Методическая статья

Поколение клоны клеток рака для визуализации Telomeric повтор содержащие РНК Терра выразил от одного теломер в живых клеток

DOI:

10.3791/58790

⸱

17 января 2019 г.

 ,  ,  , 
1Laboratory of Cell Biology and Molecular Genetics, Department of Cellular, Computational and Integrative Biology - CIBIO, University of Trento, 2Department of Life Sciences, University of Trieste

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол для создания клоны клеток рака, содержащий MS2 последовательности тег в одной subtelomere. Этот подход, опираясь на системе MS2-GFP, позволяет визуализации эндогенного стенограммы из telomeric повтор содержащие РНК (Терра) выразил от одного теломер в живых клетках.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Теломеры транскрибируется, рождая telomeric повтор содержащих длиной некодирующих РНК (Терра), которой было предложено играть важную роль в биологии теломер, включая формирование гетерохроматин и гомеостаза Длина теломер. Последние результаты показали, что молекулы Терра также взаимодействовать с внутренней хромосомных регионов для регулирования экспрессии генов в мышиных эмбриональных стволовых (ES) клеток. С учетом этих доказательств, РНК флуоресценции в situ гибридизация (РНК-рыбы) анализы показали, что только подмножество Терра стенограммы локализовать на концах хромосомы. Лучшего понимания динамики молекул Терра поможет определить их функции и механизмы действия. Здесь мы описываем метод ярлык и визуализировать сингл теломеры Терра стенограммы в раковых клетках, с использованием системы MS2-GFP. С этой целью мы представляем протокол для создания стабильной клоны, используя линии клеток рака человеческого желудка AGS, содержащий MS2 последовательности, интегрированных в один subtelomere. Транскрипция Терра с меткой MS2 теломер приводит выражение с тегами MS2 Терра молекул, которые визуализируются микроскопии флуоресцирования клеток после совместного выражение MS2 RNA-связывая протеинов, сливается с GFP (MS2-ГФП). Этот подход позволяет исследователям изучить динамику одного теломеры Терра молекул в раковых клетках, и он может быть применен к другим клеточных линий.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Длиной некодирующих Терра РНК транскрибируется из региона subtelomeric хромосом и его транскрипции приступает к концам хромосомы, завершение в течение1,telomeric повторить тракта2. По этой причине Терра стенограммы состоят из subtelomeric производные последовательностей в конце их 5' и прекратить с telomeric повторяется (UUAGGG позвоночных)3. Важные роли были предложены для TERRA, включая формирование гетерохроматин теломеры4,5, ДНК репликации6, поощрение гомологичная рекомбинация среди хромосома заканчивается7,8 , 9, регулирующих теломер структуры10и теломер длина гомеостаза2,11,12,13. Кроме того Терра стенограммы взаимодействуют с многочисленными extratelomeric сайтов для регулирования экспрессии генов широко в мыши эмбриональных стволовых (ES) клетки14. С учетом этих доказательств, флуоресценции в situ гибридизация РНК (РНК-рыбы) анализы показали что только подмножество Терра стенограммы локализовать теломеры1,2,15. Кроме того Терра сообщалось в форме ядерного агрегатов, локализация на X и Y хромосомы в мыши клетки2,16. Эти результаты показывают, что Терра стенограммы пройти сложную динамику в ядре. Понимание динамики молекул Терра поможет определить их функции и механизмы действия.

MS2-GFP системы широко используется для визуализации молекул РНК в живых клетках различных организмов17,18. Эта система использовалась ранее тег и визуализировать сингл теломеры Терра молекул в S. cerevisiae12,19. С помощью этой системы, недавно было показано, что дрожжи Терра стенограммы локализовать в цитоплазме во время пост diauxic сдвиг фазы, предполагая, что Терра могут оказывать extranuclear функций20. Недавно мы использовали MS2-GFP системы для изучения одного теломеры Терра стенограммы в раковых клетках21. С этой целью мы заняты средство редактирования генома ТРИФОСФАТЫ/Cas9 для интеграции MS2 последовательности в одном теломер (теломеры 15q, далее Tel15q) и получены клоны, выражая MS2-тегами эндогенного Tel15q TERRA (Терра-MS2 клоны). Сопредседатель выражение GFP-кварцевое MS2 RNA-связывая белка (MS2-GFP), что признает и связывает MS2 РНК последовательности позволяет визуализации одного теломеры Терра стенограмм в живых клетках21. Цель Протокола, показанные здесь является подробно описать шаги, необходимые для создания клонов Терра-MS2.

