Эта работа описывает клонирования штамма троянский конь пузырчатая maydis на месте доставки секретируемые белки кукурузы в три различных видов кукурузы тканей.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
С помощью пузырчатая maydis как троянский конь в месте доставки кукурузу белков
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Вдохновленный Homer´s троянский конь миф, мы инженерии кукурузы возбудителя пузырчатая maydis доставить секретируемые белки в кукурузы апопласт, позволяющие в естественных условиях фенотипического анализа. Этот метод не полагаться на кукурузу трансформации, но подвиги микробной генетики и секреторную возможности патогенов. Здесь он позволяет осмотр в естественных условиях доставлены секретируемые белки с высоким пространственно-временных резолюции на различные виды сайтов инфекции и тканей. Троянский конь стратегия может быть использован для временно дополнять кукурузы фенотипы функция потерь, функционально характеризовать доменов протеина, анализировать-целевого белка эффекты, или для изучения передозировка играющий белка, что делает его мощным инструментом для изучений протеина в системе урожая кукурузы. Эта работа содержит точный протокол о том, как генерировать штамм троянский конь, следуют стандартизированных инфекции протоколы применить этот метод к трем типам различных кукурузы ткани.
Введение
Возбудитель biotrophic maydis пузырчатая является возбудителем болезни головня кукурузы1. Он заражает все надземные части кукурузы, что приводит к большой опухоли, которые содержат споры melanized, черный. На глобальном уровне U. maydis оценивается вызвать ежегодные потери около 2% урожая кукурузы, в то время как опухоли ценятся как гастрономическим деликатесом в Мексике. Аппрессории, который выделяет лизировать ферменты клеточной стенки проникнуть первый слой кукурузы эпидермальных клеток инициируется завод инфекции. С сайта первичной инфекции U. maydis растет внутриклеточно и intercellularly, вторгаясь клетки один или два слоя каждый день1,2. Успешное инфекции приводит к гипертрофии завод, который превращается в видимые опухоли после пяти дней должность инфекции1,3,4. На всех стадиях инфекции грибные гифы инвагинировать мембраны цитоплазме завод без прямого контакта в цитоплазме принимающей1,2. Жесткие apoplasmic пространство между заражение гифы и завод плазматической мембраны считается хост/возбудителя интерактивный сайт, называется biotrophic зоны взаимодействия. Для того, чтобы преодолеть иммунной системы растений, U. maydis выделяет массив эффекторных белков в biotrophic взаимодействия зоны1. Некоторые эффекторов занимают растительных клеток, в то время как другие остаются в biotrophic взаимодействия зоны5,6,,78. Один apoplastic эффектора — UmPit2, который взаимодействует с apoplastic кукурузы протеазы для предотвращения выхода сигнальный пептид ZmZIP1 от ZmPROZIP,apoplastic протеазы деятельность910.
За последние десятилетия U. maydis стал не только модель для грибковых генетики растений возбудитель взаимодействия, но и ценным инструментом в области биотехнологии в силу понятных жизненного цикла, доступность генетических и гетерологичных выражение выделяется белки11,12,13. Сигналы для обоих традиционных и нетрадиционных белка секрецию были определены разрешение контроль Посттрансляционная изменения14. Недавно U. maydis работал как троянский конь инструмент для изучения малых, выделяется кукуруза белков в situ15. Троянский конь подход успешно использовался для анализа функции небольшой, выделяется белка ZmMAC1, который участвует в развитии пыльников. ZmMAC1 вызывает periclinal разделение плюрипотентных клеток и клеток судьба спецификации новообразованной клетки15. Таким же методом была выявлена биологическая функция кукурузы ущерб связанных пептидной ZmZIP1. U. maydis секреции кукурузы, ZmZIP1 привели к нарушение формирования опухоли10. Таким образом троянский конь подход представляет ценные альтернативный маршрут для белка в situ исследований с высоким пространственно-временных резолюцией, которая делает не требуют поколение стабильной кукурузы преобразование линии ни инфильтрации тканей с участием выраженное и очищенных белков. В частности троянский конь стратегия позволяет секрецию любой гетерологичных белка в кукурузы Апопласт и прямое сравнение инфицированных и неинфицированных растительных клеток внутри же ткани.
