая зиждется на клеточной мембране в нормальной миеломоноцитная клеток, клеток миелоидной лейкемии и активация макрофагов. Его лиганда, фолиевая кислота, является одним из важнейших витаминов в сокращенной форме, которая позволяет клеточной ДНК синтеза, метилирование и ремонт9. FRB выражение индуцируется в аутоиммунных заболеваний и канцерогенеза. Его выражение ограничен поверхности моноциты или про воспалительных M1 макрофагов в ревматоидный артрит, или противовоспалительные м2 макрофагов в твердые органов и миелоидных злокачественных10,11,12 , 13. в дополнение к своей потенциальной роли в качестве биомаркера активированных макрофагов, FRB можно включить селективного наркотиков транспорта через многоступенчатый процесс, который начинается с привязкой рецепторов фолиевой кислоты, антифолаты или фолиевой кислоты конъюгированных наркотиков в ячейке поверхности, следуют интернализации, выпуска и окончательной доставки желаемого наркотиков внутренних ячейки машин12,14,15,16. В отличие от FRB выражена в раковых клеток и активации макрофагов, FRB, выраженные в нормальные гемопоэтические клетки способны связывать фолатов, обеспечивая тем самым, что FRB/фолиевой кислоты опосредованной лекарств ограничен FRB-положительных воспалительных или раковые клетки.

В нашем предыдущем исследовании мы показали в первый раз, что FRB выражается в ЗКО макрофагов и его выражение коррелирует с CD68 + и эндотелина рецептора бета макрофаги, которые способствуют ГЦА патогенеза17. В настоящем докладе мы описываем гистопатологические и Иммуногистохимические методы используются для оценки FRB макрофагов и анализируется общая лимфоцитов и макрофагов рассчитывает получить представление о FRB позиции в ЗКО сосудистой ландшафт.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все методы, описанные были утверждены Пенн государства институциональных Наблюдательный Совет.

1. гистопатологические подготовка и обработка после получения биопсии височной артерии

Примечание: Биопсии височной артерии (вкладка) проводится под местной анестезией и стерильных условиях сертифицированным хирургом. После хирургическим путем получения артериальной раздел 3 см на более пораженной стороне, образец фиксированной в формалин сразу за 24 ч, разделен на секции 3 до 4 мм и заливали в парафин, уделяя пристальное внимание надлежащему применению ткани в блоке который затем сохраняется при комнатной температуре. Выбор образца производится после проверки медицинских записей. Диагноз основывается на американского колледжа ревматологии 1990 критериев которой требует выполнения темы 3 5 доменов: возраст > 50 лет, Новая головная боль, нежность височной артерии, СОЭ > 50 мм/час Вестергрен методом и Аномальные вкладка. Для обеспечения безопасности, должны носить защитные перчатки во все времена при обработке образцов, химических веществ и антител.

  1. Из встроенных блоков вырежьте 4-5 микрон толщиной разделы, используя микротом. и пятно с гематоксилином и эозином (H & E). Используйте раздел управления отдельных нормальной ткани для обеспечения качества.
  2. Поплавок, сократить разделы на ванну теплой водой нагревается до 40 ° C до удаления морщин и забрать с покрытием стекла микроскопических слайдов.  Место стекла слайды на теплой плите в 60 ° C духовке в течение 60 минут для облегчения сушки и присоединение секции к слайду.
  3. Место стекла слайды на теплой плите в 60 ° C духовке в течение 60 минут для облегчения сушки и присоединение секции к слайду.
  4. Закрепите 3 секции на скольжениях микроскопа.
  5. Место слайды в вертикальной стойке и сухой ночлег за 24 часа при 37 ° C.
  6. Место слайды в контейнер и хранить при 4 ° C.

