Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оценки вирулентности и патогенез Aeromonas инфекции в Caenorhabditis elegans модели

7.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58768

⸱

20 декабря 2018 г.

 ,  ,  , 
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Internal Medicine, National Cheng Kung University Hospital, College of Medicine, National Cheng Kung University, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine, National Cheng Kung University, 4Department of Microbiology and Immunology, College of Medicine, National Cheng Kung University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем три различных экспериментов для изучения Aeromonas инфекции в C. elegans. Используя эти удобные методы, это легко для оценки токсичности между и внутри Aeromonas видов.

Аннотация

Человеческий патоген Aeromonas было клинически показано, чтобы причинить гастроэнтерита, раневые инфекции, сепсис и мочевыводящих путей. Большинство человеческих заболеваний, как сообщается, быть связаны с четырьмя видами бактерий: Aeromonas dhakensis, аэромонадами hydrophila, Aeromonas veroniiи Aeromonas caviae. Модельный организм Caenorhabditis elegans является bacterivore, который обеспечивает отличную инфекции модель изучить бактериальных патогенеза Aeromonas. Здесь мы представляем три различных экспериментов для изучения Aeromonas инфекции с использованием модели C. elegans , включая выживание, жидкие токсичности и анализов некроз мышц. Результаты трех методов определения вирулентности Aeromonas согласуются. A. dhakensis , было показано, что наиболее токсичных среди 4 основных вида Aeromonas , вызывая клинической инфекции. Эти методы представлены быть удобным способом для оценки токсичности между и внутри Aeromonas видов и способствовать нашему пониманию патогенеза Aeromonas инфекции.

Введение

Клинически доказано человеческий патоген, Aeromonas, причинить гастроэнтерита, раневые инфекции, сепсис и мочевых инфекций1,2. Ассоциироваться с четырех бактериальных видов были зарегистрированы наиболее ассоциированных заболеваний человека: Aeromonas dhakensis, аэромонадами hydrophila, Aeromonas veroniiи Aeromonas caviae 2,3 , 4 , 5. среди Aeromonas инфекционные заболевания, инфекции мягких тканей может привести к тяжелой заболеваемости и смертности в организме человека. Следует отметить некроз мышц является наиболее тяжелой формой инфекции мягких тканей6. Наблюдение за выживание и некроз мышц Caenorhabditis elegans после инфекции является удобным способом спекулировать на токсичность Aeromonas.

Ученые уже разработали многочисленные модели организмов для изучения бактериальных инфекций. В предыдущих исследованиях мышей, zebrafishes и нематод использовались как животных моделей для изучения патогенеза и вирулентности Aeromonas6,,78. Каждое животное модель имеет свой ' преимущества и приложений. Модельный организм, Caenorhabditis elegans, представляет нематода bacterivorous какие потребления бактерий как foodnaturally. C. elegansразработал сложный врожденной иммунной системы против бактериальной инфекции в течение его эволюции. Под напряжение, бактериальной инфекции C. elegans было доказано быть отличным инфекции модель для изучения бактериальных патогенеза Aeromonas6,7,9 и другие патогены как гриб10 и инфекции, вызванной энтерогеморрагической кишечной палочки O157: H711. Однако есть еще не публикации, которая фокусируется на методологии использования C. elegans в качестве модели для изучения вирулентности Aeromonas.

Здесь, мы представляем три различных экспериментов для изучения Aeromonas инфекции с помощью C. elegans как животной модели: анализы для выживания, жидкие токсичности и некроз мышц. Эти методы являются удобным способом для оценки токсичности между и внутри Aeromonas видов и улучшения понимания патогенеза Aeromonas.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка питательной среды

Примечание: См. таблицу 1 для приготовления раствора.

