Методическая статья

Проверка структуры и динамики нуклеосом с помощью атомно-силовой микроскопии изображений

DOI:

10.3791/58820

⸱

31 января 2019 г.

 ,  ,  , 
1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Nebraska Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол характеризовать нуклеосома частиц на уровне одной молекулы, используя статические и time-lapse атомно-силовой микроскопии (АСМ) методы визуализации. Функционализация поверхности метод, описанный позволяет для захвата структуры и динамики нуклеосом в с высоким разрешением на наноуровне.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хроматина, который является длинная цепь нуклеосома субблоков, является динамической системы, что позволяет для таких критических процессов репликации ДНК и транскрипции занять место в эукариотических клеток. Динамика нуклеосом предоставляет доступ к ДНК, механизмы репликации и транскрипции и критически способствует молекулярных механизмов, лежащих в основе функции хроматина. Сингл молекулярных исследований, таких как атомно-силовой микроскопии (АСМ) изображений значительно способствовали нашего нынешнего понимания роли нуклеосома структуры и динамики. Текущий протокол описывает шаги, позволяя разрешением AFM методы визуализации для изучения структурных и динамических свойств нуклеосом. Протокол иллюстрируется AFM данные, полученные для центромер нуклеосом, в которых гистонов H3 заменяется его коллегой центромер белков (CENP-A). Протокол начинается с Ассамблеей моно нуклеосом методом непрерывного разбавления. Подготовка подложки слюды, функционализированных с аминопропил silatrane (APS-слюда), которая используется для визуализации нуклеосома имеет решающее значение для AFM визуализации нуклеосом описал и процедура для подготовки субстрата. Нуклеосом на хранение на поверхности APS-слюда сначала отражаются с помощью статических AFM, который захватывает снимок населения нуклеосома. Из анализа этих изображений такие параметры, как размер ДНК, обернутые вокруг нуклеосом может быть измерена, и этот процесс также подробно. Покадровой AFM изображений процедура в жидкости описан для высокоскоростной покадровой AFM, которые могут захватить несколько кадров нуклеосома динамики в секунду. Наконец анализ динамики нуклеосома включение количественной характеристики динамических процессов описаны и проиллюстрированы.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В эукариотических клетках ДНК сильно уплотняется и организованы в хромосомы. 1 первый уровень ДНК Организации в пределах хромосомы является Ассамблея нуклеосом в которых 147 bp ДНК плотно обернутые вокруг гистона octamer ядро. 2 , 3 нуклеосома частицы собираются на длинные молекулы ДНК, образуя хроматина массив, который затем проводится до тех пор, пока блок весьма компактный Хромосома образуется. 4 Разборка хроматина обеспечивает доступ к свободной ДНК требует критического клеточных процессов, например ген транскрипции и генома репликации, предполагая, что хроматина является весьма динамичная система. 5 , 6 , 7 понимание динамических свойств ДНК на различных уровнях хроматина является критически важным для выяснения генетических процессов на молекулярном уровне, где ошибки могут привести к смерти клетки или развитие таких заболеваний, как рак. 8 хроматина свойство большое значение является Динамика нуклеосом. 9 , 10 , 11 , 12 структурных характеристик кристаллографических методами позволило высокой стабильности этих частиц. 2 какие эти отсутствие исследования являются динамические детали нуклеосом как механизм ДНК развертки от гистона ядра; динамичный путь которого необходим для процессов транскрипции и репликации. 7 , 9 , 13 , 14 , 15 , 16 Кроме того, специальные белки, называют ремоделирования факторов было показано для облегчения разборки nucleosomal частиц17; Однако встроенные динамики нуклеосом является критическим фактором в этом процессе, который способствует процессу всей разборки. 14 , 16 , 18 , 19

Одноместный молекула методы, такие как сингл молекула флуоресценции19,20,21, оптических треппинга (пинцет)13,18,,2223 и AFM 10 , 14 , 15 , 16 , 24 , 25 , 26 сыграли важную роль в понимании динамики нуклеосом. Среди этих методов AFM выгоды от нескольких уникальных и привлекательных особенностей. АСМ позволяет визуализировать и характеризуют отдельные нуклеосом, а также более массивы27. От АСМ изображения важные характеристики нуклеосома структуры, такие как длина ДНК, обернутые вокруг гистона ядро может быть измеренной 10,14,,2628; параметр, который является центральным для характеризации нуклеосома распаковки динамики. В прошлом AFM исследования показали нуклеосом высокодинамичных систем и что ДНК может спонтанно развернуть ядро гистона14. Спонтанное разверток ДНК от нуклеосом непосредственно визуализированное AFM, работающих в режиме покадровой, когда изображения делается в водных растворах 14,26,29.

Появление высокоскоростной покадровой инструментария AFM (HS-AFM) сделало возможным для визуализации процесса распаковки нуклеосома миллисекунды шкалы времени 14,15,24. Недавние исследования30 16,HS-AFM центромер конкретных нуклеосом показали несколько новизну нуклеосом, по сравнению с типом канонической. Центромер нуклеосом составляют центромер, небольшая часть критически важное значение для хромосома сегрегации31хромосомы. В отличие от канонических нуклеосом в массовых хроматина гистонов ядро центромер нуклеосом содержит гистона CENP-A вместо гистонов H332,33. В результате этой замены гистон, перенос ДНК в центромер нуклеосом составляет ~ 120 bp вместо ~ 147 bp для канонических нуклеосом; разница, которая может привести к собственный морфологии центромер и канонические нуклеосом массивов34, предполагая, что центромер хроматина проходит выше динамика, по сравнению с навалом, один. Роман динамика, проявленную центромер нуклеосом в HS-AFM16,30 исследования иллюстрируют уникальную возможность непосредственно визуализировать структурных и динамических свойств предоставляемый этот сингл молекула техника нуклеосом. Примеры этих функций будут кратко обсуждены и иллюстрированные в конце документа. Этот прогресс был достигнут благодаря разработке новых протоколов для AFM изображений нуклеосом, а также изменения существующих методов. Цель Протокола, описанные здесь, чтобы этих захватывающих достижений в одной молекулы AFM нуклеосома исследования доступны для всех, кто хотел бы использовать эти методы в своих расследованиях хроматина. Многие из методов, описанных применимы к проблем за изучение нуклеосом и может использоваться для исследования других белков и ДНК систем, представляющих интерес. Несколько примеров таких приложений можно найти в публикации35,36,37,,3839,40,41, 42,,4344,45,46,47,,4849 и перспективы исследований AFM приводятся различные биомолекулярных систем в обзоры29,50,51,,5354.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. непрерывное разбавление Ассамблеи моно нуклеосом