Этот протокол иллюстрирует основные шаги для создания штамма троянский конь U. maydis для изучения протеина интереса. Она далее включает в себя точную информацию о процедурах инфекции трех типов различных кукурузы ткани (взрослый листья, кистями и уши) с U. maydis, который является предпосылкой для изучения пространственно-временных инфекции прогрессии и белков функции в этих тканях-мишенях. Без дальнейших спецификаций приводятся кукурузы амплификации генов и микроскопических изображений техники, поскольку эти шаги являются целевыми и инструмент зависимой. Таким образом этот протокол предназначен для опытных пользователей стандартных молекулярные методы биологии.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Строительство U. maydis троянский конь
Примечание: Смотрите Рисунок 1.
- Усилить ген интереса от кукурузы кДНК гена специфические праймеры и корректура ДНК-полимеразы. Клон основной продукт PCR и превратить конструкцию в E. coli следуя инструкциям производителя плазмида. Проверьте правильный гена интереса последовательности Сэнгер последовательности до использования клонирования выполнение следующих шагов.
Примечание: ПЦР спецификации должны быть оптимизированы из-за специфики последовательность праймера и условий реакции оптимального ДНК-полимеразы. - Дизайн праймеров для того чтобы усилить кукурузы гена интереса без последовательности кодирования сигнала пептид (SP).
- Расширение 5´ конец обратной праймера с RSIATA мотив и НКОя резки сайта (Таблица 1).
- Усилить кукурузы гена интереса с корректура ДНК-полимеразы, с помощью ПЦР конструкции сгенерирована 1.1 как шаблон ПЦР.
- Двухместный Дайджест продукт PCR и U. maydis трансформации плазмида, p123-PUmpit2-SpUmpit2- Zmmac1-mCherry-ха15, с Xbaя и НКО I. очищают перевариваются продукт PCR и плазмиды.
- Перевязать переваривается продукт PCR в p123-PUmpit2-SpUmpit2- Zmmac1-mCherry-ха шаблон с помощью T4 ДНК лигаза следуя инструкциям manufacturer´s. Преобразовать перешнуровки продукта в E. coli и проверять правильную гена интереса последовательности Сэнгером последовательности.
- Линеаризации p123-PUmpit2-SpUmpit2- Zmгена интереса mCherry-ха с энзима ограничения SspI и преобразование ДНК в solopathogenic U. maydis штамма SG20016. Изолировать U. maydis трансформантов, carboxin выбор и подтвердить, что изолированные трансформантов на юге блот анализ16.
Примечание: Для каждого протеина интереса, по крайней мере три независимых U. maydis трансформантов должны быть изолированы и проанализированы для оценки воздействия любой фенотип фон случайных мутаций.
2. Культура СМИ
- Подготовка YEPSlight жидкость средних16: 1,0% (w/v) дрожжей экстракт, 0,4% (w/v) Bacto-Пептон и 0,4% (w/v) сахарозы. Распустить все компоненты в ddH2O и автоклаве при температуре 121 ° C 15 мин; автоклавирование при более высокой температуре, на более длительный период времени или неоднократно снизит качество среды.
- Готовить картофель декстроза агар (PD-агар)20: 3,9% (w/v) картофеля декстроза агар и 1,0% (w/v) 1 М трис-HCl рН 8,0 (ФК 0,01 М). Смешайте все компоненты непосредственно в бутылку для автоклавирования и добавить ddH2O плюс бар магнитные перемешать. Автоклаве при температуре 121 ° C 15 мин; автоклавирование при более высокой температуре, на более длительный период времени или неоднократно снизит качество среды.
- Подготовить PD-уголь агар20: 3,9% (w/v) картофеля декстроза агар, 1% (w/v) уголь и 1,0% (v/v) 1 М трис-HCl рН 8,0 (ФК 0,01 М). Смешайте все компоненты непосредственно в бутылку для автоклавирования и добавить ddH2O плюс бар магнитные перемешать. Автоклаве при температуре 121 ° C 15 мин; автоклавирование при более высокой температуре, на более длительный период времени или неоднократно снизит качество среды.
3. завод инфекции
- Выполнить анализ кукурузы деления клеток в ответ на троянский конь, доставлены белков (например, подсчет на основе микроскопии клетки) заранее. U. maydis -индуцированной пролиферации клеток кукурузы и образования последующих опухоли начинается около 4-5 дней поста инфекции. Оценки количественных болезни зависят от тканей и должно выполняться от 6 до 14 дней поста инфекции.