Для создания клонов Терра-MS2, мс2 кассету интегрирован в регионе subtelomeric теломер 15q, ниже по течению Терра промоутер региона и транскрипции запуск сайта. Кассета MS2 содержит ген сопротивления неомицин, обрамленная аргона p сайты, и ее интеграции в subtelomere 15q осуществляется с помощью системы ТРИФОСФАТЫ/Cas922. После того, как выбираются трансфекции MS2 Кассетный сингл клоны и subtelomeric интеграции кассеты проверяется методом ПЦР, ДНК последовательности и Южные помарки. Позитивные клоны были заражены Cre выражая аденовирус, чтобы удалить маркер выделения в кассету, оставив только MS2 последовательности и один жидкий кислород p сайта на subtelomere 15q. Выражения с меткой MS2 Терра транскрипты от Tel15q проверяется по RT-ПЦР. И наконец, выражается MS2-GFP синтез белка в Терра-MS2 клоны через ретровирусной инфекции для того, чтобы визуализировать MS2-Терра стенограммы микроскопии флуоресцирования. Терра стенограммы могут быть легко обнаружены РНК-рыба и клеток изображений с использованием telomeric повтор конкретных зондов1,2,15,23. Эти подходы обеспечивают важную информацию о локализации всего населения Терра молекул в одну ячейку резолюции. Поколение клонов, содержащих MS2 последовательности в одном subtelomere позволит исследователей для изучения динамики сингл теломеры Терра стенограмм в живых клетках, которые помогут определить функции и механизмы действия Терра.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Выбор неомицин устойчивостью клонов