  1. Создавать и очистить примерно 400 субстрат ДНК bp, содержащий вне центру видом 601 нуклеосома позиционирования последовательности. 55
    Примечание: Чтобы ограничить нежелательные формирования ди нуклеосом, каждый «рука» Фланкируя последовательности позиционирования не должен превышать ~ 150 bp.
    1. Использование плазмида pGEM3Z-601 наряду с дизайном праймеры и усилить субстрат ДНК с помощью ПЦР. Для 423 bp субстрата с 122 и 154 bp АРМ длины используется здесь, используйте вперед (5'-CAGTGAATTGTAATACGACTC-3') и обратного (5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3') грунты.
    2. Добавить, пробирки, содержащие реакционную смесь для тепловой циклователь разогретую до 95 ° C. Запустите следующую программу для 33 циклов после первоначального денатурации за 5 мин при 95 ° C: 30 s Денатурация при 95 ° C, 30 s для отжига на 49 ° C, 35 s расширение на 72 ° C. Установите окончательное расширение при 72 ° C для 10 мин после 33 циклов.
    3. Очищайте ДНК из смеси ПЦР, использование коммерчески доступных ПЦР очистка Kit. Когда элюирующие ДНК из столбца очистки PCR, используйте буфер Tris 10 мм (рН 7,5) вместо набора предоставляемых Элюирующий буфер.
      Примечание: Дополнительные заботиться не передавать буферов между очистки шагов. Загрязненных элюента может вызвать вопросы по течению когда измерения концентрации ДНК и/или может изменить Начальная концентрация соли смеси Ассамблеи нуклеосома.
  2. Определение концентрации ДНК путем измерения оптической плотности очищенная ДНК на 260 Нм.
    1. Соберите пустым на спектрофотометр VIS УФ, используя только 10 мм трис рН 7,5 Элюирующий буфер. Собирайте измерение очищенная ДНК.
  3. С концентрация определяется, аликвота 25 пмоль очищенная ДНК в 0,6 мл трубку отцентрифугировать и поместить его в вакуум центрифуги, до тех пор, пока решение едва видна; Это обычно 30 минут до 1 часа.
    Примечание: Субстрат ДНК теперь готова нуклеосома Ассамблеи. В противном случае протокол может быть приостановлена здесь и ДНК хранятся при температуре-20 ° C до использования.
  4. Место отцентрифугировать трубка, содержащая 25 пмоль ДНК на льду и добавить компоненты сборки нуклеосома в таблице 1, в указанном порядке. Когда все компоненты были добавлены, снимите смесь из льда и инкубации при комнатной температуре (RT) за 30 мин.
    Примечание: Очень важно, что содержание соли в буфер штока гистона считается при расчете NaCl необходимы для достижения конечной концентрации 2 М. 15 , 56
  5. Соберите нуклеосом путем уменьшения концентрации соли 2 М смеси до 200 мм, с использованием непрерывный курс разрежения. 57
    1. Заполните шприц с 100 мкл буфера для разведения содержащий 10 мм трис рН 7,5 и поместите его на шприцевой насос.
    2. Прямо иглой шприца через предварительно прокалываться отверстие в крышке отцентрифугировать трубки, обеспечивая контакт производится с Ассамблея смесь (рис. 1).
    3. Запуск насоса шприца в размере 0,75 мкл/мин для 120 мин.
      Примечание: В результате 100 мкл решение содержит 250 Нм нуклеосом и 200 мм NaCl.
    4. Передача смеси кнопку диализа MWCO 10 K и dialyze против 200 мл предварительно охлажденные (4 ° C) низкая соль буфер, содержащий 10 мм трис pH 7.5, ЭДТА 0,25 мм и 2,5 мм NaCl, за 1 час при 4 ° C.
  6. Чтобы оценить содержание дезацетилазы гистонов нуклеосома Ассамблеи, подготовьте разрывными геля SDS-PAGE с разделяющей 15% и 6%, укладка как описано30.
    1. Аликвота 10-20 мкл нуклеосома складе в трубку отцентрифугировать и добавить 4 x буфер Лэмли образца к рабочей концентрации 1-2 x. 58
    2. Как элемент управления повторите этот препарат в отдельном отцентрифугировать трубки для 1-2 мкг акций гистонов. Нагрева образцов при 95 ° C ~ 5 минут.
    3. Загрузите примеры в соседних полос друг к другу на геле. Добавьте буфер образца неиспользуемые полос для содействия даже группа миграции.
    4. Побегите гель на 65 V до тех пор, пока краска фронт движется через штабелируя гель. Когда достигается отделяя гель, увеличить до 150 V и запустить до тех пор, пока краска фронт полностью перешла из геля.
    5. Разбирать прибор электрофореза и аккуратно перенести гель окрашивание контейнер с dd H2O. Пусть сидят на 5 мин с нежным агитации гель. Повторите эту процедуру два раза больше с свежими dd H2O используется каждый раз.
      Примечание: Пятно Кумасси, используемые в настоящем Протоколе не требует типичные крепежные шаги, необходимые для Кумасси пятна (см. Таблицу материалы). Если используется другая подготовка Кумасси, Отрегулируйте крепежный шаги.
    6. Удаление воды из окончательной промывки и добавить достаточно просто пятно для покрытия гель. Пусть гель сидеть с нежным агитации для по крайней мере 1 час.
      Примечание: Для агитации, окрашивание контейнер может помещаться на любой аппарат, который способствует движения пятна над гель также сохраняя гель покрыты в жидкости.
    7. Удалите пятно из контейнера и промойте гель с dd H2O. заменить dd H2O и замочить гель для 30 минут с нежным агитации. (Гель должен появиться как показано на рисунке 2, с четкое разделение полос гистона).
  7. Храните нуклеосом на 4 ° C до использования.
    Примечание: При хранении в этих условиях, нуклеосом остаются стабильными в течение нескольких месяцев. Протокол может быть приостановлена здесь.

