Создание толстой кишки анастомоз мышей

Краткое содержание

Анастомоза утечки или разбивка после операции является одной из основных причин послеоперационной заболеваемости и смертности. Наши операции для создания толстой кишки анастомоз — надежных и воспроизводимых метод для изучения лечебных механизмов анастомозов.

Аннотация

Кишечных анастомозов обычно выполняются как факультативные, так и возникающих операций. Тем не менее анастомоза утечки являются очень боялись осложнения операций на ободочной кишки и может произойти в до 26% хирургических анастомозов, с смертности до 39% для пациентов с такой утечки. В настоящее время остается нехватка данных, детализируя клеточных механизмов анастомоза исцеления. Разработка превентивных стратегий и методов лечения для анастомоза утечки может значительно потенцированные по более глубокому пониманию соответствующих анастомоза исцеления.

Мышиных модель идеально, как предыдущие исследования показали, что мышиных анастомоза является наиболее клинически похож на человеческий случай по сравнению с другими животных моделей. Мы предлагаем легко воспроизводимые мышиных модель толстой анастомоза у мышей, которые позволят для дальнейшей иллюстрации анастомоза исцеления.

Введение

Весьма опасным осложнением хирургических анастомозов кишечника является анастомоза пробоя или утечки. Анастомоза утечки, которая вызывает разлива внутрипросветная содержимого в брюшную полость, угрожающих жизни и может быстро привести к внутрибрюшной сепсис; шок ставки варьируются от 0,3% до 5,5%, после тонкого кишечника анастомозов и подняться до 0,5% и 26% для кишечных анастомозов^1,2. Смертности после утечки может быть выше, чем 39% из-за быстрого наступления сепсиса и быстрой прогрессии к смерти внутрибрюшное загрязнения³. Превентивные стратегии и методов лечения в настоящее время основаны на Патофизиология, что не вполне понятно.

В настоящее время анастомоза исцеление часто сравнивают с более широко изучены кожный заживление ран, которая оказалась сравнительно бедных факсимиле. В серии перекрывающихся этапов, начиная с этапа первоначального ЛАГ происходит исцеление. Во время дней 0-4 после создания кишечного анастомоза запаздывание фазы определяется острой воспалительной реакции, которая очищает рану сотовой мусора. Далее через дня 3-4, фибробластический распространение и производство коллагена является типичным fibrophasia фазы. Наконец после 10 день, длительного периода коллагена Ремоделирование известен как на этапе созревания. Важно, что анастомоза сила является довольно низким и зависит от внешней поддержки хирургически размещены скобы или шовные пока Коллаген является хранение⁴. Понимание роли и времени каждого слоя стенок кишечника играет анастомоза заживление ран и участия в типах воспалительных опосредованной клеток как макрофаги, а также разъяснения суррогатных маркеров предсказать анастомоза провал или успех может значительно снизить заболеваемость, смертность и медицинских расходов после двоеточия операций⁵.

Чтобы быть полезным в имитируя человека анастомоза⁶в предыдущих исследованиях было показано мышиных модель. Хотя есть популярные, проверенные и хорошо изучены примеры мышиных толстой анастомоза модели, особенно с методом, описанным в Комен et al. Эти модели ⁷, в пользу илеоцекальной или возрастания colocolonic анастомоза методы⁸. Предыдущие исследования человека пациентов продемонстрировали значительную разницу в показателях утечки между илеоцекальной, colocolonic и прямой кишки анастомозов, подчеркнув необходимость дальнейших экспериментальных моделей на различных анатомических местах. Дополнительные, широко используемые методы направлены на разработку модели, которая намеренно создает анастомоза утечки вместо прояснения клеточных механизмов, необходимых для нормального анастомоза ранозаживляющее⁹. Крыса модели пытались в прошлом, но темпы анастомоза зияние и/или признаки утечки (например, формирование абсцесса) значительно ниже, чем людей и мышей^6,7. Кроме того более генетически модифицированные экспериментальные линии доступны в мышей, чем крысы. Это делает модель крыса менее полезными для анастомоза модели. Кроме того свиней и собак модели имели менее клиническое исследование чем мышиных модель^6,7.

Мы предлагаем безопасный, технически простых и быстро и легко воспроизводимые процедуры для создания кишечных анастомозов в мышиных модели, который должен облегчить дальнейшее расследование занижены механизм исцеления^{анастомоза рану 10} .

Протокол

Следующий протокол был одобрен Оклахомский университет наук Центр институциональных животных здравоохранения и использовать Комитет (IACUC) и соблюдает все институциональные этические руководящие принципы, касающиеся использования исследований животных. Кроме того все эксперименты были проведены в соответствии с институциональной, государственных и федеральных правил, касающихся экспериментальных исследований на животных.