  1. Растут AGS клеток в среде Хам F-12_K (Kaighn), с 10% плода Bovine сыворотки (ФБС), 2 мм L-глютамина, пенициллин (0,5 единиц / мл среды) и стрептомицин (0,2 мкг / мл среды) при 37 ° C и 5% CO2. Transfect клетки на 50-60% слияния с sgRNA/Cas9, выражая вектора и MS2 кассету в 1:10 молярное соотношение21.
    Примечание: В параллельных эксперимент, проверьте эффективность трансфекции, transfecting GFP-выражая вектора (то есть, Cas9-GFP вектор). По крайней мере 60-70% эффективность трансфекции должно быть достигнуто.
  2. Следующий день, замените средство культивирования носитель, содержащий неомицин в конечной концентрации 0,7 мкг/мл (селективной среде).
    Примечание: Разделение клетки и заполнения их в селективной среде на следующий день после трансфекции ускорит процесс отбора. Все номера transfected клеток немедленно умрет. Если трансфекции осуществляется в 6 хорошо пластины, в этом случае каждой скважины на 60% слияния будет содержать около 0,7 х 106 клеток, на следующий день, что клетки могут быть разделены из одной скважины до 10 см блюдо содержащие селективной среде.
  3. Держите клетки в селективной среде для 7-10 дней, изменение среды, каждый из, или два дня, до тех пор, пока один клоны являются видимыми.
  4. Выбор ячейки клонов
    1. Подготовьте 96 хорошо пластины, содержащие 10 мкл трипсин 0.25% в каждой скважине.
      Примечание: Подготовить два 96 хорошо плиты в случае более чем 96 клоны, как ожидается, будут собраны.
    2. С использованием микроскопа отметьте положение каждого клона видимым в 10 см блюдо, делая точки в нижней части блюдо с помощью маркера. Каждая точка будет соответствовать колонии быть собраны.
    3. Замените средство культивирования с достаточно фосфат буфер солевой (PBS) образуют тонкую пленку жидкости на клонов и не позволить клетки сухой во время подбора клон.
    4. Выберите один колоний, с помощью пипетки 10 мкл. Присоедините наконечник, содержащий 5 мкл трипсина в колонию и медленно отпустите трипсина, который останется локализованным на колонии. Разрешить трипсина отсоединить клетки за 1 мин, затем очистите колонии с наконечником и всосите его вверх в наконечник.
      Примечание: Во время этой процедуры, листать блюдо немного на одной стороне, поэтому для уменьшения громкости PBS вокруг колонии взял поможет процесс комплектации, избегая разбавления трипсина вокруг колонии. С помощью клон кольцо может также помочь поднимая один клонов.
    5. Место клетки из колонии в колодец 96 хорошо пластины, содержащие 10 мкл трипсин 0.25%.
    6. Инкубировать 5 мин при комнатной температуре, а затем заполнить колодец с 150 мкл селективной среде (ветчина в F - 12K (Kaighn) средний с 10% FBS, 2 мм L-глютамином, пенициллин (0,5 единиц / мл среды), стрептомицин (0,2 мкг / мл среды) и содержащий неомицина на концентрации 0,7 мкг/мл.
      Примечание: Во время инкубации можно выбрать другие клоны. Рекомендуется выбрать столько клоны как можно скорее. Взял больше клонов тем выше будет вероятность выявления положительных.
    7. После того, как все клоны собраны и переданы в 96 хорошо пластины, позволяют клеткам расти в течение нескольких дней в селективной среде среднего Хэм в F - 12K (Kaighn), с 10% FBS, 2 мм L-глютамином, пенициллин (0,5 единиц / мл среды), стрептомицин (0,2 мкг / мл из среды) и содержащий неомицин при концентрации 0,7 мкг/мл при 37 ° C и 5% CO2, до достижения 90% слияния.
  5. Расщепление клонов
    1. Подготовить три 96 также пластины с покрытием с желатином, добавив 100 мкл желатина в колодец, Инкубируйте 30 мин при комнатной температуре, затем промыть два раза с PBS. Эти пластины будет использоваться для экстракции ДНК (ДНК плита) и клонов, блокирование (замораживание пластины).
      Примечание: Желатин будет способствовать вложение из клетки и ДНК к скважинам. В частности желатин покрытие позволит ДНК придерживаться в нижней части скважины во время экстракции ДНК и мыть процедур (см. ниже). Во время процедуры клон расщепление желательно использовать многоканальные пипетки.
    2. После того, как клоны достигают 90% слияния, аспирационная среднего от каждой скважины 96 хорошо плиты, мыть с PBS, 30 мкл трипсин 0.25% в колодец и инкубировать в течение 5 минут при 37 ° C.
      Примечание: Клоны будут растут с разной скоростью, которые также будет зависеть от числа клеток, взял за клон. Таким образом этот шаг будет выполняться в течение нескольких дней, когда различные клоны достигают 90% слияния.
    3. 70 мкл селективной среде за хорошо, срывать скопления клеток, закупорить вверх и вниз внутри скважины, а затем передать пластину gelatinized ДНК, заполнено автоматически с 120 мкл селективной среде за хорошо и 30 мкл gelatinized замерзания пластин преднаполненных именно 30 мкл, 100 мкл h 50 мкл среднего (без выделения).
    4. Место пластину ДНК в инкубаторе и позволяют клеткам расти при 37 ° C и 5% CO2 до 90% слияния.
    5. Добавить что 80 мкл ледяной свежеприготовленные 2 x замораживание среднего (80% FBS и 20% диметилсульфоксида (ДМСО)) в каждой скважине замораживанию пластину, добавить парафина (распыляется с 70% этиловом спирте) поверх плиты так, чтобы запечатать каждой скважины, поместите крышку на вершине и обернуть тарелку с алюминиевой фольгой. Поместите пластины для замораживания при температуре-80 ° C.
    6. 90 мкл селективной среде в колодец, оригинальные 96 хорошо пластины, содержащие клоны, которые были разделены и держать его в культуре до PCR скрининг результаты. Эта пластинка будет использоваться в качестве резервного пластины.