2. Функционализация поверхности слюды для AFM статических изображений нуклеосом

  1. Подготовка 50 мм 1-(3-Aminopropyl) silatrane APS Стоковый раствор в деионизированной воде, как описано. 30 магазина 1 мл аликвоты этого решения на 4 ° C до использования.
    Примечание: Аликвоты может храниться более чем за год на 4 ° C. 59
  2. Приготовляют раствор 1: 300 APS рабочих для модификации слюды, растворяя 50 мкл APS складе 50 мм по 15 мл dd H2O.
    Примечание: Этот рабочий раствор можно хранить при комнатной температуре в течение нескольких дней.
  3. Вырежьте 1 x 3 см полоски слюды из высокого качества слюда листов (см. Таблицу материалы для слюда используется здесь).
    1. Проверьте, что кусок подходит при диагонали в кювет. Используйте кончик острые щипчики, лезвие бритвы или скотч, чтобы расщеплять слои слюды, до тех пор, пока стороны свежезаваренным расщепляется и кусок толщиной ~0.1 мм (рис. 3A). Сразу же поместить кусок слюды в кювет APS заполнены и Инкубируйте 30 мин (рис. 3B).
  4. Трансфер кусок слюды в кювет, наполненный dd H2O и замочить на 30 s (рис. 3 c). Полностью высушите обе стороны APS-слюда полосы под потока аргона.
    Примечание: Целлюлозная флизелина и полиэфирных чистых протрите (подробно в материалах рекомендуется вытирать) может использоваться для оказания помощи в впитываемость воды от края слюды, при сушке.
  5. Использование сухой слюда газа в настоящее время для подготовки пробы. В противном случае сохраните часть в чистой, сухой кювет (рис. 3D).
    Примечание: Дополнительные хранения в вакууме за 1-2 h рекомендуется при влажной окружающей среде. Протокол может быть приостановлена здесь.

3. Подготовка образцов нуклеосома на APS-слюда AFM статических изображений

  1. Применять двусторонний скотч для нескольких магнитных шайб и поместите их в сторону.
  2. Вырежьте APS-слюдяные подложки до нужного размера (1 x 1 см квадраты для AFM мм инструмент, используемый здесь). Эти куски в чистой Петри и удержание покрыты.
  3. Подготовка трех разведений в собранном нуклеосом (окончательный нуклеосома концентрации 0.5, 1.0 и 2.0 Нм) с помощью 0,22 мкм фильтруют буфера содержащий 10 мм HEPES pH 7.5 и 4 мм MgCl2.
    Примечание: Чтобы ограничить потери нуклеосом в низкой концентрации выпускных, разведения должно быть сделано одно одновременно, сразу до осаждения на APS-слюда.
  4. Депозит 5-10 мкл разбавленного нуклеосома образца в центре кусок APS-слюда и пусть инкубировать на две минуты. Осторожно промывайте образца с 2-3 мл dd H2O для удаления всех компонентов буфера. После каждого ~0.5 мл dd H2O используется осторожно встряхните слюды, чтобы удалить излишки промывочной воды.
    Примечание: Одноразовые шприц рекомендуется для этого полоща шаг.
  5. Сухое хранение образца под светового потока чистым аргоном.
    Примечание: Образец теперь готова к записи образа или могут храниться в вакууме кабинета или Эксикатор заполненные аргоном. Образцы подготовлены и хранятся как описано образы один год после подготовки без потери качества. Протокол может быть приостановлена здесь.

