Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Извлечение и анализ тайваньского зеленый прополиса

8.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58743

⸱

7 января 2019 г.

 ,  ,  , 
1Department of Biotechnology and Animal Science, National Ilan University

В этой статье

Краткое содержание

Мы представляем протокол для использования этанола в качестве растворителя для извлечения и характеризуют Тайваньская зеленый прополис обладает антибактериальной активностью.

Аннотация

Тайваньская зеленый Прополис богат prenylated флавоноиды и экспонаты широкий спектр биологических мероприятий, таких как антиоксидант, антибактериальные и противораковых те. Биоактивных соединений Тайваньская зеленый прополиса являются propolins, а именно C, D, F и G. Концентрация propolins в тайваньской зеленый Прополис варьируется в зависимости от сезона и географического расположения. Таким образом крайне важно для установления стандартной процедуры для определения качества Тайваньская зеленый прополиса. Здесь мы представляем протокол, использующий добычи на основе этанола, высокой производительности жидкостной хроматографии и анализ антибактериальной активности для характеристики качества Тайваньская зеленый прополис. Этот метод показывает, что 95% и 99,5% этанола извлечений добиться максимальной сухого вещества урожайности от тайваньской зеленый прополис, тем самым давая самые высокие концентрации propolins, имеют антибактериальные свойства. Согласно этим выводам настоящий Протокол считается надежные и повторяемые для определения качества Тайваньская зеленый прополиса.

Введение

Прополис представляет собой естественный смолистый смесь, производимые виды пчела Apis mellifera. Прополис широко использовался с древних времен в народных лекарственных средств. Исследования недавно сообщили, что прополис является полезным для предотвращения микробной инфекции и воспаления1. Многочисленные исследования показали, что основными биологически активных соединений в прополис являются флавоноиды, фенольные кислоты эфиры, prenylated p-кумариновая кислоты и diterpenic кислоты2,3. На сегодняшний день, были определены 10 prenylated флаванонов производные от тайваньской зеленый Прополис через высокой производительности жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)4,5,6,7. Наиболее распространенными среди них являются propolins C, D, F и G5,7. Значительные биологические эффекты Тайваньская зеленый Прополис коррелируют с его высоким содержанием propolins8.

Концентрации биологически активных соединений в прополис различаются в зависимости от сезона и географического расположения, из которого получается прополиса. Европейский Прополис содержит главным образом флавоноид aglycone и фенольные кислоты9. Основными биологически активных соединений в прополис из Бразилии, prenylated p-кумариновая кислоты, такие как artepillin C10. Исследование показало, что сезон является критическим фактором для определения содержания всего propolin в тайваньской зеленый Прополис11. Содержание propolin в тайваньской зеленый Прополис является высоким в летнее время (Май - Июль) и низких в зима11. Антибактериальные свойства прополиса было широко считается показателем биологической активности. Как правило образцы прополис, собранных из различных регионов продемонстрировали аналогичные антибактериальные свойства; Например он обычно эффективен в отношении почти всех грамотрицательных бактерий и выставок ограниченное антибактериальный эффект против грамотрицательных бактерий10,12,13. Чтобы иметь антибактериальный эффект14были продемонстрированы синергического взаимодействия между флавоноиды в прополис. Аналогичным образом Тайваньская зеленый прополисом было сообщено иметь Антимикробный эффект против грамположительных бактерий15. Кроме того исследование также выявило Антимикробный эффект от взаимодействия propolins в тайваньской зеленый Прополис8.

Характеристика биологически активных соединений в прополис трудно, потому что его химический состав могут варьироваться в соответствии его источник происхождения. Таким образом необходимо установить осуществимым и повторяемые метод для определения качества Тайваньская зеленый прополиса. Однако стандартная процедура не была создана для извлечения Тайваньская зеленый прополис и последующих функционального анализа. Были предложены несколько методов, которые разнообразно применение органических и неорганических растворителей для Прополис извлечения16,,1718,19,20. Потому что прополис является смесью липофильных, исследования показали, что органические извлечения лучше чем неорганических извлечения8,18,19. Общая propolin концентрация в тайваньской зеленый прополис и его антибактериальные свойства являются ключевыми показателями качества Тайваньская зеленый прополиса. Таким образом цель настоящего исследования – представить протокол для использования этанола в качестве растворителя для извлечения и характеризуют антибактериальные свойства Тайваньская зеленый прополис.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка извлечено этанола соединений