2. Скрининг устойчивых неомицин клонов

  1. Экстракции ДНК от 96 хорошо пластины ДНК.
    1. После того, как клоны, культивируемых в пластину ДНК достигают 90% слияния, вымыть 2 раза с PBS, а затем лизируют с 50 мкл буфера lysis (10 мм трис рН 7,5, 10 мм ЭДТА, 10 NaCl, 0,5% SDS и 1 мг/мл протеиназы K). Крышка с парафина, уплотнение каждый хорошо, положить крышку на обложке с Саран wrap и место при 37 ° C на ночь.
    2. 100 мкл холодного этанола (Et-OH) / раствор NaCl (0,75 М NaCl в 100% этиловом спирте) каждому хорошо и осадка за 6 часов или на ночь при комнатной температуре.
      Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь.
    3. Удалите раствор Et-OH/NaCl, инвертирование пластину и мыть 3 раза с 200 мкл 70% этанола в колодец.
    4. 25 мкл раствора РНКазы A в дистиллированной воде и инкубировать при 37 ° C в течение 1 ч.
  2. Используйте 3 мкл геномной ДНК для амплификации PCR. Выполняйте PCR скрининг выбранного клонов с праймерами, отжиг внутри гена неомицина сопротивления и subtelomere 15q. Амплификации PCR осуществляется с помощью стандартных полимеразы ферментов и протоколы PCR21.
    Примечание: Условия PCR для грунтовки мс2 (MS2-subtel15q-грунт S и MS2 праймер как) и CTR грунтовки (CTR премьер S и CTR праймер как) являются следующие: 98 ° C 20 s шага denaturation, а затем 34 циклов на 98 ° C 10 s, 58° C 20 s, s 72 ° C 15 , используя полимераза фермент в 25 мкл реакция смеси (см. Таблицу материалы). Грунтовка последовательности, указаны в таблице 1.
  3. Запустите ПЦР-реакции на геле агарозы и извлекать диапазоны PCR, полученные из положительных клоны с использованием стандартного геля добыча процедур (см. Таблицу материалы для извлечения гель реагентов).
  4. Анализ ДНК последовательности продукта PCR гель извлекается для подтверждения наличия MS2 последовательности21.
    Примечание: Анализ последовательности могут выполняться с помощью грунтовки, используемые для PCR скрининг.
  5. Южная помарка скрининг ПЦР позитивные клонов
    1. Расти положительных на ПЦР и последовательности блокировки от оригинального 96 хорошо пластины (резервного пластины) 6 хорошо пластин в среде Хэм в F - 12K (Kaighn), с 10% FBS, 2 мм L-глютамином, пенициллин (0,5 единиц / мл среды), стрептомицин (0.2 мкг на клонов Мл среды) и содержащий неомицин при концентрации 0,7 мкг/мл при 37 ° C 5% CO2.
      Примечание: в качестве альтернативы, если некоторые из этих клонов были утрачены, размораживание их от одной из замораживания пластин (см. Протокол 2.6).
    2. Как только клонов при впадении 90% в 6 хорошо плиты, мыть ячейки с PBS и 250 мкл буфера lysis, содержащий 0,5 мкг протеиназы K за хорошо.
    3. Скрип клетки, клетки скребком и передачи lysate в 1,5 мл.
    4. Инкубируйте при 37 ° C для 16 h.
    5. Добавьте 1 mL 100% этанола, встряхнуть и позволить ДНК осадка по крайней мере 2 часа или на ночь при-20 ° C.
      Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь.
    6. Спина в 13400 x g при 4 ° C на 10 мин, отбросить супернатанта и мыть окатышей с 70% этиловом спирте. Пусть воздух гранул сухого при комнатной температуре. В качестве альтернативы используйте вакуумные концентраторы.
    7. Ресуспензируйте ДНК окатышей в 50 мкл дистиллированной воды, содержащей РНКазы A и инкубировать 1 час при температуре 37 ° C.
    8. Дайджест 5-10 мкг геномной ДНК с помощью энзимов ограничения NcoI и BamHI (два независимых пищеварения) в 100 мкл реакции объем инкубации пищеварение реакции при 37 ° C на ночь.
    9. Запуск 4 мкл пищеварение на геле агарозы (0,8% агарозном) для подтверждения полного переваривания.
    10. Добавить 1/10 объема натрия ацетата 3 M раствор pH 5,2 и 2 томов 100% этанола в реакции пищеварение ограничения и инкубировать по крайней мере 2 h или на ночь при 20 ° C до осадок ДНК.
      Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь.
    11. Центрифуга в 13400 x g при 4 ° C в течение 20 мин, отбросить supernatants и мыть окатышей с 70% этиловом спирте. Дайте высохнуть гранулы воздуха при комнатной температуре. В качестве альтернативы используйте вакуумные концентраторы.
    12. Ресуспензируйте окатышей в 20 мкл дистиллированной воды и нагрузки переваривается ДНК на 0,8% агарозном геле.
      Примечание: Для лучшего разрешения переваривается ДНК, подготовить гель минимум 15 см длиной и ночь работать при низком напряжении (̴30 вольт). Электрофорез, настройки должны быть оптимизированы.
    13. На следующий день, пятно гель с ДНК маркировки агентом, например бромид ethidium в конечной концентрации 1 мкл/10 мл, за 30 мин при комнатной температуре и сфотографироваться с правителем недалеко от геля на геле изображений инструмент.
    14. Значение передачи ДНК мембраны нейлона и выполнять мембраны гибридизации с зондом последовательность конкретных MS2, используя стандартные процедуры21.
    15. Оттепель клоны, которые являются положительными на ПЦР, ДНК, последовательности и Южной пятно от одной из двух пластин замораживания (см. следующий шаг).
  6. Размораживание клонов
    1. Подготовка одной тубы 15 мл 5 мл из подогретым Хэм F - 12 K (Kaighn) средний с 10% FBS, 2 мм L-глютамином, пенициллин (0,5 единиц / мл среды) и стрептомицин (0,2 мкг / мл среды) для каждого клона быть разморожен.
    2. Удалите один из замораживания пластин от-80 ° и 100 мкл подогретым F12K полного среднего хорошо содержащие положительные клон быть разморожен.
      Примечание: Эта процедура должна быть выполнена быстро и 96 также плиты должно уделяться сухого льда после того, как каждый клон таял, с тем чтобы другие клоны оставаться замороженными. Это особенно важно, если несколько клонов нужно разморозить от же 96 хорошо пластины.
    3. Трансфер клетки в 15 мл пробирку, содержащую 5 мл среднего и центрифуги на 800 x g 5 мин при комнатной температуре.
    4. Аспирационная среднего, Ресуспензируйте клетки в 500 мкл подогретым полного среднего F12K и передавать каждый клон один колодец 12 хорошо плиты.
  7. Ликвидация гена неомицина сопротивления от кассеты MS2 интегрирована в subtelomere 15q.
    1. Разрешить клоны расти от 12 хорошо пластины до 10 см блюдо в полной F12K среде.
      Примечание: Неомицин не должны включаться в средне-и если не указано иное.
    2. Добавьте Cre выражая аденовирус клетки культивировали в 10 см блюдо при впадении 70% 10 мл полного среднего F12K.
      Примечание: Использование Cre-GFP выражая аденовирус позволит оценки эффективности инфекции, которая должна подходить к 100%. Аденовирусы репликации дефектные будут потеряны после нескольких проходов в культуре.
    3. 48 часов после заражения, разбить ячейки в трех блюд 10 см. Два блюда будет использоваться для проверки удаления гена неомицина негативный выбор, клетки в неомицин содержащих среднего (первый блюдо) и на юге блот (второе блюдо).
    4. Культура третье блюдо, содержащие клон клеток замораживания и извлечение RNA.