Примечание: Для этого протокола, мы использовали мужского и женского congenic разводят в C57BL6/J мышей в 12 до 72 недель возраста. Все мыши, используемые для этой процедуры хранились в нашем учреждении-барьер для по крайней мере за одну неделю до операции адаптироваться к местным биома. Животных было позволено кормить до время операции, и мы использовали подготовку устных механические кишечника ни ректальной промывка до процедуры.

1) создание анастомозов

1. Автоклав хирургических инструментов, теплый раствор солевой орошения и тщательно очистить все постановляющей части поверхности с 70% этиловом спирте.
2. Чтобы побудить анестезии, поместите курсор мыши в поле индукции, который подключен к испарителем. Доставить изофлюрановая 2-3% в 1-2 Л/мин до тех пор, пока седативные мышей.
3. Поместите животное на потепление устройства, например, грелки, для профилактики гипотермии.
4. Подкожно вводить одно время доза 0,1 мг/кг бупренорфин (3 мкг для мыши 30 g) для послеоперационного обезболивания и один раз в дозе 10 мг/кг Энрофлоксацин для предоперационной антибиотикотерапия.
   Примечание: Хотя пред- и послеоперационном периоде антибиотики не требуются для этой операции, институциональных руководящих принципов и животное уход и использовать Комитет в наше учреждение, рекомендуется их использовать в нашем учреждении.
5. Место цистит носовой конус вокруг мыши мордой. На протяжении всей операции тщательно отслеживать частота дыхания животных и отрегулировать скорость потока анестезии при необходимости. Поддержание дыхания на 30-40 вдохов в минуту.
6. Используйте машинку для стрижки волос, следуют агента для удаления волос для удаления волос с поверхности всей кожи живота. Тщательно удалите агент для депиляции с марлей, смоченные водой или 70% этанола. Тщательно высушите животного.
7. До prepping живота, лента мыши конечностей грелку или постановляющей части поверхности в конце каждой ноги, чтобы предотвратить смещение во время операции мыши. Продезинфицируйте живота с хлоргексидином. Включать всю область бритая, а также волосы на краев области побрился. Место стерильным драпировка над мыши (рис. 1A).
   1. До драпировки, нарежьте небольшие овальные или прямоугольные окна драпировка подвергать prepped живота.
      Примечание: Окно должен предоставлять весь живот мыши, но охватывают конечностей, хвост, голова и грудь. Мы прорубил окно² 4 x 3 см для наших операций (рис. 1B).
   2. Сделайте небольшой разрез вдоль средней линии пелерина, от нижнего края к овальные или прямоугольные окна, чтобы разрешить доступ к прямой кишки во время процедуры (рис. 1 c).
8. Сделайте разрез кожи. Начните вдоль средней линии нижней части живота и надрезать кожу с ножницы вертикально на Мечевидный. Надрезать только кожу и избежать сокращения мышц брюшной стенки (рис. 2A).
9. Возьмите midline брюшной стенки с щипцами и выньте от содержимого брюшной полости. Уход не травмировать внутрибрюшное структур, вертикально надрезать длина средней линии живота фасции с острыми ножницами. Увеличить длину Кожный разрез (рис. 2B).
10. Когда кишечник подвергаются, найдите слепой кишки и тонкого кишечника и вращать левосторонней внутренностей медиально подвергать спуск и сигмовидной кишки. Слой тупым насадка с смазочных желе и тщательно заранее зонд в прямую кишку, чтобы помочь в идентификации спуск/сигмовидной кишки (рис. 3).
    Примечание: В отличие от людей, слепой кишки мыши обычно находится в левом верхнем квадранте живота. Будьте осторожны, не перфорации кишечника стены с зонд в этом шаге. Если перфорированные кишечника стены, прекратить процедуру и усыпить мыши.
    1. Избегайте, схватив слепой кишки с зубчатыми или острые щипцы. Вместо этого используйте корнцанг атравматической, хлопок наконечником аппликатором, или мягкий палец манипуляции поворота внутренностей.
    2. Использование утепленные стерильного физиологического раствора чтобы убедиться, что подвергается кишечника хранится влажной на протяжении всей процедуры.
    3. Двоеточием будет на левой стороне срединной и придает retroperitoneum через брыжейка. После идентификации снять тупым зонд частично для облегчения colotomy.
11. Выполняйте поперечной colotomy сигмовидной кишки.