  1. Вес 10 г замороженных Тайваньская зеленый прополиса, которая была собрана из ульев в Тайване с мая по Июль, и растереть его с помощью специй мельницы. Подтвердите, что целые куски Тайваньская зеленый Прополис измельчается в порошок без каких-либо крупных частиц.
  2. Добавьте 100 мл различных концентраций этанола (60%, 70%, 80%, 95% и 99,5%) и воды, чтобы отделить колбы и перемешать каждый концентрации с 10 г прополиса земли.
  3. Инкубировать при 25 ° C и встряхнуть колбу в 250 об/мин в течение 48 часов.
  4. Фильтр этанола экстракты через фильтр-бумаги с порами размером 25 мкм.
  5. Воссоздать фильтратами до их первоначального объема (100 мл) с 95% этанола с помощью объемной колбу.
  6. Хранить этанола выдержки при температуре-20 ° C.
    Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь.

2. Подготовка этанола экстрактов для ВЭЖХ

  1. Концентрата 10 мл этанола экстрактов вакуумного испарения при 40 ° C на 15 мин.
  2. Выпекать сухого вещества на 45 ° C в течение 24 ч.
  3. Воссоздать сухого вещества с 10 мл этанола 95%.
  4. Фильтр 1 мл этанола выдержки, с помощью стерильного шприца фильтр с размером пор 0,45 мкм.
  5. Refilter экстракты этанол, с использованием стерильных шприцев фильтр с размером пор 0,22 мкм. Фильтрат собирается и могут непосредственно быть проанализированы с помощью ВЭЖХ.

3. анализ содержания Propolin, с помощью ВЭЖХ

  1. Создание стандартных кривых propolins
    1. Подготовка 1 Л мобильных фазы метанола: водный раствор 88.8:11.2 (v/v).
    2. Подготовить серийных разведений propolin стандарт (C, D, F и G) концентрации (15.625 мг/мл, 31,25 мг/мл, 62,5 мг/мл и 125 мг/мл, соответственно) с использованием мобильных фазы решения как растворитель.
    3. Придать 20 мкл propolin стандартной концентрации в столбце реверс фаза, последовательно от низкой концентрации в высокой концентрации.
    4. Задайте столбец ВЭЖХ на 30 ° C и скорости потока в 1 мл/мин.
    5. Установка длины волны УФ детектор до 280 Нм и рекордер время до 20 мин.
    6. Анализ стандартов по крайней мере 3 x.
    7. Участок измерения ответ (ось y) против концентрации (ось x) с помощью вычисления листа программного обеспечения и создать калибровочной кривой с помощью уравнения и значения R-квадрат.
  2. Анализ этанол экстракт s
    1. Придать 20 мкл этанола экстракты, полученные из шаг 2,5 в столбце реверс фаза.
    2. Задайте столбец ВЭЖХ на 30 ° C и скорости потока в 1 мл/мин.
    3. Установка длины волны УФ детектор до 280 Нм и рекордер время до 20 мин.
    4. Анализ стандартов по крайней мере 3 x.
    5. Рассчитайте концентрацию propolin в экстракте этанола, используя уравнение для стандартной кривой, полученные из шага 3.1.7, использующий площади пика для каждого propolin.

4. Минимальный тормозной концентрации и минимум бактерицидная концентрация анализ

Примечание: Метод microdilution используется для оценки антибактериальной эффективности этанол извлечь propolins из тайваньской зеленый прополис.