3. Проверка Терра MS2 Стенограмма выражения RT-ПЦР

  1. После подтверждения удаления гена неомицина выполните общее извлечение RNA от Терра-MS2 клоны с использованием органических растворителей (раствор фенола и гуанидина isothiocynate)21.
    1. Ресуспензируйте РНК, извлеченные из 10 см блюдо в 100 мкл диэтиловым pyrocarbonate (DEPC) воды.
    2. Запуск 3 мкл РНК на denaturating (1% формальдегида содержащие) 1 x 3-(N-Morpholino) propanesulfonic кислоты (МОПЫ) гель для проверки концентрации и целостность РНК. Также анализ концентрации РНК с помощью спектрофотометра.
    3. Я использую 1 единица DNAse лечения 3 мкг РНК с DNAse я фермента в 60 мкл окончательной реакции тома.
    4. Инкубировать реакции в течение 1 ч при 37 ° C.
  2. Обратный анализ реакции и ПЦР транскрипции
    1. Добавьте следующие компоненты в свободной от нуклеиназы microcentrifuge трубку: 2 мкл праймер конкретных Терра 1 мкм, 1 мкл дНТФ смеси (по 10 мм), 6 мкл DNAse я лечил РНК (соответствующий ̴300ng РНК). Отрегулируйте громкость до 13 мкл с 4 мкл DEPC воды.
      Примечание: Для каждого РНК необходимо проанализировать, вторая трубка, содержащая же реагентов, но ссылка конкретных грунт, вместо конкретных грунтовка Терра, должен быть подготовлен.
    2. Нагрейте смесь до 65 ° C за 5 мин и инкубировать в ice для по крайней мере 1 мин.
    3. Собирать содержание трубы краткий центрифугированием и 4 мкл 5 X RT фермента буфера, 1 мкл 0,1 М Дитиотреитол (DTT), 1 мкл (4 единицы) битор РНКазы и 1 мкл обратной транскриптазы (см. Таблицу материалы).
    4. Проинкубируйте образцы при 42 ° C 60 мин, а затем использовать 2 мкл реакции RT для ПЦР анализа.
  3. Подготовьте смесь реакции ПЦР в окончательном объеме 20 мкл, состоящий из 10 мкл 2 x qPCR Мастер микс, 2 мкл cDNA шаблона, 1 мкл вперед праймера (10 мкм), 1 мкл обратного праймера (10 мкм) и 6 мкл воды.
  4. Выполните ПЦР-реакции в Термоциклер, используя стандартные протоколы21.