4. статические АСМ изображения нуклеосом

  1. Смонтируйте AFM наконечник наконечник держателя. Использовать подсказку что имеет константа весны ~ 40 Н/м и резонансной частоты между 300 и 340 кГц (см. Таблицу материалов для кантилеверов, используемый здесь).
  2. Установите образец подготовлен в разделе 3 на сцене AFM, стараясь не связаться с поверхности образца.
  3. Наведите лазер кантилевера до тех пор, пока сумма равна максимальной и отрегулируйте вертикальное и боковое отклонение значения практически к нулю.
  4. Настроить АСМ зонд, чтобы найти ее резонансная частота и отрегулируйте привод амплитуды и устанавливается размер изображения до 100 x 100 Нм. Щелкните включить кнопку, чтобы начать этот подход.
  5. После того, как подошел, постепенно Оптимизируйте Setpoint амплитудой до тех пор, пока на поверхности образца ясно видно. Увеличьте размер сканирования до 1 x 1 мкм и резолюции 512 x 512 пикселей. Нажмите кнопку захват следуют заниматься кнопку, чтобы начать получение изображения.
    Примечание: Изображения на рисунке 4 показаны гладкий фон, который можно ожидать при визуализации этих образцов.
  6. Для анализа нуклеосома образец, откройте захваченные изображения с помощью программного обеспечения инструменты анализа AFM.
    1. Выровнять изображение с помощью вычитание многочленов линии или аналогичные функции.
    2. Задайте таблицу цветов для отражения наименьшее значение для минимального и наибольшее значение для максимум. Учет этих значений для каждого изображения, как они понадобятся позже.
      Примечание: Если эти значения не используются, высота данных будет неверным в последующего анализа как поперечное сечение нуклеосома ядер будет выглядеть как плато равных, а не различной высоты.
    3. Экспортируйте изображение как изображение .tiff на исходный размер. Снимите флажок Параметры, чтобы сохранить изображение с границы или масштаб баров.
    4. Откройте изображение в анализ программного обеспечения способны контурная длина измерения.
    5. Значение x, y и z весы для соответствия изображения.
    6. Как внутренняя длина калибровки измерять и записывать контурная длина свободного ДНК от одного конца до другого. Для этого калибровочный фактор используйте измерения для создания гистограммы и подходят с нормального распределения (Гаусса). Разделите пик центр (xc) по длине подложки в низкопробных пар.
      Примечание: Это значение является изображение конкретных коэффициентов от нанометров до базового пар ДНК.
    7. Измерьте и запишите контурная длина обе руки для каждого нуклеосома от свободного конца руку к центру ядра, для последовательности (рис 5A).
    8. Для каждого ядра нуклеосома, собирать два полноценных ширина на половину максимального значения (FWHM) из перпендикулярно пара основной измерения поперечного сечения (Рисунок 5B среднее двух измерений FWHM и вычесть половину результирующее значение из каждой руки нуклеосома чтобы правильно для измеренной длины от въезда/выезда ДНК к центру ядра, не является частью вытянутой руки.
    9. Разделите каждый вытянутой вычисляемых калибровочный фактор (шаг 4.5.6) для получения длины рукоятки в пар оснований ДНК.
    10. Вычислите степень ДНК, упаковка путем вычитания суммы нуклеосома руку от всего пары длина без оболочки субстрата. Сюжет этих ценностей в виде гистограммы и подходят peak(s) с нормальное распределение (Гаусса) для получения средней оболочку пар оснований ДНК для населения нуклеосома.
    11. Рассчитайте средний нуклеосома высоту от измеренных сечений. Печать это как гистограммы и подходят peak(s) с нормальное распределение (Гаусса) для получения высота нуклеосома населения.

5. промежуток времени AFM визуализации динамики нуклеосома

  1. Смонтируйте кончик AFM на держателе наконечник. Зонд с константой весной приблизительно 0,1 N/m и резонансная частота 7-10 кГц может использоваться (см. список материалов для кантилеверов, используемый здесь).
  2. Приложите 1 x 1 см кусок APS-слюда магнитная шайба, с использованием двойной антипригарные ленты и закрепите шайбу на AFM инструмента.
  3. Разбавьте нуклеосом до 1 Нм концентрации в 0,22 мкм отфильтрованного изображения буфер, содержащий 10 мм HEPES pH 7.5 и 4 мм MgCl2.
  4. Депозит 5-10 мкл разбавленного нуклеосома в центре кусок слюды для 2 минут промыть хранение образца с 20µL визуализации буфера в два раза. После второго полоскания Держите капельку визуализации буфера на поверхности.
  5. Использовать камеру Топ Просмотр найти подсказки и подход к поверхности вручную до тех пор, пока кончик составляет ~ 100-500 мкм от поверхности.
  6. Добавьте дополнительные изображения буфера для заполнения разрыва между кончиком и поверхности. В этом примере примерно 50 мкл буфера изображений достаточно, чтобы заполнить этот пробел. Найти резонанс пик для подсказки.
  7. Начните компьютер контролируемых подход к поверхности. Когда подошел, начните изображений с зоной 1-2 мкм для выбора интересующей области ~ 500 Нм. С этой области интереса выбран регулировка плотности приобретение данных 512 x 512 пикселей.
  8. Отрегулируйте уставки напряжения и управлять параметрами амплитуды для улучшения качества изображения. Бесплатный амплитуда 10 Нм или меньше и скорость сканирования, Гц ~ 2 могут быть использованы для захвата изображения качества. На рис. 6приведен пример нуклеосома динамики захвачен с помощью покадровой AFM.

6. высокоскоростной покадровой AFM визуализации динамики нуклеосома

Примечание: Ниже протокол предоставляется для HS-AFM инструмент, разработанный группой Андо (Университет Каназава, Канадзава, Япония). 60