  1. Подготовка испытания организмов
    1. Оттепель бактериальных штаммов, золотистый стафилококк и Escherichia coli и затем, культура их в tryptic соевый бульон и питательный бульон, соответственно, при 37 ° C в течение 24 ч.
    2. Проход S. aureus , используя tryptic соевый бульон и E. coli с помощью питательный бульон для двух поколений и, затем, рассчитать колонии формирование подразделений путем подсчета отдельных колоний на плите агар.
  2. Подготовка этанола экстракты для антибактериальная активность тестирование
    1. Концентрат экстрактов этанола, полученные на шаге 1.5 вакуумного испарения при 40 ° C на 15 мин.
    2. Воссоздания сухого вещества с диметилсульфоксида (ДМСО) и регулировка концентрации экстракта 12.8 мг/мл.
    3. Сделать последовательный разрежения (концентрации: 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320 и 640 мкг/мл) этанола экстрактов с использованием бульон.
  3. Минимальная концентрация ингибирующее тесты
    1. 10 мкл разбавленного этанола экстрактов, начиная от 0,156 640.0 мкг/мл в плиту 96-луночных.
    2. С помощью бульон, отрегулируйте громкость до 100 мкл и сохранить 5% ДМСО в всех разведениях.
    3. Прививать 100 мкл бактериальной культуры (1 х 106/мл) в 96-луночных пластины.
    4. Посевные культуры, содержащие различные концентрации этанола выдержки при 37 ° C в течение 48 часов.
    5. Анализировать бактериальный рост зависимости мутности и с помощью оптической плотности (Считыватель микропланшетов) на 590 нм для определения минимальной концентрации тормозной (MIC).
  4. Бактерицидная концентрация минимум тесты
    1. Прививать 10 мкл жидкого культуры от каждой скважины MIC теста, которые выставлены не роста на агаре пластину.
    2. Инкубируйте при 37 ° C в течение 24 ч.
    3. Определите бактерицидной активности путем выявления низкие концентрации, которые показали без видимых роста бактерий. Концентрации, которая полностью исключает рост клеток считается минимальным бактериальных концентратов (МБК).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В таблице 1представлены положительные репрезентативных данных для извлечения этанола. Урожай сухой массы от тайваньской зеленый Прополис был положительно связаны с концентрацией этанола. Экстракты этанола 95% и 99,5% имели наивысший сухого вещества доходность от тайваньской зеленый прополис. Доходность низкая сухого вещества от тайваньской зеленый Прополис произошел, когда воды был использован в качестве экстракции растворителем. Эти результаты показывают, что органическо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Исследования сообщили, что мацерации, используя различные концентрации этанола, могут использоваться для извлечения бразильский Прополис17; Однако этот процесс был длительным17. Он взял по крайней мере 10 дней для извлечения биологически активных соединений, например, фенольные, бразильский Прополис17. Кроме того для извлечения бразильский Прополис19,,2122бы...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего объявить.

Благодарности

Этот манускрипт был отредактирован Уоллес академических редактирования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
этанолSigma-AldrichE7023
Ватман No4 фильтровальная бумагаSigma-AldrichWHA1004125
метанолSigma-Aldrich34860
обратная фаза RP-18 колонкаPhenomenex Inc.00G-0234-E0
Staphylococcus aureusATCCBCRC 10780
Escherichia coliATCCBCRC 10675
триптический соевый бульонSigma-Aldrich22092
питательный бульонSigma-Aldrich70122
диметилсульфоксидSigma-AldrichD2650
мельницадля специйСчитывательWSG60K
Молекулярные устройстваEMAX PLUS
HPLC СистемаAgilentсерии
BÜ CHIRotavapor R-215
микропланшетов Waring вакуумного испарения 1200