    1. Нежно обхвати сигмовидной кишки, превосходит тазовых входе с атравматической щипцами (рис. 4A).
    2. С помощью микро ножницами, сделайте разрез через сигмовидная кишка перпендикулярно направлению толстой кишки и простирающихся на 80-90% ширины толстой кишки. Это поможет предотвратить втягивание один конец кишки из операционного поля и облегчения ремонта (рис. 4В).
    3. Если в ходе висцеральных вращение или colotomy ранен брыжеечных сосудов, аккуратно прижмите давление до 2 мин с марлей или ватным наконечником аппликатором. Если кровотечение продолжается после этого времени, место цифра восемь 8-0 леска швом вокруг точки кровотечения.
       Примечание: Если кишечника показывает признаки некроза или травмы после этого, прекратить процедуру и усыпить мыши, используя гуманный метод, одобренный Комитетом институциональных использования животных.
12. Ремонт сигмовидной кишки colotomy.
    1. Использование драйвера иглы Кастровьехо, место 5-6 простых Прерванный 8-0 nonabsorbable полипропиленовые швы для ремонта колостомы. Место швы 1 мм друг от друга с укусами 0,5 мм.
       1. Позаботьтесь, чтобы избежать прокатки края кишечника в ремонт, взяв немного больше serosa чем слизистая оболочка с каждой строчки. Оставьте хвосты длиной 5 мм. Будьте осторожны не случайно поймать окружающие кишечника в шов (рис. 4 c).
          Примечание: Это полезно начать наложение швов на вблизи верхней брыжеечной границы colotomy, сохранение mesenteric-большая часть colotomy для последнего.
       2. По ходу ремонта, заранее транс анальный зонд Блант накренилась рассечение занимаемых ремонта, прежде чем окончательный швы помещены. Это поможет предотвратить слишком узким ремонт и снижении ставок стриктуры анастомоза.
13. С помощью 10 мл шприц, заполнены с утепленным физраствора, орошают живот несколько раз. Если поверхность под мышь становится мокрой, сухой мыши или переместите мышь на сухую поверхность во избежание гипотермии.
    1. Используйте стерильные марлевые помещен над разрез понежиться избыточного полива.
    2. В заключительном орошения заполните живот стерильного физиологического раствора. Тщательно заранее смазкой angiocatheter 18 G в анальное отверстие и надуть с 0,5-1 см³ воздуха. Это продемонстрирует любой утечки в анастомоза, чем могут быть отремонтированы с другой Прерванный полипропиленовые швом, используя стерильный зонд занимаемых анастомоза.
    3. Выкачать толстой кишки с использованием angiocatheter до удаления.
14. Убедитесь, что существует не носовое кровотечение. Если есть, мягкое давление непосредственно на точку кровотечения для 1-2 мин место гемостатических швов, как описано выше, если кровотечение продолжается.
15. Осторожно верните нормальное анатомическое положение (Рисунок 5A) medialized внутренностей.
16. Закройте брюшной разрез (Рисунок 5B).
    1. Использование 4-0 рассасывающиеся швы плетеные, место работает шовные вдоль мышечный слой начиная в верхней части разреза и заканчивая в нижней аспект разрез брюшной стенки. Установите галстук и сократить шов, оставив 5 мм хвосты.
       Примечание: Не случайно включить intestine в закрытия брюшной стенки.
    2. Повторите с 4-0 леска швом чтобы закрыть кожи (рис. 5 c).
17. Убедитесь, что весь животное тепло и сухо, для предотвращения послеоперационного гипотермии.
18. Внимательно следить за животное, как он восстанавливается от анестезии. Администрировать бупренорфин 0,1 мг/кг каждые 72 ч 2-3 дня после процедуры для контроля боли.  Во время периода восстановления ежедневно признаков абсцесса или перитонеальный сепсис следует тщательно изучить мышей.  Послеоперационное наблюдение за боль и страдания должны включать в себя: ограничение свободы передвижения, включая скрючившись тип осанки, отсутсвие еды или питья, не надлежащий уход, чрезмерное воспаление вокруг раны, отсутствие нормального заживления в месте разреза, или не нормальный вложенности.  Любое животное, демонстрируя любой из этих поведений должны быть немедленно euthanized CO₂ удушение минимум 10 мин, последовали двусторонние торакотомии.
19. Смесь 0,1 мг/мл энрофлоксацина мыши питьевой водой для 7 дней после операции для предотвращения внутрибрюшного инфекции или сепсиса вследствие фекального загрязнения, связанного с операцией.