Примечание: Различных сортов кукурузы показывают различные уровни восприимчивость к инфекции U. maydis . Кукурузы cпротив W23, A188, Флинт Гаспе, ранней Золотой петух или Va35 Показать восприимчивость к этой возбудителя и таким образом подходящих сортов для исследования троянский конь. - Подготовка U. maydis посевным материалом
- Включать прародитель штамм SG200 как отрицательный контроль в всех троянский конь экспериментов для оценки побочных эффектов на инфекции, трансгенных штамм. Здесь используйте штамма U. maydis выражения протеина интереса как отрицательный контроль версии, не выделяется. Однако по соображениям целесообразности (например, больше фильмов), прародитель деформации может быть легче выбор элемента управления.
- Перед началом эксперимента, оцените, какое количество инфекции культуры необходимы. Имейте в виду, что инфекция каждого завода требует 1-1,5 мл суспензии U. maydis зависит от типа кукурузы ткани.
Примечание: Примерно 1 мл ночь культуры является достаточным для разбавления ОД600 мл 0,2 в 20 средних YEPSсвет , и 25 мл с ОД600 0,8-1,0 U. maydis культуры являются достаточными для заражения растений 13-16. - Царапинам U. maydis от PD агар пластины с помощью стерильные пипетки Пастера, прививать в 5 мл YEPSсвет среднего и пусть культуры растут на 28 ° C с постоянной тряски на 200 rpm для 16 h.
- До инфекции изучите U. maydis прививки культуры, стандартные световой микроскопии для правильного роста и бактериального загрязнения при 400-кратном.
Примечание: В подходящих культуре только сигары в форме гриба является видимым (рис. 2). - Смешать 900 мкл свежие YEPSсвет с 100 мкл ночь культуры и измерить ОД600 с помощью YEPSсвет среднего как пробелы в анализе спектрофотометра.
- Разбавить ночь культуры с свежие среднегосвет YEPS ОД600 0.2 и пусть культуры растут на 28 ° C с постоянной тряски на 200 об/мин до достижения фазы роста среднего журнала указанного ОД600 Нм 0,8-1,0.
Примечание: Ю. maydis клетки дублировать каждые 2 ч в этих условиях, достигнув желаемого ОД600 после 4-5 ч культивирования. - Урожай клетки на600 OD 0.8-1.0, спиннинг на 3000 x g 10 мин и удалить супернатант.
- Помыть лепешка клетки один раз с ddH2O. Для этой цели добавьте один объем культуры ddH2O, спина с 3000 x g 10 мин и удалить супернатант.
- Ресуспензируйте тщательно Пелле клеток в ddH2O, с помощью пипетки стекла 20 мл, тем самым регулируя окончательный ОД600 до 3.0 (для assay троянский конь) или 1.0 (для болезни рейтинг).
- Проверка троянский конь: в planta секрецию кукурузы синтез белка
- Заразить кукурузы саженцев с троянский конь штамм17.
- Выполняйте микроскопических изображений зараженных проростков на 2-3 дня пост инфекции с помощью конфокальный лазерный сканирующий микроскоп. С этой целью акцизный прямоугольный кусок листьев 1 см ниже точки инъекции, поместите образец на слайд микроскопа и добавить каплю ddH2O. Чтобы визуализировать mCherry синтез белка, возбуждают образца на λ = 561 Нм и записи выбросов при λ = 580-630 Нм.
- Инфицирования взрослых листьев кукурузы
- Возделывать кукурузные растения на сцену взрослых листьев (когда по крайней мере лист 7 растет внутри стебля).
Примечание: Этот этап достигнут через четыре недели после посева в тепличных условиях 14 h, день/10 h 28 ° C, 22 ° C ночь ритм с помощью cv. W23. Продолжительность может варьироваться с кукурузы сорта и парниковых условий. - Передача U. maydis культуры (см. 3.2.9) в 3-мл шприц с иглой подкожных 20 g x 1.
- Нажмите стебель тщательно, чтобы локализовать ткани Меристемы стебля. База Меристемы можно отличить по переход от сложнее стебля в мягкие ткани.
- Марк Меристемы на стебле, с помощью пера.
- Придать 1,5 мл U. maydis культуры 1 см выше стрелять Меристемы или соцветие Меристемы.
- Интенсивность симптомов болезни в 6 и 12 дней поста инфекции.
- Возделывать кукурузные растения на сцену взрослых листьев (когда по крайней мере лист 7 растет внутри стебля).