  1. APS-слюда подготовиться жидких изображений.
    1. Прикрепить стеклянной палочкой на AFM сканера сцену с помощью стеклянной палочкой - клей сканера (см. Таблицу материалы). Пусть этот сухой как минимум 10 мин.
    2. Сделайте ~0.1 мм толщиной круглые кусочки слюды с диаметром 1,5 мм штамповкой им от большого листа слюды. Использовать клей штанги HS-AFM слюды стекла (см. Таблица материалов), чтобы прикрепить этот кусок слюды к стеклянной палочкой на HS-AFM и сухой, нетронутой как минимум 10 минут. Рассекающий удар слои с помощью чувствительных к давлению ленты, до тех пор, пока слой хорошо расколотые рассматривается на ленте.
    3. Разбавьте 1 мкл 50 мм APS акций в 99 мкл dd H2O сделать 500 мкм APS решения. Депозит 2,5 мкл этого решения на поверхности свежезаваренным рассеченного слюды и пусть functionalize за 30 мин.
      Примечание: Для предотвращения высыхания поверхности во время functionalizing, шапочка коническая центрифуги 50 мл трубки можно подходят с влажной кусок фильтровальной бумаги и помещен над сканера. APS запас разбавляется 3 раза меньше, для жидких изображений, чем для статических изображений для контроля динамики к ставке, которая может наблюдаться с AFM.
    4. Промойте слюда с 20 мкл dd H2O, применяя несколько ~ 3 мкл полоскания. Удаление воды полностью после каждого полоскания, поместив нетканый wipe на краю слюды. После окончательной промывки место ~ 3 мкл dd H2O на поверхности и дайте ему сидеть в течение как минимум 5 минут, чтобы удалить любые nonspecifically связанного APS.
  2. Поместите датчик в HS-AFM держатель и положение держателя на сцене AFM с наконечником вверх. Промойте держатель с помощью ~ 100 мкл dd H2O следуют два ~ 100 мкл полоскания 0,22 мкм фильтруют нуклеосом изображений буфера, который содержит 10 мм HEPES pH 7.5 и 4 мм MgCl2.
  3. С делать полоскания заполните камеры с ~ 100 мкл нуклеосома визуализации буфера, погружаясь кончик. Отрегулируйте положение кантилевера до тех пор, пока он ударил с лазером. Промойте APS-слюда с 20 мкл отфильтрованных нуклеосома визуализации буфера, используя ~ 4 мкл на полоскание.
  4. Разбавьте 1 мкл нуклеосома Ассамблея Фонда в 250 мкл отфильтрованных нуклеосома визуализации буфера для окончательного нуклеосома концентрации 1 Нм. Депозит 2,5 мкл этой разрежения на поверхности и дайте ему сидеть за 2 мин ополосните поверхность с ~ 4 мкл нуклеосома визуализации буфера в два раза. После окончательной промывки оставьте поверхность в imaging буфера.
    Примечание: Если поверхность не промывать после сдачи нуклеосома образца, поверхность быстро стать переполнены.
  5. Установка сканера и образец поверх Наконечник держателя таким образом, чтобы образец лицом вниз. Чтобы начать подход, используйте функцию auto подход с амплитудой уставки,s недалеко от свободного колебания амплитуды A0.
    Примечание: В идеале,s =0, однако, на 82%0 будет работать, а если тщательного 0,95.
  6. Настройте точку установки, до тех пор, пока поверхность хорошо отслеживается.
    Примечание: Для сведения к минимуму передачи энергии от кончика AFM нуклеосома образца, амплитуда кантилевера должна храниться, с амплитудой, как низко как 1 Нм оптимальным.
  7. Задать область изображения около 150 x 150 Нм до 200 x 200 нанометр с скорость сбора данных ~ 300 мс за визуализации кадра.
    Примечание: Этот размер изображения обычно достаточно, чтобы захватить Динамика нуклеосом нескольких одновременно. Менее населенных поверхности могут потребовать изменений в эти параметры. Частота кадров предлагается достаточно, чтобы захватить нуклеосома динамики таких циклов, раздвижные и развертки, среди прочего (см. Результаты представитель раздел ниже).