  1. Подготовить M9 средних12, растворяют 1,5 г х2PO4, 5,66 g Na2HPO4и 2,5 г NaCl в 500 мл деионизованной воды. Автоклавированием при температуре 121 ° C в течение 20 минут ждать, пока остынет до комнатной температуры, а затем добавить 0,5 мл 1 М MgSO4 перед первым использованием.
  2. Чтобы подготовить нематоды роста среднего (НГМ)12, Растворите 3 g NaCl, бактериальных Пептон 2.5 g и 20 g агар в 1 Л деионизированной воды. Автоклавированием при температуре 121 ° C в течение 20 минут ждать, пока остынет до 55 ° C на водяной бане, а затем добавить 1 мл CaCl 1 M2, 1 мл 1 М MgSO4, 1 мл 5% холестерина в этаноле и 25 мл фосфатного буфера. Вихрем перемешать.
  3. Наливайте около 5 мл NGM в каждый 6 см Петри. Избегайте пузырь производства на поверхности пластины. Оставьте пластины при комнатной температуре на 1 ночь и пакет для сохранения при 4 ° C. Вернуть к комнатной температуре перед использованием.
  4. Чтобы подготовить обогащенного NGM (ENGM), растворяют 3 g NaCl, 5 g бактериальных Пептон, экстракт дрожжей 1 g и 30 g агар в 1 Л деионизированной воды. Автоклавированием при температуре 121 ° C в течение 20 минут подождать, пока остынет до 55 ° C в ванне с водой и добавить 1 мл CaCl 1 M2, 1 мл 1 М MgSO4, 1 мл 5% холестерина в этаноле и 25 мл фосфатного буфера. Вихрем перемешать.
  5. Наливайте около 10 мл ENGM в каждом 9 см Петри. Избегайте пузырь производства на поверхности пластины. Оставьте пластины при комнатной температуре на 1 ночь и пакет для сохранения при 4 ° C. Привести к комнатной температуре перед использованием.
  6. Подготовить S средних12, смешать цитрат калия 40 мл S базальной, 0,4 мл 1 M, решение, 0,12 мл CaCl 1 М2, 0,12 мл 1 М MgSO4, 40 мкл 5% холестерина в этаноле и 1 мл 8 мм FudR перед использованием металлов 0,4 мл трассировки.

2. Синхронизация C. elegans6,9,12

  1. Мыть около 2000 червей в стадии беременных Взрослый с 10 мл стерильной обессоленной воды в 15 мл. Промойте бактерий 3 x, держим червей в нижней части трубки.
  2. Центрифуга для образца за 1 мин на 500 x g тянуть вниз червей. Удалить супернатант и держать червей в 3,5 мл деионизированной воды.
  3. Добавьте 1 mL NaOCl (10 – 15%) и 0,5 мл 5 M Кох в трубу. Смесь равномерно встряхнув для < 6 мин лизируют тела червя.
  4. После того, как яйца освобождаются от червей, добавьте 10 мл деионизированной воды, чтобы остановить lysis. Центрифуги для 1 мин на 1200 x g тянуть вниз яйца и удалить супернатант насколько это возможно. Промойте средних по крайней мере 3 x 15 мл M9.
    Примечание: Смотрите шаг 1.1 для состава среднего M9.
  5. Храните яйца в 1 мл M9 среде. Транспортировать яйца в 3,5 см блюдо для инкубации при 20 ° C на одну ночь (примерно 12-18 ч).
    Примечание: После инкубации яиц вылупятся червь личинки, который называется первой стадии личинки (L1).
  6. Пипетка из 10 мкл L1 червей в среде M9. Подсчитать количество червя и рассчитать концентрацию L1 червей в среде M9.
  7. Семя более 10000 инкубировали L1 стадии червей с пипетки на 9 см ENGM плиты с ОР50 кишечная палочка .
    1. В этом шаге распространение 0,5 мл на ночь культивированный E. coli ОР50 отваром Бертани Лурия (LB) на пластину ENGM 9 см. Инкубировать пластины при 37 ° C для 16-18 ч
      Примечание: Чтобы избежать загрязнения, распространяя шаг должен выполняться в Ламинарный шкаф.
    2. Охладите до комнатной температуры перед посевом L1 червей. Семя более 10000 инкубировали L1 стадии червей на ENGM табличке с E. coli ОР50.
  8. Инкубируйте червей при 20 ° C для 44 h, или до тех пор, пока они растут на стадии личинки (L4) 4тыс .
    Примечание: Смотрите Шаг 1.3 для состава ENGM среды. Червь имеет белая точка в форме полумесяца на середине тела стороне на стадии L4.
  9. Используйте синхронизированные L4, этап червей в следующем анализов. Использование дикого типа N2 червей в C. elegans assay выживаемости с Aeromonas dhakensis и пробирной жидкости токсичности C. elegans с Aeromonas dhakensis. Использование RW1596 червей (myo-3(st386); stEx30 [myo-3p::GFP::myo-3 + rol-6(su1006)]) в C. elegans assay некроз мышц с Aeromonas dhakensis.