2. иммуногистохимических подготовка, депарафинизации, антиген извлечения и пятнать15,18,19,20

  1. Загрузить слайды в стойку слайд. Запустить стойки через блюда следующим: дважды в 100% ксилола за 5 минут с 10 секунд нежной агитации каждые 30 секунд, один раз в 100% этанола с 10 секунд агитации, один раз в 90% этанола с 10 секунд агитации, один раз в 70% этанол с перемешиванием 10 секунд , и дважды в двойной дистиллированной H2O с 10 секунд агитации.
    Примечание: Обработка и ацетон, ксилол должно быть сделано в вентилируемых вытяжки избегать вдыхания и дыхательной токсичности.
  2. Извлечь антигена, передачи стойки в стеклянной посуде с 200 мл 10 ммоль/л, pH 6.0 цитрат буфера подогретую до 95 ° C. Установите таймер на 30 минут на водяной бане, а затем охладить при комнатной температуре для 20 минут, затем промыть проточной водой в течение 5 минут.
  3. Удалите активности эндогенной пероксидазы, инкубации в 200 мл 3% перекиси водорода на 10 минут. Вымойте слайды 3 раза в 200 мкл трис буфер солевой раствор (TBSS).
  4. Удалите слайды из стойки и промокните каждого из них аккуратно протрите избыточного буфера. Для окрашивания, добавьте 200 мкл следующих основных антител, добавить обложки скользит на слайдах и проинкубируйте 1 час при комнатной температуре во влажной камере:
    Антитела анти-FRB разбавленный терапевтами
    Моноклональные мыши античеловеческие CD68, разведение 1: 200
    Кролика polyclonal анти CD3 разбавления 1: 100
    Примечание: Формалин Исправлена парафин врезанных секции плаценты были также обрабатываются как указано в шаги 2,1 до 2,9 и инкубируют с анти FRB18 и используется в качестве позитивного элемента управления. Окрашивание результаты были получены путем нахождения оптимального антитела концентрации и была выполнена путем титрования антител в двойной разведений (например, 1:50, 1: 100, 1: 200, 1: 400, терапевтами, 1:1600).
  5. Удалите крышку выскальзования после инкубации и отменить. Промойте слайды 3 раза в течение 2 минут с TBSS, слейте воду и протрите избыточного буфера.
  6. 200 мкл вторичное антитело раствора, содержащего биотинилированным Rabbit/мыши вторичное антитело реагировать с неконъюгированной основное антитело, привязан к ткани антигена. Место coverslips на слайдах и проинкубируйте 45 минут при комнатной температуре во влажной камере.
  7. Удалите крышку выскальзования после инкубации и отменить. Промойте слайды 3 раза по 2 минуты с TBS, слейте воду и протрите избыточного буфера.
  8. Добавить 200 мкл Диаминобензидин (DAB) + субстрат буфера (имидазол HCl)-хромогена системы и инкубировать на 10 минут, чтобы визуализировать пятнать шаблон. Затем промыть TBSS в проточной водопроводной воды за 10 минут.
  9. Изображение с применением окрасок гематоксилин за 3 минуты.
  10. Смонтируйте слайды, применяя 70 мкл средних монтажа на поверхности слайда. Медленно наконечник coverslip на носитель монтажа и избегать создания пузырьков, как вы опустите его на место. Подождите 24 часа для просушки.

3. гистопатологические и иммуногистохимическое (IHC) анализ

Изучите H & E и IHC окрашенных разделы из вка позитивные и обычных предметов с использованием световой микроскоп.

  1. Для H & E окрашенных секций:
    1. Оценки сосудистой архитектуры и выявления эндотелиальных клеток в туника интима, гладкомышечные клетки туника СМИ и фибробластов и свое Васа в адвентиции туника,21,,22.
    2. Идентифицировать ГЦА функций, которые включают лимфоцитов и макрофагов/histiocyte инфильтрации, клеточной гиперплазии и деградации внутренних упругой пластинки.
    3. Анализ lymphohistiocytic инфильтрата путем выявления и количественного определения количества макрофагов относительно лимфоцитов. Оценить степень нарушения внутреннего упругой пластинки и гиперпластические изменения в клетках резидентов и сравнить с элементами управления.
  2. Для IHC окрашенных секций:
    1. Изучить окрашивание шаблон FRB, принимая к сведению его выражения определенного типа или типов клеток и его распределения в рамках сосудистых слоях и ее отношения общей иммунной инфильтрата, маркер всего макрофагов, анти CD68 и Пан лимфоцитов маркер анти CD3.
    2. Определить выражение FRB, CD68 и CD3 клеток путем подсчета положительно окрашенных клеток на 10 несколько полей случайно выбранных высокой мощности (hpf) и запишите средства.
      Примечание: Выявление этих нормальных и патологических клеток и структуры были исполнены патологоанатом сертифицированных сердечно-сосудистой системы (J.M.) и ревматолог (С.А.А) и результаты были записаны для всех случаев.
    3. Захват представитель изображения с помощью цифровой камеры.
      Примечание: После этих шагов оставаясь аликвоты может храниться при температуре-80 ° C.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гистопатологические выводы