- Инфекция кистями
- Растут растения кукурузы до достижения стадии кисточкой.
Примечание: Подробный график на пыльников и кисточкой развития кукурузы cv. W23 был ранее описанных1819. Кистями, содержащие предварительно meiotic пыльники весьма чувствительны к инфекции U. maydis ; в кукурузы cv. W23 кистями являются размер 4-7 см. - Нажмите стебель тщательно, чтобы локализовать кисточкой в стволе.
- Марк кончик и база кисточкой на оси с помощью пера.
- Передача U. maydis культуры (см. 3.2.9) в 3-мл шприц с иглой подкожных 20 g x 1.
- Придать 1,5 мл посевным материалом вокруг кисточкой. Для обеспечения равного распределения посевным материалом, медленно место 0,5 мл на кончик, средняя часть и база кисточкой, помеченные с помощью пера.
- Ставка на 10 дней поста инфекции симптомы болезни.
- Растут растения кукурузы до достижения стадии кисточкой.
- Инфекция ушей
Примечание: развития ткани уха отличается в различных сортов кукурузы и тепличных условиях и должны тщательно соблюдаться до прививки. Уши начинают перерастать шелка весьма чувствительны к инфекции U. maydis .- Передача U. maydis культуры (см. 3.2.9) в 3 мл шприц с иглой подкожных 20 G x 1.
- Inject прививка иглы в пространство между шелухи листья так глубоко, как можно без ранив уха.
- Версия 1.5 мл посевным материалом вокруг уха.
- Извлеките шприц и иглу и тщательно массаж початка распространить решение U. maydis одинаково.
- Стоимость на 14 дней поста инфекции симптомы болезни.
- Подтвердить жизнеспособность U. maydis посевным материалом
- Падение 10 мкл посевным материалом на тарелку уголь агар PD и инкубации при комнатной температуре на 2 дня.
Примечание: Если соответствующие U. maydis культура является возможность формы нитей накала, пушистые, белый грибница становится видимым (рис. 5)
- Падение 10 мкл посевным материалом на тарелку уголь агар PD и инкубации при комнатной температуре на 2 дня.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Конструкции для U. maydis троянский конь экспериментов клонируются в плазмиду p123-PUmpit2-Sppit2Um-гена интереса mCherry-ха. Кукурузы гена интереса сливается с репортером флуоресценции mCherry и epitope ха-тег. Выражение синтез белка находится под контролем промотораpit2 U. maydis единой системы обмена сообщениями, который специально активируется во время ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Исследование современных культур требует протоколы для молекулярного анализа генетических и уровни белка. Генетическая доступность через преобразование не доступен или неэффективным и трудоемким для большинства видов сельскохозяйственных культур, например кукурузы. Кроме того надежный генетических инструменты, такие как промоутер репортер систем скудны, что делает его трудным для изучения функции на месте белка с высоким пространственно-временных резолюции на сайтах различных тканей. Apoplastic белки могут быть ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Авторы хотели бы поблагодарить Томас Дресселгауз, Мартин Parniske, Нуреддин Djella и Армин Хильдебранд для предоставления лаборатории пространства и растительных материалов. Оригинальные работы по методу троянский конь было поддержано Леопольдина постдока стипендий и NSF проекта IOS13-39229. Работы, представленные в этой статье было поддержано SFB924 (проекты A14 и В14) от DFG.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 2 мл шприца | B. Braun | 4606027V | |
| 23 G x 1 1/4 игла для подкожных инъекций | B. Braun | 4657640 | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| кДНК из кукурузы | из ткани кукурузы, экспрессирующей ген интерреста Древесный | ||
| уголь | Sigma-Aldrich | 05105 | |
| Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп | использование локально доступного оборудования | ||
| Кювета (10 мм x 4 мм x 45 мм) | Sarstedt | 67742 | |
| Инкубатор-шейкер установлен на 28 градусов; C, 200 об/мин | использовать локально доступное оборудование | ||
| Световой микроскоп с 400-кратным увеличением | использовать локально доступное оборудование | ||
| Nco I | NEB | R0193 | |
| p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-Haпожалуйста, | свяжитесь с соответствующим автором | ||
| Пастеровская пипетка (стеклянная, с длинным наконечником) | VWR | 14673-043 | |
| pCR-Blunt-II-TOPO | Thermo Fisher Scientific | K280002 | может быть заменена на другие основные векторы клонирования, такие как pENTR или pJET |
| Potato Dextrose Agar | VWR | 90000-745 | |
| Ручка | острого использования локально доступного оборудования | ||
| Спектрофотометр | для использования локально доступного оборудования | ||
| Ssp I | NEB | R0132 | |
| Сахароза | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| T4 ДНК-лигаза | NEB | M0202 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | |
| em>Xba I | NEB | R0145 | |
| Экстракт дрожжей | БД | 212750 |
Ссылки
- Kämper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
- Doehlemann, G., et al. Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystem. Journal of Plant Physiology. 165, 29-40 (2008).