2) заготовка анастомоза ткани

1. Как раз перед иссечения анастомоза ткани, усыпить мыши, используя гуманный метод, одобренный Комитетом институциональных использования животных.
   Примечание: На основе институциональной политики, мы усыпить наших животных, помещая их в камеру углекислого газа с 100% двуокиси углерода газа настойка 2 Л/мин за 5 мин до выполнения двусторонних торакотомии.
2. Стерилизуйте живота с хлоргексидином, следуют на 70% спирте.
3. Повторно надрезать оригинальный срединной линии разреза с острыми ножницами. Начало в нижний полюс предыдущего разреза и расширить этот отрезок главно к мечевидный (рис. 6A).
4. Ножницами, вырезать в мышечный слой и после ввода перитонеального пространства, расширить разрез в верхней и нижней части разреза. Позаботьтесь, чтобы избежать ранения кишечника при въезде в живот или нарушая анастомоза, как там может быть что кишечника придерживаться разрез или анастомоза сайта.
5. Тщательно выполните левый медиальной висцеральных вращение, подвергая отремонтированы сигмовидная кишка (Рисунок 6B). Скорее всего будет спайки кишечника для кишечника, окружающих ремонта. Нежно и тупо препарировать эти спайки от места ремонта. Проявлять большую осторожность, чтобы не нарушить анастомоза.
   1. Определение сайта ремонт, найдя хвосты полипропиленовые швов, используемых для ремонта. С помощью ножниц и начиная 1 см проксимальнее ремонт, поперек разрез через нисходящей ободочной кишки. Повторите этот шаг 1 см дистальной сайт анастомоза.
6. Удаление сегмента сигмоид, резко рассекая двоеточие прилагаемый брыжейка вдоль задней границы толстой кишки с тонкой ножницы (рис. 7).
7. Идентифицировать брыжеечных границы образца Колон и использование тонкой ножницы для резки по длине верхней брыжеечной границы в продольные моды. Это создаст квадратную или прямоугольную часть толстой кишки из цилиндрических образцов удалены ранее (Рисунок 8).
8. Используйте перо маркировки для демаркации границы анти брыжеечных толстой кишки до удаления толстой сегмента. После удаления сделайте продольной резки по длине кишки напротив маркировки. Исправить, внедрить и разрезать образец ткани, необходимые для гистологии и/или иммуноокрашивания.

Результаты

7 дней после операции должны хорошо исцелил анастомоза. Анастомоз могут быть собраны в моменты времени до и после 7 дней, чтобы лучше проиллюстрировать на этапах анастомоза исцеления. На рисунке 9, гистологический анализ показывает фиброзный (коллаген визуализированы пятнать trichrome) ответ при посредничестве миофибробласты позитивных альфа актина гладких мышц. Однако мы обнаружили, что результаты гистологического анализа различаются мышей, специально степен...

Обсуждение

Есть несколько основных шагов для обеспечения успеха и свести к минимуму заболеваемости/смертности, связанные с этой процедурой. Во-первых обеспечение тщательного регулировать кишечную ткани и заботиться, чтобы предотвратить травмы тяги при вращении внутренностей подвергать толстой кишки. Чрезмерное напряжение на кишечника или брыжейка можно травмы кишечника или сосудистую и причиной некроз кишечника от сайт анастомоза. Кроме того острые щипцы или щипцы с зубами не должен использоваться для обработки кишечника.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
C57BL6/J мыши	Jackson Labs	#00664
Впитывающие пеленки Fisherbrand, 20" x 24"	Fisher Scientific	14-206-62
Полилинированное стерильное поле, 18" x 24"	Одноразовые материалы для больницы Busse	696	Вырежьте прямоугольное отверстие
Изотезия изофлурана	Генри Шейна	50033
Fisherbrand Стерильный ватный марлевый диск, 4 дюйма x 4 дюйма	Fisher Scientific	22-415-469
Офтальмологическая мазь Puralube petrolatum, туба 1/8 унции	Dechra Veterinary Products	NDC 17033-211-38
Крем для депиляции	Nair Church & Дуайт Ко.	22339-05
Buprenex бупренорфин  0,3 мг/мл	Reckitt Benckiser Pharma Inc	NDC 12496-0757-5
1 мл инсулиновый шприц, 27  G	Becton Dickinson	329412
Chloraprep Шампунь	Medline	APL82287
Webcol спиртовые тампоны для подготовки	Covidien	6818
BioGel PI хирургические перчатки	Mö lnlycke Health Care	ALA42675Z
Микрощипцы с зубами	Roboz	RS-5150
Тонкие ножницы - острые	Fine Science Tools	14060-09
Прямые зубчатые щипцы	Fine Science Tools	11050-10
Игломер Castro-Viejo	Fine Science Tools	12565-14
0,9% Sodium Chloride Irrigation	Baxter	BHL2F7121	теплый до 37 градусов; C перед применением
шприц 10 мл	Becton Dickinson	309604
4-0 Vicryl рассасывающийся плетеный шовный материал, 18", PS-2 игла	Henry Schein
Синий шовный материал из мононити 24" Игла BV-1	Henry Schein	8305H	Обычно поставляется с двумя ружьями. Разрежьте шов на полпути, чтобы получить два пригодных для использования шва.
Микроножницы Cole-Parmer, стандартная марка, прямые, 4".	Cole- Parmer	EW-10818-06
Medline Стерильное смазывающее желе	Medline	MDS032273H

6546037