3. C. elegans Assay выживаемости с Aeromonas6,9

  1. В день посева L1 червей на распространение с E. coli ОР50 ENGM выберите один колонии каждого из четырех Aeromonas штаммов или E. coli ОР50 и культуры с 2 мл LB отвара соответственно при 37 ° C для 16 h.
    Примечание: Чтобы избежать заражения, этот шаг должен выполняться в Ламинарный шкаф. Здесь были использованы следующие штаммы бактерий: E. coli ОР50, нормальное питание источник C. elegans. A. dhakensis AAK1, первый полностью виртуализированных патогенных клинических A. dhakensis изолировать. A. hydrophila A2-066, A. veronii A2-007 и A. caviae А2-9307121 являются репрезентивно клинических изолятов от национального Ченг Кунг университетской больницы.
  2. Измерение поглощения600 ОД бактериальных бульона и корректировать бактериальных бульон ОД600 = 2.0 с LB отвара.
  3. Месте и распространение 30 мкл бактериальных бульон каждая пластина NGM 6 см. На ночь культуры пластин при комнатной температуре.
    Примечание: Смотрите Шаг 1.2 состав NGM среднего.
  4. На следующий день L1 червей расти на сцену L4 случайным образом выбрать и передачи 50 червей NGM пластины с каждым из четырех Aeromonas штаммов или кишечной палочки ОР50.
  5. Инкубируйте NGM пластины при 20 ° C до завершения анализа.
  6. Передать все живые черви свежеподготовленные NGM пластины с бактериями и подсчитать количество живой, мертвой, а датчик глистов каждый день до тех пор, пока последний червь мертв.
    Примечание: Передать червей свежий подготовленный NGM пластины каждый день для поддержания инфекции, даже если с помощью стерильных червей (напримерglp-4, или с FudR).
  7. Участок на основе ежедневных данных расчет кривых выживания.

4. C. elegans жидкого токсичности Assay с Aeromonas7

Примечание: Чтобы избежать заражения, шаги должны выполняться в Ламинарный шкаф.

  1. На следующий день после посева L1 червей на ENGM табличке с E. coli ОР50, выбрать один колонии каждого из четырех Aeromonas штаммы E. coli ОР50 и культуры с 5 мл LB отвара при 37 ° C для 16 h.
    Примечание: В протоколе, были использованы следующие штаммы бактерий: E. coli ОР50, нормальное питание источник C. elegans. A. dhakensis AAK1, первый полностью виртуализированных патогенных клинических A. dhakensis изолировать. A. hydrophila A2-066, A. veronii A2-007 и A. caviae А2-9307121 являются репрезентивно клинических изолятов от национального Ченг Кунг университетской больницы.
  2. Измерьте absorbance600 ОД бактерии бульона.
  3. Центрифуга бактериальных бульон на 3500 x g на 15 минут, чтобы удалить LB отвара. Ресуспензируйте бактерии и отрегулировать бактериальных бульон ОД600 = 3.0 с S среднего. Мкл 195 бактериальной бульон в среде S для по крайней мере 8 скважин 96-луночных плиты.
    Примечание: Смотрите Шаг 1.6 для состава S среды.
  4. Смывают червей L4 на ENGM табличке с E. coli ОП5 с помощью M9 среднего. Отрегулируйте червь решение к концентрации 5 червей за мкл и добавить 5 мкл раствора червя в каждой скважине 96-луночных пластины. Убедитесь, что существует примерно 25 червей за хорошо.
  5. Инкубировать 96-луночных пластины на шейкер на 200 об/мин при 25 ° C.
  6. Подсчитать количество живой червей и мертвых червей после 24, 48 и 72 ч. рассчитать выживаемость каждой скважины с использованием следующей формулы: (Черви живут черви/общее) × 100%.
  7. Нарисуйте точечная диаграмма с ежедневных расчетов данных.

5. C. elegans Assay некроз мышц с Aeromonas6

Примечание: Чтобы избежать заражения, эти шаги должны выполняться в Ламинарный шкаф.