H & E пятна в нормальные образцы показали нормальная анатомия артерий с эндотелиальных клеток интимы туника, гладких мышечных клеток в СМИ туника, и разнородные коллагеновой матрицы, которые включают фибробластов и фидерные суда под названием Васа свое в adventitia туника. Существует нет воспалительного инфильтрата определены. GCA позитивные височной артерии продемонстрировал умере...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ГКА является наиболее распространенным васкулит у взрослых, и его патологического hallmark является примером мощное сочетание вспомогательные Т-лимфоцитов и активации макрофагов, которые также могут быть найдены в других гранулематозный заболевания или специализирующемуся как саркоидоз и гранулематозный полиангиит2,3. В ЗКО, височной артерии дает хорошее представление о среднего и большого размера артерии и TA биопсии дает значительные образца, который может хран...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа стала возможной благодаря поддержке д-р Дуглас лестницы, Марианна Klinger, Энн Бенко, Отдел ревматологии/Департамента медицины и молекулярной и гистопатологические Core лаборатории, Пенн государственного университета колледж медицины, Херши PA.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
МикротомReichert-Jung
гладкие и матовые предметные стекла и покровные стекла для микроскопаFisher Scientific 
Вертикальный стеллажFisher Scientific 
Световой микроскопOlympus BX60  микроскоп
Ксилол
Ацетон в дистиллированной водеконцентрации 100%, 90%, 70%
Трис-буферный солевой раствор (ТБС)Dako Wash BufferS3006
3% перекись водорода в TBS
Диаминобензидин (DAB)Sigma Fast Tablet набор
Chemical Permount  Монтаж среднего FisherScientific SP-15-100
Harleco Gill's III ГематоксилинFiisher Scientific 23-750-019
Harleco Eosin Y 1% алкогольный исходный растворFisher Scientific 23-749-977
10 мМ моногидрат лимонной кислоты (pH 6,0)
Поликлональный кроличий антифолатный рецептор бета Манохар Ратнамоптимизирован в масштабе 1:800
Моноклональная мышиная античеловеческая CD68Dako M071801оптимизировано в соотношении 1:200
Поликлональное анти-CD3кролика Agilent DakoA0452оптимизировано в соотношении 1:100
Полимерное козье вторичное антитело против кролика/мышиDako
Плацентарная ткань  для положительного контроля FRB