7. анализ динамики нуклеосома захвачен с помощью покадровой AFM

  1. Преобразование изображения из типа данных HS AFM (.asd) .tiff изображений.
    1. Выровнять изображения с помощью AFM системы программного обеспечения для анализа с помощью плоскости или линии функций до тех пор, пока фон имеет единый контраст.
    2. Установите контрастность изображения (цветовая шкала) автоматически.
      Примечание: Контраст может регулироваться вручную для целей представления, но не для анализа. Это вызывает высота детали потеряться в преобразованных изображений.
    3. Сохраните выбранный диапазон изображений в формате .mov. Снимите панель масштаб и границы варианты перед сохранением.
      Примечания: Не делать анализ на изображениях, которые имеют масштаб баров в кадре. Эти изменить размер изображения и приведет к ложных измерений.
    4. Преобразовать файл MOV в tiff изображений с помощью подходящего программного обеспечения (см. Таблицу материалы). Используйте же частота кадров для преобразования, как был использован при создании файла .mov.
  2. Для руку длина контура измерений, откройте изображения в измерение программного обеспечения способны этого измерения типа (см. Таблицу материалы).
    1. Задайте размеры изображения, чтобы соответствовать те, на которых он был взят в плен.
    2. Измерить контурная длина каждого нуклеосома руку от конца рукоятки к центру ядра нуклеосомой и записывать измерения в таблицу (рис. 4A).
    3. Измерьте длину без оболочки субстрат ДНК в рамках после распаковки нуклеосома. Используйте это для кино конкретных калибровка коэффициента Нм/bp, которая используется для нуклеосома упаковка расчеты
    4. Сбор двух профилей поперечных сечений для ядра нуклеосомой и два для голой ДНК (рис. 4B).
    5. Импорт профилей поперечных сечений для программного обеспечения таблицы и нормализовать участков, вычитая наименьшее значение z из всех точек в профиле.
    6. Рассчитать высоту и полную ширину на половину максимального (FWHM) для каждого поперечного сечения и среднего значения из двух профилей для каждого кадра.
  3. Вычесть половину FWHM значения каждого из нуклеосома оружия являются сюжет как точечная наряду с расчетные суммы оружия.
    1. Вычислите среднее контурная длина от ДНК измерений для ДНК в кадрах после распаковки нуклеосома.
    2. Определите коэффициент калибровки Нм/bp путем деления средней контурной длина свободного ДНК пары длина субстрат ДНК. Используйте это значение для вычисления нуклеосома обертывание в каждом кадре, как описано в разделе 5.12.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Моно нуклеосом были впервые подготовлены для AFM изображений эксперименты с использованием метода Ассамблеи непрерывной разрежения (рис. 1). Подготовленные нуклеосом затем были проверены с использованием разрывных SDS-PAGE (рис. 2). Слюда поверхность была следующая функционализированных используя APS, который захватывает нуклеосом на поверхности при сохранении гладкий фон для изображений с высоким разрешением (рис. 3). Нуклеосом был...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол, в описанный выше довольно прост и обеспечивают высокую воспроизводимость результатов, хотя можно отметить несколько важных вопросов. Функционализированных APS-слюда является ключевым субстрат для получения надежных и воспроизводимых результатов. Высокая стабильность APS-слюда является одной из важных особенностей этот субстрат, который позволяет заранее подготовить изображений субстрат для использования, который может быть использован по крайней мере через две недели после готовится. 59 ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Автор взносы: ГУС и MSD разработал проект; MSD собрал нуклеосом. MSD и ZS исполнили AFM экспериментов и анализа данных. Все авторы писали и редактировать рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Плазмида pGEM3Z-601Addgene, Кембридж, MA26656
ПЦР праймерыIDT, Коралвилль, IACustom Order(FP) 5'- CAGTGAATTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'DreamTaq
полимеразаThermoFischer Scientific, Waltham, MAEP0701Каталожный номер для 200 единиц
набора для очистки ПЦРQiagen, Hilden, Германия 28104Каталожный номер для 50 единиц
Tris baseSigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури10708976001Каталожный номер для 250 г
EDTAThermoFischer Scientific, Waltham, MA15576028Каталожный номер для 500 г
(CENP-A/H4)2, рекомбинантный человеческийEpiCypher, Durham, NC16-0010Каталожный номер для 50 мкг
H2A/H2B, рекомбинантный человеческийEpiCypher, Durham, NC15-0311Каталожный номер для 50 мкг
H3 Octamer, рекомбинантный человеческийEpiCypher, Durham, NC16-0001Каталожный номер для 50 мкг
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device Kit, 10K MWCO, 0,1 млThermoFischer Scientific, Waltham, MA69574Каталожный номер для 10 устройств
Sodium ChlorideSigma-Aldrich, St. Louis, MOS9888-500GКаталожный номер для 500 мг
Амикон Ультра-0.5  Центробежные фильтры mL Millipore-sigma, Burlington, MOUFC501008Каталожный номер для 8 аппаратов
HClSigma-Aldrich, St. Louis, MO258148-25MLКаталожный номер для 25 мл
TricineSigma-Aldrich, St. Louis, MOT0377-25GКаталожный номер для 25 г
SDSSigma-Aldrich, St. Louis, MO11667289001Каталожный номер для 1 кг
персульфата аммония (AmmPS) Bio-Rad, Hercules, CA1610700Каталожный номер для 10 г
30% раствора акриламида/Bis, 37,5:1Bio-Rad, Hercules, CA1610158Каталожный номер для 500 мл
TEMEDBio-Rad, Hercules, CA1610800Каталожный номер для 5 мл
4x Lammli протеинового буфера для SDS-PAGEBio-Rad, Hercules, CA1610747Каталожный номер для 10 мл
2-MESigma-Aldrich, Сент-Луис, МиссуриM6250-10MLКаталожный номер для возраста 10 млRuler
Prestained Protein Ladder ThermoFischer Scientific, Waltham, MA26616Каталожный номер для 500 мкл
Bio-Safe™ Coomassie StainBio-Rad, Hercules, CA1610786Номер в каталоге для
1 л нетканых салфеток для чистых помещений: TX604 TechniCloth TexWipe, Kernersvile, NCTX604
Muscovite Block MicaAshevilleMica, Newport News, VAGrade-1
Аминопропилсилатран (APS)Синтезирован как описано в 22
HEPESSigma-Aldrich, St. Louis, MOH4034-25GКаталожный номер для скотча 25 г
Scotch-3M, Сент-Пол, Миннесота
Зонд АСМ TESPA-V2 (для статической визуализации)Зонды АСМ Bruker, Камарильо, Калифорния
Датчик АСМ MSNL-10 (для стандартной покадровой съемки)Зонды АСМ Bruker, Камарильо, Калифорния
Aron Alpha Industrial Krazy GlueToagosei America, West Jefferson, OHAA480Каталожный номер для тюбика 2 г
MgCl2Sigma-Aldrich, St. Louis, MOM8266-100GКаталожный номер для 100 г
Фильтр Millex-GP, 0.22  &микро; mSigma-Aldrich, Сент-Луис, МиссуриSLGP05010Каталожный номер для 10 устройств
BL-AC10DS-A2 AFM зонд (для HS-AFM)Olympus, Япония
Соединение FG-3020C-20 FluoroTechnology Co., Ltd., Кагия, Касугай, Айти, Япония 
Компаунд ФС-1010С135-0,5 FluoroTechnology Co., Ltd., Кагия, Касугай, Айти, Япония 
Многорежимный атомно-силовой микроскопBruker-Nano/Veeco, Санта-Барбара, Калифорния
Высокоскоростная покадровая атомно-силовая микроскопияТосио Андо, Институт нанонаук о жизни, Университет Канадзава, Какума-мати, Канадзава, Япония

