Method Article

Проверка структуры и динамики нуклеосом с помощью атомно-силовой микроскопии изображений

DOI:

10.3791/58820

⸱

January 31st, 2019

 ,  ,  , 
1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Nebraska Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол характеризовать нуклеосома частиц на уровне одной молекулы, используя статические и time-lapse атомно-силовой микроскопии (АСМ) методы визуализации. Функционализация поверхности метод, описанный позволяет для захвата структуры и динамики нуклеосом в с высоким разрешением на наноуровне.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хроматина, который является длинная цепь нуклеосома субблоков, является динамической системы, что позволяет для таких критических процессов репликации ДНК и транскрипции занять место в эукариотических клеток. Динамика нуклеосом предоставляет доступ к ДНК, механизмы репликации и транскрипции и критически способствует молекулярных механизмов, лежащих в основе функции хроматина. Сингл молекулярных исследований, таких как атомно-силовой микроскопии (АСМ) изображений значительно способствовали нашего нынешнего понимания роли нуклеосома структуры и динамики. Текущий протокол описывает шаги, позволяя разрешением AFM методы визуализации для изучения структурных и динамических свойств нуклеосом. Протокол иллюстрируется AFM данные, полученные для центромер нуклеосом, в которых гистонов H3 заменяется его коллегой центромер белков (CENP-A). Протокол начинается с Ассамблеей моно нуклеосом методом непрерывного разбавления. Подготовка подложки слюды, функционализированных с аминопропил silatrane (APS-слюда), которая используется для визуализации нуклеосома имеет решающее значение для AFM визуализации нуклеосом описал и процедура для подготовки субстрата. Нуклеосом на хранение на поверхности APS-слюда сначала отражаются с помощью статических AFM, который захватывает снимок населения нуклеосома. Из анализа этих изображений такие параметры, как размер ДНК, обернутые вокруг нуклеосом может быть измерена, и этот процесс также подробно. Покадровой AFM изображений процедура в жидкости описан для высокоскоростной покадровой AFM, которые могут захватить несколько кадров нуклеосома динамики в секунду. Наконец анализ динамики нуклеосома включение количественной характеристики динамических процессов описаны и проиллюстрированы.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В эукариотических клетках ДНК сильно уплотняется и организованы в хромосомы. 1 первый уровень ДНК Организации в пределах хромосомы является Ассамблея нуклеосом в которых 147 bp ДНК плотно обернутые вокруг гистона octamer ядро. 2 , 3 нуклеосома частицы собираются на длинные молекулы ДНК, образуя хроматина массив, который затем проводится до тех пор, пока блок весьма компактный Хромосома образуется. 4 Разборка хроматина обеспечивает доступ к свободной ДНК требует критического клеточных процессов, например ген транскрипции и генома репликации, предполагая, что хрома....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. непрерывное разбавление Ассамблеи моно нуклеосом