4. производство ретровирусом выражая MS2-GFP

  1. Чтобы создать MS2-GFP выражая ретровируса, transfect 80% вырожденная Феникс упаковка клетки с MS2-GFP синтез белка, выражая ретровируса вектор (pBabe-MS2-GFP PURO) и env гена, выражая вектора (например, pCMV-VSVG) с помощью молярное соотношение 4:1 два вектора.
  2. На следующий день замените свежей средних содержащий 10 мм натрия бутират среды культивирования (DMEM дополнена 10% FBS, 2 мм L-глютамина и пера/Strep).
  3. Проинкубируйте 8 ч при 37 ° C, 5% CO2, а затем заменить средство с свежими культивирования средой, из которой вирус будет собрана.
  4. После 48 ч удалите ретровируса содержащих среднего из клеток Феникс. Это средство может использоваться непосредственно для инфекции Терра-MS2 клонов, в этом случае фильтр среды через фильтр 0,45 мкм, добавить Полибрен (конечная концентрация 30 мкг/мл) и добавить его в клетки (в этом случае протокол продолжается в шаге 5). Кроме того ретровируса может химически осажденный в 50 мл трубки сокола, добавив 1/5й объем 50% ПЭГ-8000/900 мм раствор NaCl и инкубации на ночь при 4 ° C на колесе ротатора.
  5. На следующий день, Пелле ретровируса частицы центрифугированием в 2000 x г за 30 мин, удалить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в F12K среде без сыворотки.
    Примечание: В 1/100th оригинального супернатанта тома можно высокомобильна частицы вируса. Тест на инфекции должны быть выполнены для того, чтобы проверить минимальный объем ретровируса, обязаны эффективно заразить клетки.

5. Визуализация Терра MS2 стенограммы в живых клеток

  1. Пластина Терра-MS2 клоны и WT AGS клетки в блюда с прозрачным дном. В день инфекции добавьте Полибрен в средних (конечная концентрация 30 мкг/мл) и выражая ретровируса MS2-GFP.
  2. После 24 часов удалить вирус содержащих среднего и добавить свежие среднего без фенола красный.
  3. Анализируйте клетки на инвертированного микроскопа с помощью параметра соответствующий микроскопа. Изображения клетки с 100 X или 60 X целей с большим числовой апертуры (1.4 X) и с помощью чувствительной камеры (EMCCD). Используете систему экологического управления для поддержания образцов при 37 ° C и 5% CO2 во изображений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рисунок 1 представляет собой обзор экспериментальной стратегии. Основные этапы протокола и ориентировочные сроки для поколения Терра-MS2 клонов в клетках AGS показываются (рис . 1А). В день 1 несколько скважин 6 хорошо плиты являются transfected MS2 кассету и sgRNA/Cas9, выражая вектора (показано на рисунке 1B). Две разные subtelomere руководство 15q спе...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье мы представляем метод для создания человеческих раковых клеток клоны, содержащие MS2 последовательности в рамках subtelomere 15q. Используя эти клоны, мс2 тегами Терра молекул, трансляции из subtelomere 15q распознаются микроскопии флуоресцирования выражением совместного MS2-GFP синтез белка. Этот подход позволяет исследователям изучить динамику Терра, выразил от одного теломер в живых клетках21. В этом протоколе Терра-MS2 клоны выбираются в строке ячейки AGS, который представляет со...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют не конкурирующих финансовых интересов