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
  2. Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
  3. Clark, D. J. Nucleosome Positioning, Nucleosome Spacing and the Nucleosome Code. Journal of biomolecular structure. 27 (6), 781-793 (2010).
  4. Poirier, M. G., Oh, E., Tims, H. S., Widom, J. Dynamics and function of compact nucleosome arrays. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (9), 938-944 (2009).
  5. Li, B., Carey, M., Workman, J. L. The Role of Chromatin during Transcription. Cell. 128 (4), 707-719 (2007).
  6. Venkatesh, S., Workman, J. L. Histone exchange, chromatin structure and the regulation of transcription. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16, 178(2015).
  7. Lai, W. K. M., Pugh, B. F. Understanding nucleosome dynamics and their links to gene expression and DNA replication. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 18 (9), 548-562 (2017).
  8. Adam, S., Polo, S. ophieE., Almouzni, G. Transcription Recovery after DNA Damage Requires Chromatin Priming by the H3.3 Histone Chaperone HIRA. Cell. 155 (1), 94-106 (2013).
  9. Ahmad, K., Henikoff, S. Epigenetic Consequences of Nucleosome Dynamics. Cell. 111 (3), 281-284 (2002).
  10. Filenko, N. A., Palets, D. B., Lyubchenko, Y. L. Structure and dynamics of dinucleosomes assessed by atomic force microscopy. Journal of amino acids. 2012, 650840(2012).
  11. Hihara, S., et al. Local nucleosome dynamics facilitate chromatin accessibility in living mammalian cells. Cell reports. 2 (6), 1645-1656 (2012).
  12. Jiang, C., Pugh, B. F. Nucleosome positioning and gene regulation: advances through genomics. Nature reviews. Genetics. 10 (3), 161-172 (2009).
  13. Brennan, L. D., Forties, R. A., Patel, S. S., Wang, M. D. DNA looping mediates nucleosome transfer. Nature Communications. 7, https://www.nature.com/articles/ncomms13337 - supplementary-information 13337(2016).
  14. Lyubchenko, Y. L. Nanoscale nucleosome dynamics assessed with time-lapse AFM. Biophysical Reviews. 6 (2), 181-190 (2014).
  15. Miyagi, A., Ando, T., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of nucleosomes assessed with time-lapse high-speed atomic force microscopy. Biochemistry. 50 (37), 7901-7908 (2011).
  16. Stumme-Diers, M. P., Banerjee, S., Hashemi, M., Sun, Z., Lyubchenko, Y. L. Nanoscale dynamics of centromere nucleosomes and the critical roles of CENP-A. Nucleic Acids Research. 46 (1), 94-103 (2018).
  17. Narlikar, G. eetaJ., Sundaramoorthy, R., Owen-Hughes, T. Mechanisms and Functions of ATP-Dependent Chromatin-Remodeling Enzymes. Cell. 154 (3), 490-503 (2013).
  18. Ngo, T. T., Zhang, Q., Zhou, R., Yodh, J. G., Ha, T. Asymmetric Unwrapping of Nucleosomes under Tension Directed by DNA Local Flexibility. Cell. 160 (6), 1135-1144 (2015).
  19. Ruth, B., Wietske, K., Kirsten, M., John van, N. spFRET reveals changes in nucleosome breathing by neighboring nucleosomes. Journal of Physics: Condensed Matter. 27 (6), 064103(2015).
  20. Buning, R., van Noort, J. Single-pair FRET experiments on nucleosome conformational dynamics. Biochimie. 92 (12), 1729-1740 (2010).
  21. Koopmans, W. J. A., Brehm, A., Logie, C., Schmidt, T., van Noort, J. Single-Pair FRET Microscopy Reveals Mononucleosome Dynamics. Journal of Fluorescence. 17 (6), 785-795 (2007).
  22. Brower-Toland, B. D., et al. Mechanical disruption of individual nucleosomes reveals a reversible multistage release of DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (4), 1960(1960).
  23. Bennink, M. L., et al. Unfolding individual nucleosomes by stretching single chromatin fibers with optical tweezers. Nature Structural Biology. 8 (7), 606-610 (2001).
  24. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Chromatin Protocols. Chellappan, S. P. , Springer New York. 27-42 (2015).
  25. Menshikova, I., Menshikov, E., Filenko, N., Lyubchenko, Y. L. Nucleosomes structure and dynamics: effect of CHAPS. International Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 2, 2129-2137 (2011).
  26. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of nucleosomes revealed by time-lapse atomic force microscopy. Biochemistry. 48 (33), 7842-7848 (2009).
  27. Yodh, J. G., Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Woodbury, N., Lohr, D. Evidence for nonrandom behavior in 208-12 subsaturated nucleosomal array populations analyzed by AFM. Biochemistry. 38 (48), 15756-15763 (1999).
  28. Filenko, N. A., et al. The role of histone H4 biotinylation in the structure of nucleosomes. PLoS One. 6 (1), e16299(2011).
  29. Lyubchenko, Y. L. Encyclopedia of Analytical Chemistry. Meyers, R. , John Wiley & Sons, Ltd. Chichester. 1-24 (2013).
  30. Stumme-Diers, M. P., Banerjee, S., Sun, Z., Lyubchenko, Y. L. Nanoscale Imaging: Methods and Protocols. Lyubchenko, Y. L. , Springer. New York. 225-242 (2018).
  31. Cleveland, D. W., Mao, Y., Sullivan, K. F. Centromeres and Kinetochores. Cell. 112 (4), 407-421 (2003).
  32. Rosin, L. F., Mellone, B. G. Centromeres Drive a Hard Bargain. Trends in Genetics. 33 (2), 101-117 (2017).
  33. McKinley, K. L., Cheeseman, I. M. The molecular basis for centromere identity and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (1), 16-29 (2016).
  34. Lyubchenko, Y. L. Centromere chromatin: a loose grip on the nucleosome. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (1), 8(2014).
  35. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Visualization of supercoiled DNA with atomic force microscopy in situ. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (2), 496-501 (1997).
  36. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Aki, T., Adhya, S. Atomic force microscopic demonstration of DNA looping by GalR and HU. Nucleic Acids Research. 25 (4), 873-876 (1997).
  37. Herbert, A., et al. The Zalpha domain from human ADAR1 binds to the Z-DNA conformer of many different sequences. Nucleic acids research. 26 (15), 3486-3493 (1998).