  1. Создавать и очистить примерно 400 субстрат ДНК bp, содержащий вне центру видом 601 нуклеосома позиционирования последовательности. 55
    Примечание: Чтобы ограничить нежелательные формирования ди нуклеосом, каждый «рука» Фланкируя последовательности позиционирования не должен превышать ~ 150 bp.
    1. Использование плазмида pGEM3Z-601 наряду с дизайном праймеры и усилить субстрат ДНК с помощью ПЦР. Для 423 bp субстрата с 122 и 154 bp АРМ длины используется здесь, используйте вперед (5'-CAGTGAATTGTAATACGACTC-3') и обратного (5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3') грунты.
    2. Добавить, п....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Моно нуклеосом были впервые подготовлены для AFM изображений эксперименты с использованием метода Ассамблеи непрерывной разрежения (рис. 1). Подготовленные нуклеосом затем были проверены с использованием разрывных SDS-PAGE (рис. 2). Слюда поверхность была следующая функционализированных используя APS, который захватывает нуклеосом на поверхности при сохранении гладкий фон для изображений с высоким разрешением (рис. 3). Нуклеосом был.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол, в описанный выше довольно прост и обеспечивают высокую воспроизводимость результатов, хотя можно отметить несколько важных вопросов. Функционализированных APS-слюда является ключевым субстрат для получения надежных и воспроизводимых результатов. Высокая стабильность APS-слюда является одной из важных особенностей этот субстрат, который позволяет заранее подготовить изображений субстрат для использования, который может быть использован по крайней мере через две недели после готовится. 59 .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Автор взносы: ГУС и MSD разработал проект; MSD собрал нуклеосом. MSD и ZS исполнили AFM экспериментов и анализа данных. Все авторы писали и редактировать рукописи.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Плазмида pGEM3Z-601Addgene, Кембридж, MA26656
ПЦР праймерыIDT, Коралвилль, IACustom Order(FP) 5'- CAGTGAATTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'DreamTaq
полимеразаThermoFischer Scientific, Waltham, MAEP0701Каталожный номер для 200 единиц
набора для очистки ПЦРQiagen, Hilden, Германия 28104Каталожный номер для 50 единиц
Tris baseSigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури10708976001Каталожный номер для 250 г
EDTAThermoFischer Scientific, Waltham, MA15576028Каталожный номер для 500 г
(CENP-A/H4)2, рекомбинантный человеческийEpiCypher, Durham, NC16-0010Каталожный номер для 50 мкг
H2A/H2B, рекомбинантный человеческийEpiCypher, Durham, NC15-0311Каталожный номер для 50 мкг
H3 Octamer, рекомбинантный человеческийEpiCypher, Durham, NC16-0001Каталожный номер для 50 мкг
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device Kit, 10K MWCO, 0,1 млThermoFischer Scientific, Waltham, MA69574Каталожный номер для 10 устройств
Sodium ChlorideSigma-Aldrich, St. Louis, MOS9888-500GКаталожный номер для 500 мг
Амикон Ультра-0.5  Центробежные фильтры mL Millipore-sigma, Burlington, MOUFC501008Каталожный номер для 8 аппаратов
HClSigma-Aldrich, St. Louis, MO258148-25MLКаталожный номер для 25 мл
TricineSigma-Aldrich, St. Louis, MOT0377-25GКаталожный номер для 25 г
SDSSigma-Aldrich, St. Louis, MO11667289001Каталожный номер для 1 кг
персульфата аммония (AmmPS) Bio-Rad, Hercules, CA1610700Каталожный номер для 10 г
30% раствора акриламида/Bis, 37,5:1Bio-Rad, Hercules, CA1610158Каталожный номер для 500 мл
TEMEDBio-Rad, Hercules, CA1610800Каталожный номер для 5 мл
4x Lammli протеинового буфера для SDS-PAGEBio-Rad, Hercules, CA1610747Каталожный номер для 10 мл
2-MESigma-Aldrich, Сент-Луис, МиссуриM6250-10MLКаталожный номер для возраста 10 млRuler
Prestained Protein Ladder ThermoFischer Scientific, Waltham, MA26616Каталожный номер для 500 мкл
Bio-Safe™ Coomassie StainBio-Rad, Hercules, CA1610786Номер в каталоге для
1 л нетканых салфеток для чистых помещений: TX604 TechniCloth TexWipe, Kernersvile, NCTX604
Muscovite Block MicaAshevilleMica, Newport News, VAGrade-1
Аминопропилсилатран (APS)Синтезирован как описано в 22
HEPESSigma-Aldrich, St. Louis, MOH4034-25GКаталожный номер для скотча 25 г
Scotch-3M, Сент-Пол, Миннесота
Зонд АСМ TESPA-V2 (для статической визуализации)Зонды АСМ Bruker, Камарильо, Калифорния
Датчик АСМ MSNL-10 (для стандартной покадровой съемки)Зонды АСМ Bruker, Камарильо, Калифорния
Aron Alpha Industrial Krazy GlueToagosei America, West Jefferson, OHAA480Каталожный номер для тюбика 2 г
MgCl2Sigma-Aldrich, St. Louis, MOM8266-100GКаталожный номер для 100 г
Фильтр Millex-GP, 0.22  &микро; mSigma-Aldrich, Сент-Луис, МиссуриSLGP05010Каталожный номер для 10 устройств
BL-AC10DS-A2 AFM зонд (для HS-AFM)Olympus, Япония
Соединение FG-3020C-20 FluoroTechnology Co., Ltd., Кагия, Касугай, Айти, Япония 
Компаунд ФС-1010С135-0,5 FluoroTechnology Co., Ltd., Кагия, Касугай, Айти, Япония 
Многорежимный атомно-силовой микроскопBruker-Nano/Veeco, Санта-Барбара, Калифорния
Высокоскоростная покадровая атомно-силовая микроскопияТосио Андо, Институт нанонаук о жизни, Университет Канадзава, Какума-мати, Канадзава, Япония

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
  2. Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Nucleosome StructureNucleosome DynamicsAtomic Force MicroscopyAFM ImagingChromatin StructureCENP A NucleosomesTime Lapse AFMMica Substrate PreparationProtein DNA ComplexesSingle Molecule Studies

Related Articles