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Klippel, J. H., Stone, J. H., White, P. H. Primer on the rheumatic diseases. , Springer Science & Business Media. (2008).
  2. Weyand, C. M., Goronzy, J. J. Immune mechanisms in medium and large-vessel vasculitis. Nature Reviews Rheumatol. 9 (12), 731-740 (2013).
  3. Weyand, C. M., Liao, Y. J., Goronzy, J. J. The immunopathology of giant cell arteritis: diagnostic and therapeutic implications. Journal of Neuro-ophthalmology. 32 (3), 259-265 (2012).
  4. Deng, J., Younge, B., Olshen, R., Goronzy, J., Weyand, C. Th17 and Th1 T-cell responses in giant cell arteritis. Circulation. 121, 906-915 (2010).
  5. Mahr, A. D., et al. Adjunctive methotrexate for treatment of giant cell arteritis: an individual patient data meta-analysis. Arthritis & Rheumatology. 56 (8), 2789-2797 (2007).
  6. Hoffman, G. S., et al. A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled trial of adjuvant methotrexate treatment for giant cell arteritis. Arthritis & Rheumatology. 46 (5), 1309-1318 (2002).
  7. Stone, J. H., Klearman, M., Collinson, N. Trial of Tocilizumab in Giant-Cell Arteritis. New England Journal of Medicine. 377 (15), 1494-1495 (2017).
  8. Milman, N. Tocilizumab increased sustained glucocorticoid-free remission from giant cell arteritis. Annals of Internal Medicine. 167 (12), JC63(2017).
  9. Xia, W., et al. A functional folate receptor is induced during macrophage activation and can be used to target drugs to activated macrophages. Blood. 113 (2), 438-446 (2009).
  10. Shen, J., et al. Folate receptor-beta constitutes a marker for human proinflammatory monocytes. Journal of Leukocyte Biology. 96 (4), 563-570 (2014).
  11. Salazar, M. D., Ratnam, M. The folate receptor: what does it promise in tissue-targeted therapeutics. Cancer and Metastasis Reviews. 26 (1), 141-152 (2007).
  12. Low, P. S., Henne, W. A., Doorneweerd, D. D. Discovery and development of folic-acid-based receptor targeting for imaging and therapy of cancer and inflammatory diseases. Accounts of Chemical Research. 41 (1), 120-129 (2008).
  13. Puig-Kroger, A., et al. Folate receptor beta is expressed by tumor-associated macrophages and constitutes a marker for M2 anti-inflammatory/regulatory macrophages. Cancer Research. 69 (24), 9395-9403 (2009).
  14. Nakashima-Matsushita, N., et al. Selective expression of folate receptor beta and its possible role in methotrexate transport in synovial macrophages from patients with rheumatoid arthritis. Arthritis & Rheumatology. 42 (8), 1609-1616 (1999).
  15. vander Heijden, J. W., et al. Folate receptor beta as a potential delivery route for novel folate antagonists to macrophages in the synovial tissue of rheumatoid arthritis patients. Arthritis & Rheumatology. 60 (1), 12-21 (2009).
  16. Jansen, G., Peters, G. J. Novel insights in folate receptors and transporters: implications for disease and treatment of immune diseases and cancer. Pteridines. 26 (2), 41-53 (2015).
  17. Albano-Aluquin, S., Malysz, J., Aluquin, V. R., Ratnam, M., Olsen, N. An immunohistochemical analysis of folate receptor beta expression and distribution in giant cell arteritis - a pilot study. American Journal of Clinical and Experimental Immunology. 6 (6), 107-114 (2017).
  18. Ross, J. F., Chaudhuri, P. K., Ratnam, M. Differential regulation of folate receptor isoforms in normal and malignant tissues in vivo and in established cell lines. Physiologic and clinical implications. Cancer. 73 (9), 2432-2443 (1994).
  19. Reiner, N. E. Methods in molecular biology. Macrophages and dendritic cells. Methods and protocols. Preface. Methods in Molecular Biology. 531, v-vi (2009).
  20. Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BMC Cell Biology. 9, 13(2008).
  21. Pawlina, W. Histology: A text and atlas with correlated cell and molecular biology. , Walters Kluwer. (2016).
  22. Kumar, V., Abbas, A., Robbins Aster, J. Robbins and Cotran pathologic basis of disease. , Elsevier Saunders. (2015).
  23. Dabbs, D. J. Diagnostic immunohistochemistry. , Elsevier, Inc. (2019).
  24. Ross, J. F., et al. Folate receptor type beta is a neutrophilic lineage marker and is differentially expressed in myeloid leukemia. Cancer. 85 (2), 348-357 (1999).
  25. Holzapfel, G. A. Collagen in arterial walls: biomechanical aspects. Collagen. Structure and Mechanics. Fratzl, P. , Springer-Verlag. Heidelberg. 285-324 (2008).
  26. Sultan, H., Smith, S. V., Lee, A. G., Chevez-Barrios, P. Pathologic Markers Determining Prognosis in Patients with Treated or Healing Giant Cell Arteritis. American Journal of Ophthalmology. , (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CD68CD3DAB

Похожие статьи