Мы опишем простой метод для быстрого количественного определения неорганических полифосфат в различных бактерий, в том числе грамотрицательных и грамположительных микобактериальной видов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Опробование для неорганических полифосфат бактерий
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Неорганические полифосфаты (полипы) является биологических полимеров, обнаруженные в клетках из всех сферах жизни и требуется для вирулентности и реакции на стресс у многих бактерий. Есть различные методы для количественного определения полип в биологических материалов, многие из которых являются трудоемкими или нечувствительны, ограничивает их полезность. Мы представляем здесь рациональный метод для квантификации полип в бактерии, используя кремнезема мембраны столбца извлечения оптимизирован для быстрой обработки нескольких образцов, пищеварение полипа с exopolyphosphatase полипа конкретных ScPPX и обнаружение в результате бесплатные фосфат с конфиденциальной основе аскорбиновой кислоты колориметрические assay. Эта процедура является простой, недорогой и позволяет надежный полипа количественной оценки различных видов бактерий. Мы представляем представитель полипа количественной грамотрицательных бактерий (Escherichia coli), грамположительных молочнокислые бактерии (Lactobacillus reuteri) и микобактериальной видов (Mycobacterium smegmatis). Мы также включать простой протокол для очищение сродства никеля мг количества ScPPX, который в настоящее время не имеющиеся.
Введение
Неорганические полифосфаты (полипы) является линейным биополимера единиц связано phosphoanhydride фосфат, встречается во всех сферах жизни1,2,3. В разнообразных бактерий полип имеет важное значение для реакции на стресс, моторику, биопленки, клеточного цикла управления, антибиотикам и вирулентности4,5,6,7,8 ,9,10,11<....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Очищение дрожжи Exopolyphosphatase (ScPPX)
- Преобразование штамм гиперэкспрессия белка E. coli BL21(DE3)31 с плазмида pScPPX26 электропорации32 или33химических превращений.
- Прививок 1 Л lysogeny бульона (LB) содержит 100 мкг мл-1 ампициллин в 2 Л unbaffled колбу с одного Колония BL21(DE3), содержащих pScPPX2 и инкубировать на ночь при 37 ° C без встряхивания, для поглощения в 600 Нм (600) приблизительно 0,3, как измеряется в спектрофотометре.
- Запустите культуры, пожимая (180 об/мин) и Инкубируйте 30 минут при 37....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Ключевые этапы протокола схематически в упрощенной форме на рисунке 1.
Чтобы продемонстрировать использование этого протокола с грамотрицательных бактерий, одичал типа E. coli MG165539 был выросла до середины журнала фазы в богатой среде фунтов при 37 ° C при встряхивании (200 об/мин), затем промыть и инкубированы для дополнительных 2 ч в morpholinopropanesulfonate а.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Протокол, описанные здесь упрощает и ускоряет количественного определения уровней полип в разнообразных бактерий, с типичным набором 24 пробы, принимая около 1,5 ч для полной обработки. Это позволяет быстрого отбора проб и анализа мутант библиотек и упрощает кинетическая эксперименты, измерения накопление полипа с течением времени. Мы продемонстрировали, что протокол работает эффективно на представителей трех разных типов: бактерии по алфавиту, Фирмикуты и актиномицеты, которые славятся своей упругой, трудно лизируют кле.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Этот проект был поддержан Университет штата Алабама в Бирмингеме Кафедра микробиологии запуска средства и NIH Грант R35GM124590 (MJG) и низ Грант R01AI121364 (FW).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| E. coli BL21(DE3) | Millipore Sigma | 69450 | |
| плазмида pScPPX2 | Addgene | 112877 | доступна академическим и другим некоммерческим учреждениям |
| LB бульон | Fisher Scientific | BP1427-2 | E. coli питательная среда |
| ампициллин | Fisher Scientific | BP176025 | |
| изопропил β-D-1-тиогалактопиранизид (IPTG) | Gold Biotechnology | I2481C | |
| HEPES buffer | Gold Biotechnology | H-400-1 | |
| гидроксид калия (KOH) | Fisher Scientific | P250500 | для регулировки pH HEPES-буферных растворов |
| натрия хлорид натрия (NaCl) | Fisher Scientific | S27110 | |
| имидазол | Fisher Научный | O3196500 | |
| лизоцим | Fisher Scientific | AAJ6070106 | |
| хлорид магния (MgCl2) | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Pierce Universal Nuclease | Fisher Scientific | PI88700 | бензоназа (Sigma-Aldrich cat. #E1014) является приемлемым заменителем |
| Model 120 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB-120 | другие методы лизиса клеток (например, френч-пресс) также могут быть эффективными |
| мл хелатирования HiTrap HP колонки | GE Life Sciences | 17040901 | любой никель-аффинной хроматографической колонки или смолы может быть заменен |
| гексагидратом сульфата никеля(II) | Fisher Scientific | AC415611000 | для зарядки колонки HiTrap |
| 0,8 &; m размер пор ацетат целлюлозы шприц фильтры | Fisher Scientific | 09-302-168 | |
| Bradford реактив | Bio-Rad | 5000205 | |
| Трис буфер | Fisher Scientific | BP1525 | |
| Spectrum Spectra/Por 4 RC Диализная мембранная трубка от 12 000 до 14 000 Dalton MWCO | Fisher Scientific | 08-667B | Другие диализные мембраны с MWCO < 30 000 Да также должны работать |
| соляной кислотой (HCl) | Fisher Scientific | A144-212 | для регулировки pH трис-буферных растворов |
| хлорида калия (KCl) | Fisher Scientific | P217500 | |
| глицерина | Fisher Scientific | BP2294 | |
| 10x MOPS средняя смесь | Teknova | M2101 | E. coli питательная среда |
| глюкоза Fisher Scientific | D161 | ||
| одноосновной фосфат калия (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| двухосновной фосфат калия (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| обезвоженный экстракт дрожжей | Fisher Scientific | DF0886-17-0 | |
| триптон | Fisher Scientific | BP1421-500 | |
| гептагидрат сульфата магния | Fisher Scientific | M63-50 | |
| моногидрат сульфата марганца | Fisher Scientific | M113-500 | |
| гуанидин изотиоцианат | Fisher Scientific | BP221-250 | |
| бычья сыворотка альбумин (без протеазы) | Fisher Scientific | BP9703100 | |
| прозрачные плоскодонные 96-луночные планшеты | Sigma-Aldrich | M0812-100EA | любая прозрачная 96-луночная пластина будет работать |
| Tecan M1000 Infinite планшетный ридер | Tecan, Inc. | не применимо | ни один планшетный считыватель, способный измерять поглощение при 595 и 882 нм, будет работать |
| этанол | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| кремнеземная мембрана спин-колонки | Epoch Life Science | 1910-050/250 | |
| этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) | Fisher Scientific | BP120500 | |
| 1,5 мл микрофуге пробирки | Fisher Scientific | NC9580154 | |
| ацетат аммония | Fisher Scientific | A637-500 | |
| сурьма тартрат калия | Fisher Scientific | AAA1088922 | |
| 4 N серная кислота (H2SO4) | Fisher Scientific | SA818-500 | |
| гептамолибдат аммония | Fisher Scientific | AAA1376630 | |
| аскорбиновая кислота | Fisher Научная | AC401471000 |
Ссылки
- Rao, N. N., Gomez-Garcia, M. R., Kornberg, A. Inorganic polyphosphate: essential for growth and survival. Annual Review of Biochemistry. 78, 605-647 (2009).
- Achbergerova, L., Nahalka, J. Polyphosphate--an ancient energy source and active metabolic regulator.....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