- Matei, A., et al. How to make a tumour: cell type specific dissection of Ustilago maydis-induced tumour development in maize leaves. New Phytologist. , (2018).
- Doehlemann, G., et al. Reprogramming a maize plant: transcriptional and metabolic changes induced by the fungal biotroph Ustilago maydis. The Plant Journal. 56, 181-195 (2008).
- Doehlemann, G., et al. Pep1, a secreted effector protein of Ustilago maydis., is required for successful invasion of plant cells. PLOS Pathogens. 5, e1000290(2009).
- Redkar, A., et al. A secreted effector protein of Ustilago maydis guides maize leaf cells to form tumors. The Plant Cell. 27, 1332-1351 (2015).
- Djamei, A., et al. Metabolic priming by a secreted fungal effector. Nature. 478, 395-398 (2011).
- Tanaka, S., et al. A secreted Ustilago maydis effector promotes virulence by targeting anthocyanin biosynthesis in maize. eLife. 3, e01355(2014).
- Mueller, A. N., Ziemann, S., Treitschke, S., Assmann, D., Doehlemann, G. Compatibility in the Ustilago maydis-maize interaction requires inhibition of host cysteine proteases by the fungal effector Pit2. PLOS Pathogens. 9, e1003177(2013).
- Ziemann, S., et al. An apoplastic peptide activates salicylic acid signalling in maize. Nature Plants. 4, 172-180 (2018).
- Juárez-Montiel, M., et al. The corn smut ('Huitlacoche') as a new platform for oral vaccines. PLoS One. 10, e0133535(2015).
- Sarkari, P., Feldbrügge, M., Schipper, K. Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. Schmoll, M., Dattenböck, C. , Springer International Publishing. 183-200 (2016).
- Monreal-Escalante, E., et al. The corn smut-made cholera oral vaccine is thermostable and induces long-lasting immunity in mouse. Journal of Biotechnology. 234, 1-6 (2016).
- Stock, J., et al. Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).
- van der Linde, K., et al. Pathogen Trojan horse delivers bioactive host protein to alter maize (Zea mays) anther cell behavior in situ. The Plant Cell. 30, 528-542 (2018).
- Bösch, K., et al. Genetic manipulation of the plant pathogen Ustilago maydis to study fungal biology and plant microbe interactions. Journal of Visualized Experiments. , e54522(2016).
- Chavan, S., Smith, S. M. A rapid and efficient method for assessing pathogenicity of Ustilago maydis on maize and teosinte lines. Journal of Visualized Experiments. 50712, (2014).
- Kelliher, T., Walbot, V. Emergence and patterning of the five cell types of the Zea mays anther locule. Developmental Biology. 350, 32-49 (2011).
- Egger, R. L., Walbot, V. Quantifying Zea mays. tassel development and correlation with anther developmental stages as a guide for experimental studies. Maydica. 60, M34(2015).
- Holliday, R. Bacteria, Bacteriophages, and Fungi: Volume 1. King, R. C. , Springer US. 575-595 (1974).
- Doehlemann, G., Reissmann, S., Aßmann, D., Fleckenstein, M., Kahmann, R. Two linked genes encoding a secreted effector and a membrane protein are essential for Ustilago maydis-induced tumour formation. Molecular Microbiology. 81, 751-766 (2011).
- Banuett, F., Herskowitz, I. Different a alleles of Ustilago maydis are necessary for maintenance of filamentous growth but not for meiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 86, 5878-5882 (1989).
- Bortfeld, M., Auffarth, K., Kahmann, R., Basse, C. W. The Ustilago maydis a2 mating-type locus genes lga2 and rga2 compromise pathogenicity in the absence of the mitochondrial p32 family protein Mrb1. The Plant Cell. 16, 2233-2248 (2004).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