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарны сотрудникам передовой визуализации объекта CIBIO в университете Тренто и Фондом BioOptics свет микроскопия на Макс ф Perutz лабораторий (MFPL) в Вене. Исследований, приведших к эти результаты получил финансирование от Mahlke-Оберманн Stiftung и седьмой рамочной программы Европейского союза для исследований, технологических разработок и демонстрации соглашению Грант не 609431 в ЕС. EC поддерживается Рита Леви Монтальчини стипендий от итальянского министерства образования университета и исследования (MIUR).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Ячейки AGS-Подарок от Кристиана Барона (Université de Montré al).
F12K Ореховая смесь 1XGIBCO21127022Питательная среда для клеток AGS
L-глутамин CORNINGMT25005CIКомпонент среды для культивирования клеток
Раствор пенициллина стрептомицинаCORNING30-002-CIКомпонент среды для культивирования клеток
Фетальная сыворотка крупного рогатого скотаSigma AldrichF2442Компонент среды для культивирования клеток
DMEM 1XGIBCO21068028среда для культивирования клеток феникса
CaCl2Sigma AldrichC1016используется при трансфекции клеток феникса
HEPESSigma AldrichH3375используется при трансфекции клеток феникса (раствор HBS)
KClSigma AldrichP9333используется при трансфекции клеток феникса (раствор HBS)
DextroseSigma AldrichD9434используется при трансфекции клеток феникса (раствор HBS)
NaClSigma AldrichS7653используется при трансфекции клеток феникса (раствор HBS) и преципитации ретровирусов
Na2HPO4Sigma AldrichS3264используется при трансфекции клеток феникса (раствор HBS)
TRYPSIN EDTA SOLUTION 1XCORNING59430Cиспользуется при расщеплении клеток
DPBS 1XGIBCO14190250фосфатный буферный физиологический раствор Dulbecco
DMSOSigma AldrichD8418Компонент среды для замораживания клеток (80% FBB и 20% ДМСО)
G-418 ДисульфатFormediumG4185селекционный препарат для 
Желатиновый раствор БиореагентSigma AldrichG1393котирование 96 лунок ДНК-пластины и замораживающей пластины
Трис-основаниеFisher Биореагенты10376743Компонент буфера для лизиса клетки для геномной экстракции
ДНК ЭДТАSigma AldrichE6758Компонент буфера для лизиса клеток для экстракции геномной ДНК
SDSSigma Aldrich71729Компонент буфера для лизиса клетки для экстракции геномной ДНК
Proteinase KThermo FisherAM2546Компонент буфера для лизиса клетки для экстракции геномной ДНК
РНКаза AThermo Fisher12091021деградации РНК при экстракции ДНК
AgaroseSigma AldrichA5304ДНК-гель
Atlas ClearSightBioatlasBH40501Реагент для окрашивания, используемый для обнаружения образцов ДНК и РНК в агарозном геле
этанолFisher BioРеагентыBP28184осаждением ДНК
Ацетат натрияSigma Aldrich71196Используется для осаждения ДНК в концентрации 3М pH5.2
Wizard SV Гель и ПЦР Система очисткиPromegaA9282Экстракция фрагментов ПЦР из агарозного геля при ПЦР-скрининге неомицин-положительных клонов
ТризолАМБИОН15596018Органический растворитель используется для экстракции РНК
Dnase ITHERMO SCIENTIFIC89836деградация геномной ДНК из РНК 
dNTPs mixInvitrogen10297018используется в реакциях ОТ и ПЦР
DTTInvitrogen707265MLиспользуется в реакциях
РТ диэтилпирокарбонатSigma AldrichD5758используется для инактивации РНК в воде (разведение 1:1000)
RibolockThermo FisherEO0381Ингибитор РНКазы
MOPSSigma AldrichM9381получение РНК-геля
ПараформальдегидЭлектронная микроскопия Sciences15710Получение денатурирующего РНК-геля (1% PFA в 1x MOPS)
Superscript III Обратная транскриптазаInvitrogen18080-093Реакция ретротранскрипции
Pfu ДНК-полимераза (рекомбинантная)Thermo ScientificEP0501ПЦР
реакция 2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROXPCR BIOSYSTEMSPB 20.14qPCR реакция
Cre-GFP аденовирусhttps://medicine.uiowa.edu/vectorcore1174-HTиспользуется для инфицирования клонов TERRA-MS2 с целью удаления гена neomycn
Бутират натрияSigma AldrichB5887используется для стимулирования производства ретровирусных частиц в клетках феникса
PEG8000Sigma Aldrich89510Precipitation of retrovirus partcles
35&микро;-Стеклянное дночашки Ibidi81158используется для визуализационного анализа живых клеток клонов TERRA-MS2

