Количественные Immunoblotting клеточных линий как стандарт для проверки иммунофлюоресценции для количественной оценки биомаркер белков в образцах тканей рутинной

Alison M. Moore; Lee R. Boudreau; Shakeel Virk; David P. LeBrun

doi:10.3791/58735

Методическая статья

Количественные Immunoblotting клеточных линий как стандарт для проверки иммунофлюоресценции для количественной оценки биомаркер белков в образцах тканей рутинной

DOI:

10.3791/58735

⸱

7 января 2019 г.

Alison M. Moore¹^,² , Lee R. Boudreau³ , Shakeel Virk³ , David P. LeBrun¹^,²

¹Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University, ²Division of Cancer Biology and Genetics, Queen's Cancer Research Institute, ³Queen's Laboratory for Molecular Pathology, Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описывают использование количественных immunoblotting для проверки иммунофлюоресценции гистологии, наряду с анализом изображений как средства количественного протеин интереса в образцах тканей формалином исправлена, парафин врезанных (FFPE). Наши результаты показывают полезность гистология иммунофлюоресценции для выяснения относительное количество белков биомаркеров в обычной биопсии образцы.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Количественная оценка протеинов интереса в образцах тканей формалином исправлена, парафин врезанных (FFPE) имеет важное значение в клинических и научно-исследовательских приложениях. Оптимальный метод количественной оценки является точным, имеет широкий динамический диапазон линейных и поддерживает структурную целостность образца для идентификации типов отдельных клеток. Нынешние методы иммуногистохимии (IHC), масс-спектрометрии и immunoblotting друг не соответствуют эти положения ввиду их категорического характера или необходимо гомогенизировать образца. В качестве альтернативного метода мы предлагаем использование иммунофлюоресценции (КРП) и анализа изображений для определения относительного изобилия протеин интереса в FFPE тканях. Здесь мы продемонстрировать, что этот метод легко оптимизируется, дает широкий динамический диапазон и линейно количественному сравнению с золотой стандарт количественных immunoblotting. Кроме того этот метод разрешает сохранение структурной целостности образца и позволяет для разграничения различных типов клеток, которые могут иметь решающее значение в диагностические приложения. В целом это надежный метод для количественной оценки относительной белков в FFPE образцах и может быть легко адаптирована с учетом клинических или исследовательских потребностей.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Во многих клинических областях существует необходимость для количественного определения белков в формалин исправлена, парафин врезанных образцах биопсии тканей (FFPE). Например количественная оценка биомаркер белков в обычной биопсии образцов используется прогноз и информировать лечения для рака пациентов¹. Однако текущие методы обычно субъективные и отсутствие проверки.

Иммуногистохимия (IHC) обычно используется в лаборатории патологии и обычно зависит от основного антитела, направленные против целевого белка и вторичное антитело проспряганное с ферментативной метки например пероксидазы хрена²

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Разрешение на использование образцов первичной человеческой ткани был получен от медицинских наук и связанные учебных больницах исследований этики Совет (HSREB) в Университете королевы.

1. Строительство линии клетки Microarray ткани (TMA)

Урожай и вымыть клетки.
Примечание: Этот протокол был протестирован на различных установленных увековечен клеточных линий (например HeLa, Jurkat, РЦГ-ACV).
1. Для адэрентных клеток урожай примерно 1.3 x 10⁷ клетки, как только они достигают примерно 80% confluency. Отсоедините клеток с использованием реагентов для этой линии клеток.
  Примечание: Этилендиаминтетрауксус....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол был использован для подтверждения если способность определить относительное количество анти apoptotic белка Bcl-2 в клеточных линиях в FFPE блоков ткани. Количественного определения Bcl-2 выборочно в раковых клетках можно выяснить онкогенных механизмы и может быть полезным в диагностике патологических и в информировании клинического управления решения²⁴. Говоря более конкретно Bcl-2 играет роль в развитии надлежащего лимфоцитов и его выражение обычно .......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описали метод который использует количественных immunoblotting (IB) для демонстрации полезности иммунофлюоресценции (IF) для выяснения относительное обилие целевого белка в FFPE образцах тканей. Текущие методы количественной оценки белка ограничены их категорического характера, например хромогенных IHC²^,³, или необходимостью однородности выборок, предотвращая расследование образец структуры и клеток населения, такие как с IB и масс-спектрометрии

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа частично финансируется Фредерик Banting и Чарльз Лучшие Канада выпускников стипендии (а.м.).