  1. В день L1 черви являются семенами на распространение с E. coli ОР50 ENGM, выбрать один колонии каждого из четырех Aeromonas штаммы E. coli ОР50 и культуры с 2 мл LB отвара при 37 ° C для 16 h.
    Примечание: Здесь были использованы следующие штаммы бактерий: E. coli ОР50, нормальное питание источник C. elegans. A. dhakensis AAK1, первый полностью виртуализированных патогенных клинических A. dhakensis изолировать. A. hydrophila A2-066, A. veronii A2-007 и A. caviae А2-9307121 являются репрезентивно клинических изолятов от национального Ченг Кунг университетской больницы.
  2. Измерить ОД600 поглощения бактерий бульона и отрегулировать бактерии бульон ОД600 = 2.0 с LB отвара. Месте и распространение 30 мкл бактериальной бульон на 6 см NGM пластины. На ночь культуры пластин при комнатной температуре.
  3. В день L1 червей расти на сцену L4, передачи 50 червей для каждой NGM пластины с каждым из четырех Aeromonas штаммов или кишечной палочки ОР50. Инкубировать NGM пластины при 20 ° C. Передача червей каждые 24 ч для недавно подготовленных NGM пластины с бактериями.
  4. Возьмите мышцы изображения с помощью микроскопа флуоресценции.
    1. Случайным образом выберите 10 червей на 2% гель агарозы в среде M9 на слайде. Парализовать червей, используя 2 мкл азид натрия 1% в среде M9 на агарозе менее чем 5 минут прежде чем принимать фотографии.
    2. Поместите крышку выскальзования и захвата изображения мышц, используя Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) фильтр на флуоресцентный микроскоп с зарядовой камеры. Захвата изображения мышц на 24, 48 и 72 ч после этапа L4.
  5. Проведите анализ и фигура Подготовка образа с обработки изображений программное обеспечение.
    Примечание: Определения баллы и уровни повреждения мышц показаны на рисунке 3, для которой критерии перечислены следующим: 3 очка за отсутствующих мышечных волокон; 2 балла за разрыв или сломанные мышечных волокон; 1 очко для изогнутых мышечных волокон; 0 очков для здорового мышечных волокон.

6. Статистический анализ

  1. Выполните все эксперименты как минимум три раза независимо.
  2. Используйте метод Каплана-Мейера для оценки нематоды Caenorhabditis elegans выживания анализов и лог ранг тест в анализе различия на выживание. Установить статистической значимости 0,05.
  3. Используйте t критерия Стьюдента для анализа статистические результаты анализов жидких токсичности C. elegans для двух разных групп. Используйте одностороннюю теста ANOVA, анализируя различия между тремя или более значениями для одной независимой переменной. Установить статистической значимости 0,05.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Следуя протоколы, описанные выше, это легко различать токсичность из четырех Aeromonas штаммов. Выживание пробирного C. elegans показан на рисунке 1. C. elegans инфицированных Aeromonas видов, в порядке от высокой к низкой выживаемости были: A. caviae, A. veronii, A. hydrophila и A. dhakensis. Хотя есть разнообразие с точки зрения токсичности между и внутри Aeromonas видов, выживаемость C. ele...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

C. elegans является bacterivorous нематод, что естественно воздухозаборники бактерий как еда и разработал сложный врожденный иммунитет к бактерии в ходе эволюционного процесса. Два главных органов, техническое обслуживание и поддержание иммунитета являются эпидермиса и кишки9,13. Эпидермис и полосы мышц C. elegans напоминают мягких структур в6млекопитающих и человека. Из-за этих характеристик C. elegans применяет...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы благодарны за помощь из фонда основных C. elegans в Тайване и диагностической микробиологии и антимикробной сопротивления лаборатории из национальных Ченг Кунг университетской больницы для предоставления Aeromonas изолирует. Мы также признаем Caenorhabditis центр генетики (CGC) и WormBase. Мы также благодарю Savana Мур для редактирования рукопись.