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Azzalin, C. M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., Lingner, J. Telomeric repeat containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends. Science. 318 (5851), 798-801 (2007).
  2. Schoeftner, S., Blasco, M. A. Developmentally regulated transcription of mammalian telomeres by DNA-dependent RNA polymerase II. Nature Cell Biology. 10 (2), 228-236 (2008).
  3. Diman, A., Decottignies, A. Genomic origin and nuclear localization of TERRA telomeric repeat-containing RNA: from Darkness to Dawn. FEBS Journal. , (2017).
  4. Arnoult, N., Van Beneden, A., Decottignies, A. Telomere length regulates TERRA levels through increased trimethylation of telomeric H3K9 and HP1alpha. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (9), 948-956 (2012).
  5. Montero, J. J., et al. TERRA recruitment of polycomb to telomeres is essential for histone trymethylation marks at telomeric heterochromatin. Nature Communications. 9 (1), 1548(2018).
  6. Beishline, K., et al. CTCF driven TERRA transcription facilitates completion of telomere DNA replication. Nature Communications. 8 (1), 2114(2017).
  7. Arora, R., et al. RNaseH1 regulates TERRA-telomeric DNA hybrids and telomere maintenance in ALT tumour cells. Nature Communications. 5, 5220(2014).
  8. Balk, B., et al. Telomeric RNA-DNA hybrids affect telomere-length dynamics and senescence. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (10), 1199-1205 (2013).
  9. Graf, M., et al. Telomere Length Determines TERRA and R-Loop Regulation through the Cell Cycle. Cell. 170 (1), 72-85 (2017).
  10. Lee, Y. W., Arora, R., Wischnewski, H., Azzalin, C. M. TRF1 participates in chromosome end protection by averting TRF2-dependent telomeric R loops. Nature Structural & Molecular Biology. , (2018).
  11. Moravec, M., et al. TERRA promotes telomerase-mediated telomere elongation in Schizosaccharomyces pombe. EMBO Reports. 17 (7), 999-1012 (2016).
  12. Cusanelli, E., Romero, C. A., Chartrand, P. Telomeric noncoding RNA TERRA is induced by telomere shortening to nucleate telomerase molecules at short telomeres. Molecular Cell. 51 (6), 780-791 (2013).
  13. Moradi-Fard, S., et al. Smc5/6 Is a Telomere-Associated Complex that Regulates Sir4 Binding and TPE. PLoS Genetics. 12 (8), e1006268(2016).
  14. Chu, H. P., et al. TERRA RNA Antagonizes ATRX and Protects Telomeres. Cell. 170 (1), 86-101 (2017).
  15. Lai, L. T., Lee, P. J., Zhang, L. F. Immunofluorescence protects RNA signals in simultaneous RNA-DNA FISH. Experimental Cell Research. 319 (3), 46-55 (2013).
  16. Zhang, L. F., et al. Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells. Genetics. 182 (3), 685-698 (2009).
  17. Gallardo, F., Chartrand, P. Visualizing mRNAs in fixed and living yeast cells. Methods in Molecular Biology. 714, 203-219 (2011).
  18. Querido, E., Chartrand, P. Using fluorescent proteins to study mRNA trafficking in living cells. Methods in Cell Biology. 85, 273-292 (2008).
  19. Cusanelli, E., Chartrand, P. Telomeric noncoding RNA: telomeric repeat-containing RNA in telomere biology. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 5 (3), 407-419 (2014).
  20. Perez-Romero, C. A., Lalonde, M., Chartrand, P., Cusanelli, E. Induction and relocalization of telomeric repeat-containing RNAs during diauxic shift in budding yeast. Current Genetics. , (2018).
  21. Avogaro, L., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics and function of single-telomere TERRA molecules in cancer cells. RNA Biology. , 1-10 (2018).
  22. Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
  23. Yamada, T., et al. Spatiotemporal analysis with a genetically encoded fluorescent RNA probe reveals TERRA function around telomeres. Scientific Reports. 6, 38910(2016).
  24. Deng, Z., et al. Formation of telomeric repeat-containing RNA (TERRA) foci in highly proliferating mouse cerebellar neuronal progenitors and medulloblastoma. Journal of Cell Science. 125 (Pt 18), 4383-4394 (2012).
  25. Casini, A., et al. A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast. Nature Biotechnology. 36 (3), 265-271 (2018).
  26. Nergadze, S. G., et al. CpG-island promoters drive transcription of human telomeres. RNA. 15 (12), 2186-2194 (2009).
  27. Porro, A., et al. Functional characterization of the TERRA transcriptome at damaged telomeres. Nature Communications. 5, 5379(2014).
  28. Farnung, B. O., Brun, C. M., Arora, R., Lorenzi, L. E., Azzalin, C. M. Telomerase efficiently elongates highly transcribing telomeres in human cancer cells. PLoS One. 7 (4), e35714(2012).
  29. Flynn, R. L., et al. Alternative lengthening of telomeres renders cancer cells hypersensitive to ATR inhibitors. Science. 347 (6219), 273-277 (2015).
  30. Scheibe, M., et al. Quantitative interaction screen of telomeric repeat-containing RNA reveals novel TERRA regulators. Genome Research. 23 (12), 2149-2157 (2013).
  31. Bolland, D. J., King, M. R., Reik, W., Corcoran, A. E., Krueger, C. Robust 3D DNA FISH using directly labeled probes. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
  32. Masui, O., et al. Live-cell chromosome dynamics and outcome of X chromosome pairing events during ES cell differentiation. Cell. 145 (3), 447-458 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

TERRAMS2 GFPRNA FISHTRF2 mCherry

Похожие статьи