  38. Oussatcheva, E. A., et al. Structure of branched DNA molecules: gel retardation and atomic force microscopy studies. Journal of Molecular Biology. 292 (1), 75-86 (1999).
  39. Gaillard, C., Shlyakhtenko, L. S., Lyubchenko, Y. L., Strauss, F. Structural analysis of hemicatenated DNA loops. BMC Struct Biol. 2 (1), 7(2002).
  40. Potaman, V. N., et al. Unpaired structures in SCA10 (ATTCT)n.(AGAAT)n repeats. Journal of Molecular Biology. 326 (4), 1095-1111 (2003).
  41. Virnik, K., et al. "Antiparallel" DNA loop in gal repressosome visualized by atomic force microscopy. Journal of Molecular Biology. 334 (1), 53-63 (2003).
  42. Pavlicek, J. W., et al. Supercoiling-induced DNA bending. Biochemistry. 43 (33), 10664-10668 (2004).
  43. Karymov, M., Daniel, D., Sankey, O. F., Lyubchenko, Y. L. Holliday junction dynamics and branch migration: single-molecule analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (23), 8186-8191 (2005).
  44. Shlyakhtenko, L. S., et al. Nanoscale structure and dynamics of ABOBEC3G complexes with single-stranded DNA. Biochemistry. 51 (32), 6432-6440 (2012).
  45. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Miyagi, A., Lyubchenko, Y. L. Specificity of binding of single-stranded DNA-binding protein to its target. Biochemistry. 51 (7), 1500-1509 (2012).
  46. Shlyakhtenko, L. S., et al. APOBEC3G Interacts with ssDNA by Two Modes: AFM Studies. Scientific Reports. 5, 15648(2015).
  47. Sun, Z., Tan, H. Y., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. Remodeling of RecG Helicase at the DNA Replication Fork by SSB Protein. Scientific Reports. 5, 9625(2015).
  48. Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. SSB and the RecG DNA helicase: An intimate association to rescue a stalled replication fork. Protein Science. 26 (4), 638-649 (2017).
  49. Zhang, Y., et al. High-speed atomic force microscopy reveals structural dynamics of alpha-synuclein monomers and dimers. Journal of Chemical Physics. 148 (12), 123322(2018).
  50. Lyubchenko, Y. L. DNA structure and dynamics: an atomic force microscopy study. Cell Biochem Biophys. 41 (1), 75-98 (2004).
  51. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. AFM for analysis of structure and dynamics of DNA and protein-DNA complexes. Methods. 47 (3), 206-213 (2009).
  52. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Gall, A. A. Atomic force microscopy imaging and probing of DNA, proteins, and protein DNA complexes: silatrane surface chemistry. Methods in Molecular Biology. 543, 337-351 (2009).
  53. Lyubchenko, Y. L. Nanoimaging methods for biomedicine. Methods. 60 (2), 111-112 (2013).
  54. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Imaging of DNA and Protein-DNA Complexes with Atomic Force Microscopy. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 26 (1), 63-96 (2016).
  55. Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
  56. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Ando, T. Imaging of nucleic acids with atomic force microscopy. Methods (San Diego, Calif). 54 (2), 274-283 (2011).
  57. Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones. Methods in enzymology. 304, 3-19 (1999).
  58. Gallagher, S. R. One-dimensional SDS gel electrophoresis of proteins. Current protocols in immunology. , Chapter 8 Unit 8.4 (2006).
  59. Shlyakhtenko, L. S., Gall, A. A., Lyubchenko, Y. L. Cell Imaging Techniques: Methods and Protocols. Taatjes, D. J., Roth, J. , Humana Press. 295-312 (2013).
  60. Uchihashi, T., Ando, T. Atomic Force Microscopy in Biomedical Research: Methods and Protocols. Braga, P. C., Ricci, D. , Humana Press. 285-300 (2011).
  61. Lyubchenko, Y. L., Gall, A. A., Shlyakhtenko, L. S. Visualization of DNA and protein-DNA complexes with atomic force microscopy. Methods in molecular biology. 1117, 367-384 (2014).
  62. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Proceeding of the Fourth International Workshop: STM-AFM-SNOM: New Nanotools for Molecular Biology. , Foundation Fourmentin-Guilbert. 20-34 (1997).
  63. Kato, M., et al. Interarm interaction of DNA cruciform forming at a short inverted repeat sequence. Biophys J. 85 (1), 402-408 (2003).
  64. Yodh, J. G., Woodbury, N., Shlyakhtenko, L. S., Lyubchenko, Y. L., Lohr, D. Mapping nucleosome locations on the 208-12 by AFM provides clear evidence for cooperativity in array occupation. Biochemistry. 41 (11), 3565-3574 (2002).
  65. Lyubchenko, Y. L., Gall, A. A., Shlyakhtenko, L. S. Atomic force microscopy of DNA and protein-DNA complexes using functionalized mica substrates. DNA-Protein Interactions: Principles and Protocols. , 569-578 (2001).
  66. Lyubchenko, Y. L. Preparation of DNA and nucleoprotein samples for AFM imaging. Micron. 42 (2), 196-206 (2011).
  67. Gilmore, J. L., et al. Single-molecule dynamics of the DNA-EcoRII protein complexes revealed with high-speed atomic force microscopy. Biochemistry. 48 (44), 10492-10498 (2009).
  68. Shlyakhtenko, L. S., et al. Molecular mechanism underlying RAG1/RAG2 synaptic complex formation. J Biol Chem. 284 (31), 20956-20965 (2009).
  69. Suzuki, Y., et al. Visual Analysis of Concerted Cleavage by Type IIF Restriction Enzyme SfiI in Subsecond Time Region. Biophysical. 101 (12), 2992-2998 (2011).
  70. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. J., Li, M., Harris, R. S., Lyubchenko, Y. L. Interaction of APOBEC3A with DNA assessed by atomic force microscopy. PloS one. 9 (6), e99354(2014).
  71. Pan, Y., et al. Nanoscale Characterization of Interaction of APOBEC3G with RNA. Biochemistry. 56 (10), 1473-1481 (2017).
  72. Sun, Z., Hashemi, M., Warren, G., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of the Interaction of RecG Protein with Stalled Replication Forks. Biochemistry. 57 (13), 1967-1976 (2018).
  73. Pavlicek, J. W., Lyubchenko, Y. L., Chang, Y. Quantitative analyses of RAG-RSS interactions and conformations revealed by atomic force microscopy. Biochemistry. 47 (43), 11204-11211 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CENP A

Похожие статьи