Это исследование было частично поддерживается грантов от министерства науки и технологий Тайваня (наиболее 105-2628-B-006-017-MY3) и национального Ченг Кунг университетской больницы (NCKUH-10705001) п.л. Чэнь.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Шейкеринкубатор YIH DERLM-570RБактериальная инкубация
K2HPO4J.T.BakerMP021519455Подготовка питательной среды 
KH2PO4J.T.Baker3246-05Подготовка питательной среды 
Na2HPO4J.T.BakerMP021914405Приготовление питательных сред 
NaClSIGMA31434Приготовление питательных сред 
MgSO4SIGMAM7506Приготовление питательной среды 
агарDifco214530Питательная среда приготовление 
CaCl2SIGMAC1016Подготовка питательной среды 
холестеринSIGMAC8503Питательная среда приготовление 
этанолSIGMA32205Приготовление питательной среды 
KOHSIGMAP5958Приготовление питательных сред 
Тарелка Петри 6 смALPHA PLUS46агаровая тарелка
96-луночная тарелкаFALCON353072жидкий анализ
бактериальный пептонAffymetrix/USBAAJ20048P2Подготовка питательной среды 
дрожжевой экстрактSIGMA92144Приготовление питательной среды 
лимонная кислота и бычья; H2OSIGMAC1909Подготовка питательной среды 
три-цитрат калия и бык; H2OSIGMA104956Приготовление питательных сред 
ФудР СИГМА1271008Приготовление питательных сред 
динатрий ЭДТАСИГМАЕ1644Приготовление питательной среды 
FeSO4• 7 H2OSIGMA215422Приготовление питательной среды 
MnCl2• 4 H2OSIGMA221279Подготовка питательной среды 
ZnSO4• 7 H2OSIGMA204986Приготовление питательной среды 
CuSO4• 5 H2OSIGMAC8027Подготовка питательной среды 
триптонSIGMA16922Приготовление питательной среды 
Микроскопическая системаNikon Eclipase Ti inverted Микроскопическая визуализация
Научная ПЗС-камераQImaging Ретига-2000Р Быстрый 1394 Микроскопическая визуализация

Ссылки

  1. Parker, J. L., Shaw, J. G. Aeromonas spp. clinical microbiology and disease. Journal of Infection. 62 (2), 109-118 (2011).
  2. Chao, C. M., Lai, C. C., Tang, H. J., Ko, W. C., Hsueh, P. R. Skin and soft-tissue infections caused by Aeromonas species. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 32 (4), 543-547 (2013).
  3. Chao, C. M., Lai, C. C., Tang, H. J., Ko, W. C., Hsueh, P. R. Biliary tract infections caused by Aeromonas species. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 32 (2), 245-251 (2013).
  4. Chuang, H. C., et al. Different clinical characteristics among Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii biovar sobria and Aeromonas caviae monomicrobial bacteremia. Journal of Korean Medical Science. 26 (11), 1415-1420 (2011).
  5. Chao, C. M., Lai, C. C., Gau, S. J., Hsueh, P. R. Skin and soft tissue infection caused by Aeromonas species in cancer patients. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 46 (2), 144-146 (2013).
  6. Chen, P. L., et al. A Disease Model of Muscle necrosis caused by Aeromonas dhakensis infection in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Microbiology. 7, 2058(2016).
  7. Chen, P. L., et al. Virulence diversity among bacteremic Aeromonas isolates: ex vivo, animal, and clinical evidences. PLoS One. 9 (11), 111213(2014).
  8. Saraceni, P. R., Romero, A., Figueras, A., Novoa, B. Establishment of infection models in zebrafish larvae (Danio rerio) to study the pathogenesis of Aeromonas hydrophila. Frontiers in Microbiology. 7, 1219(2016).
  9. Chen, Y. W., Ko, W. C., Chen, C. S., Chen, P. L. RIOK-1 Is a Suppressor of the p38 MAPK Innate Immune Pathway in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Immunology. 9, 774(2018).
  10. Powell, J. R., Ausubel, F. M. Models of Caenorhabditis elegans infection by bacterial and fungal pathogens. Methods in Molecular Biology. 415, 403-427 (2008).
  11. Chou, T. C., et al. Enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7 Shiga-like toxin 1 is required for full pathogenicity and activation of the p38 mitogen-activated protein kinase pathway in Caenorhabditis elegans. Cellular Microbiology. 15 (1), 82-97 (2013).
  12. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  13. Engelmann, I., Pujol, N. Innate immunity in C. elegans. Advances in Experimental Medicine and Biology. 708, 105-121 (2010).
  14. Feinbaum, R. L., et al. Genome-wide identification of Pseudomonas aeruginosa virulence-related genes using a Caenorhabditis elegans infection model. PLoS Pathogens. 8 (7), 1002813(2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

C elegansNGMAeromonas
Оценки вирулентности и патогенез Aeromonas инфекции в Caenorhabditis elegans модели
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.