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
697	DSMZ	ACC 42	Клеточная линия
JeKo-1	ATCC	CRL-3006	Клеточная линия
Jurkat	ATCC	TIB-152	Клеточная линия
RCH-ACV	DSMZ	ACC 548	Клеточная линия
Granta-519	DSMZ	ACC 342	Клеточная линия
REH	DSMZ	ACC 22	Клеточная линия
Raji	ATCC	CCL-86	Клеточная линия
HeLa	ATCC	CCL-2	Клеточная линия
Trypsin/EDTA раствор	Invitrogen	R001100	Для отделения адгезивных клеток
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	Wisent Inc.	81150	Для нейтрализации трипсина
Нейтральный буферизованный формалин	Протокол	245-684	Для фиксации клеточных гранул
UltraPure с низкой температурой плавления	Invitrogen	15517-022	Для литья клеточных гранул
Мышиное моноклональное антитело против человека Bcl-2, клон 124	Dako (Agilent)	cat#: M088729-2, RRID: 2064429	Для обнаружения Bcl-2 с помощью иммунофлуоренции и иммуноблоттинга (lot#: 00095786
Ventana Discovery XT		Roche-Для	автоматизации иммунофлуоресцентного окрашивания
EnVision+ System- HRP меченый полимер (против мышей)	Dako (Agilent)	K4000	Для усиления иммунофлуоресцентного сигнала
EnVision+ System- HRP меченый полимер (против кроликов)	Dako (Agilent)	K4002	Для иммунофлуоресцентного усиления сигнала
Cyanine 5 реактив тирамид	Perkin Elmer	NEL745001KT	Для усиления сигнала иммунофлуоресценции
Aperio ImageScope	Leica Biosystems-Для		просмотра отсканированных слайдов
программное обеспечение для анализа изображений HALO	Indica Labs-Для		количественного определения ингибиторов иммунофлуоресценции
протеазы (коктейль ингибиторов протеазы Halt, 100X)	Thermo Scientific	1862209	Добавить в RIPA буфер
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)	BioShop	EDT001	Для RIPA буфер
NP-40	BDH Limited	56009	Для RIPA буфер
Дезоксихолат натрия	Sigma-Aldrich	D6750	Для RIPA буфер
Глицерин	FisherBiotech	BP229	Для Лемлли буфер
Бромофенол синий	BioShop	BRO777	Для буфера Laemlli
Dithiothreitol (DTT)	Bio-Rad	161-0611	Для буфера Laemlli
Бычий сывороточный альбумин (BSA)	BioShop	ALB001	Для иммуноблоттинговых промываний
Белковая лестница (Precision Plus Protein Dual Color Standards)	Bio-Rad	161-0374	Для бегового протеинового геля
Фильтровальная бумага (Extra Thick Blot Paper)	Bio-Rad	1703969	Для блоттинга перенос
Нитроцеллюлозная мембрана	Bio-Rad	162-0115	Для блоттингового переноса
Trans-blot SD полусухая ячейка	Bio-Rad	1703940	Для полусухого переноса
сухого обезжиренного молока (обезжиренное сухое молоко)	Технология клеточной сигнализации	9999S	Для блокирующего буфера
Tween 20	BioShop	TWN510	Для буфера промывки
GAPDH кролик моноклональное антитело	Epitomics	2251-1	Первичное антитело контрольного белка (лот#: YE101901C)
Козье антитело против мыши IgG (HRP конъюгированное) антитело	abcam	cat#: ab6789, RRID: AB_955439	Вторичное антитело для иммуноблота
Козье антикроличьи IgG (HRP конъюгированное) антитело	abcam	cat#: ab6721, RRID: AB_955447	Вторичное антитело для иммуноблоттинга (лот#: GR3192725-5)
Clarity Western Субстраты ECL	Bio-Rad	1705060	Для детектирования сигнала иммуноблоттинга
Amersham Imager 600	GE Здравоохранение Медико-биологические науки	29083461	Для детектирования сигнала иммуноблота
Программное обеспечение ImageJ	Freeware, NIH-Для		денситометрического анализа

для переноса

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Khoury, J. D., et al. Validation of Immunohistochemical Assays for Integral Biomarkers in the NCI-MATCH EAY131 Clinical Trial. Clinical Cancer Research. 24 (3), 521-531 (2018).
Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G. L., da Silva Pinhal, M. A.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Количественные Immunoblotting клеточных линий как стандарт для проверки иммунофлюоресценции для количественной оценки биомаркер белков в образцах тканей рутинной

В этой статье

Краткое содержание

Аннотация

Введение

Протокол

Результаты

Обсуждение

Раскрытие информации

Благодарности

Материалы

Ссылки

Перепечатки и разрешения

Теги

Похожие статьи