Ссылки

  1. Zabaiou, N., et al. Biological properties of propolis extracts: Something new from an ancient product. Chemistry and Physics of Lipids. 207 (Pt B), 214-222 (2017).
  2. Bankova, V. B., De Castro, S. L., Marcucci, M. C. Propolis: Recent advances in chemistry and plant origin. Apidologie. 31 (1), 3-15 (2000).
  3. Park, Y. K., Alencar, S. M., Aguiar, C. L. Botanical origin and chemical composition of Brazilian propolis. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 50 (9), 2502-2506 (2002).
  4. Chen, C. N., Wu, C. L., Shy, H. S., Lin, J. K. Cytotoxic prenylflavanones from Taiwanese propolis. Journal of Natural Products. 66 (4), 503-506 (2003).
  5. Chen, C. N., Weng, M. S., Wu, C. L., Lin, J. K. Comparison of radical scavenging activity, cytotoxic effects and apoptosis induction in human melanoma cells by Taiwanese propolis from different sources. Evidence-Based Complementary and Alternative. 1 (2), 175-185 (2004).
  6. Chen, C. N., Wu, C. L., Lin, J. K. Apoptosis of human melanoma cells induced by the novel compounds propolin A and propolin B from Taiwanese propolis. Cancer Letters. 24 (1-2), 218-231 (2007).
  7. Huang, W. J., et al. Propolin G, a prenylflavanone, isolated from Taiwanese propolis, induces caspase-dependent apoptosis in brain cancer cells. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 55 (18), 7366-7376 (2007).
  8. Chen, Y. W., Ye, S. R., Ting, C., Yu, Y. H. Antibacterial activity of propolins from Taiwanese green propolis. Journal of Food and Drug Analysis. 26 (2), 761-768 (2018).
  9. Hegazi, A. G., Abd El Hady, F. K., Abd Allah, F. A. M. Chemical composition and antimicrobial activity of European propolis. Zeitschrift für Naturforschung. 55 (1-2), 70-75 (2000).
  10. Sforcin, J. M., Fernandes, A., Lopes, C. A. M., Bankova, V., Funari, S. R. C. Seasonal effect on Brazilian propolis antibacterial activity. Journal of Ethnopharmacology. 73 (1-2), 243-249 (2000).
  11. Chen, Y. W., et al. Characterization of Taiwanese propolis collected from different locations and seasons. Journal of the Science of Food and Agriculture. 88 (3), 412-419 (2008).
  12. Grange, J. M., Davey, R. W. Antibacterial properties of propolis (bee glue). Journal of the Royal Society of Medicine. 83 (3), 159-160 (1990).
  13. Kujumgiev, A., et al. Antibacterial, antifungal and antiviral activity of propolis from different geographic origins. Journal of Ethnopharmacology. 64 (3), 235-240 (1999).
  14. Krol, W., Scheller, S., Shani, J., Pietsz, G., Czuba, Z. Synergistic effect of ethanol extract of propolis and antibiotics in the growth of Staphylococcus aureus. Drug Research. 43 (5), 607-609 (1993).
  15. Lu, L. C., Chen, Y. W., Chou, C. C. Antibacterial and DPPH free radical-scavenging activities of the ethanol extract of propolis collected in Taiwan. Journal of Food and Drug Analysis. 11 (4), 277-282 (2003).
  16. Tosi, B., Donini, A., Romagnoli, C., Bruni, A. Antimicrobial activity of some commercial extracts of propolis prepared with different solvents. Phytotherapy Research. 10 (4), 335-336 (1996).
  17. Cunha, I. B. S., et al. Factors that influence the yield and composition of Brazilian propolis extracts. Journal of the Brazilian Chemical Society. 15 (6), 964-970 (2004).
  18. Woo, S. O., Hong, I. P., Han, S. M. Extraction properties of propolis with ethanol concentration. Journal of Apicultural Research. 30 (3), 211-216 (2015).
  19. Park, Y. K., Ikegaki, M. Preparation of water and ethanolic extracts of propolis and evaluation of the preparations. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 62 (11), 2230-2232 (1998).
  20. Ramanauskienė, K., Inkėnienė, A. M. Propolis oil extract: quality analysis and evaluation of its antimicrobial activity. Natural Product Research. 25 (15), 1463-1468 (2011).
  21. Machado, B. A., et al. Chemical composition and biological activity of extracts obtained by supercritical extraction and ethanolic extraction of brown, green and red propolis derived from different geographic regions in brazil. PLoS One. 11 (1), e0145954(2016).
  22. Monroy, Y. M., et al. Brazilian green propolis extracts obtained by conventional processes and by processes at high pressure with supercritical carbon dioxide, ethanol and water. The Journal of Supercritical Fluids. 130, 189-197 (2017).
  23. Popova, M., Chen, C. N., Chen, P. Y., Huang, C. Y., Bankova, V. A validated spectrophotometric method for quantification of prenylated flavanones in pacific propolis from Taiwan. Phytochemical Analysis. 21 (2), 186-191 (2010).
  24. Chen, L. H., et al. Taiwanese green propolis ethanol extract delays the progression of type 2 diabetes mellitus in rats treated with streptozotocin/high-fat diet. Nutrients. 10 (4), e503(2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Экстракция этаноломвысокоэффективная жидкостная хроматографияанализ антибактериальной активностиконцентрация прополинавыход сухого веществаминимальная подавляющая концентрацияобращенно-фазовая ВЭЖХУФ-детектор при 280 нмметод микроразведений в бульоне
Извлечение и анализ тайваньского зеленый прополиса
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.