Анализы для конкретных рост и способность клеток привязки ротавирусной инфекции

РНК-вирусов формируют генетически различных слоев населения, известный как quasispecies¹, потому что их ставка мутации,² , которая выше, чем у организмов, на основе ДНК. Структура населения в quasispecies зависит от генетических факторов народонаселения, включая мутации, давление отбора и генетического дрейфа. Штаммов в пределах одной генетической линии может показать разные фенотипы вследствие генетического разнообразия. Например Rachmadi et al. показали, что чувствительность свободного хлора разных мышиных норовирус штаммов, которые возникли от налета Очищенный сорт S7-PP3³.

Ротавирусы (род ротавирусной инфекции в семье Реовирусы) являются не охватило ds РНК вирусов, образуя quasispecies². Помимо населения генетические факторы, описанные выше геном реаасортации влияет генетического разнообразия ротавирусной, потому что этот вирус имеет 11 сегментированный геном⁴. Ротавирусы причиной диареи главным образом среди детей, и детская смертность в 2013 году были оценены около 250 000⁵. Две вакцины используются в ряде стран и была эффективной в снижении бремени ротавирусной инфекции, но некоторые исследователи сейчас обсуждаем присутствие вакцины побег мутантов,^6,7,,^{8, 9}. характеристика этих мутантов имеет важное значение для понимания механизмов вакцины бежать.

Здесь мы представляем протоколы для двух анализов для оценки конкретных рост и способность клеток привязки ротавирусной инфекции для того чтобы понять фенотипические различия среди штаммов/мутантов. Кривая роста Ротавирусы была представлена в предыдущих докладах¹⁰, но обычно не измеряются параметры роста таких конкретных прирост. Клетки привязки пробирного проведенных ранее включает immunofluorescent окрашивание техника¹¹. Мы показываем здесь проще методы использования assay металлической пластинкы и RT-ПЦР, которые позволяют количественно обсуждать разницу в вирусные фенотипы. Эти методы подходят для характеристики ротавирусной фенотипы и наконец может способствовать строительству новых вакцин эффективны для нескольких генотипов.

1. Средний подготовка

1. Чтобы сделать средство культуры клеток (сыворотка содержащих средний), добавьте 4,7 г орла MEM порошка в 500 мл дистиллированной воды. Обработайте автоклавированием при температуре 120 ° C в течение 20 мин и пусть средних остыть до комнатной температуры. Добавить плода бычьим сывороточным (конечная концентрация: 10%), L-глютамин (2 мм), пенициллин, стрептомицин (1%) и бикарбонат натрия (1.125 г/Л). Хранить при 4 ° C на 1 месяц.
2. Подготовьте сыворотки бесплатная среда для размножения вируса, как описано в шаге 1.1, но без плода бычьим сывороточным. Хранить при 4 ° C на 1 месяц.
3. Для assay металлической пластинкы стерилизация автоклавированием 100 мл орла MEM среды (не содержащих фенол красный). Пусть средний остыть до комнатной температуры, а затем добавить 2% FBS, 2% стрептомицин, пенициллин, 4 мм L-глютамина и 2,25 г/Л NaHCO₃. Хранить при 4 ° C.
4. Для assay металлической пластинкы стерилизации 100 мл 2,5% агарозном геле в автоклаве. Подготовка геля в тот же день проводится assay металлической пластинкы. Храните гель на 47 ° C на водяной бане.

2. клеточная культура

1. Удаление cryotube, содержащих MA104 клеточных линий из контейнера жидкого азота. Поместите cryotube в водяной бане при 37 ° C таять клетки. Добавьте 1 мл суспензии клеток в 20 мл сыворотки содержащих среды в колбе T75. Инкубируйте колбу в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO₂ на 2 или 3 дней.
   Примечание: Около 10⁶ клеток/мл концентрация окончательный клеток в суспензии.
2. Как только монослой клеток достигает 80% confluency, удалить супернатант и вымыть клетки дважды с 5 мл 1 x Дульбекко в PBS (-фосфатный буфер).
3. Добавить 4 мл 0,05% трипсина-ЭДТА в колбу и инкубировать при 37 ° C за 5 мин до отсоединения клетки из колбы. Передать суспензию клеток 15 мл трубки и центрифуги на 190 x g за 5 мин.
4. Отменить супернатант и Ресуспензируйте гранулированных клетки (10⁶ клеток) в 1 мл сыворотки содержащих средних подготовленных в 1.1. Разбавить ресуспензированы клетки в 100 раз с носителя.
5. Добавьте 3 мл суспензии разреженных клеток в каждой скважине 6-ну (для assay металлической пластинкы) или 24-ну пластины (для assay клетки привязки), соответственно. Инкубируйте пластины в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO₂ под насыщенных паров для 2 или 3 дней.
   Примечание: T75 колбу подходит для сбора образцов курс, потому что объем образца супернатант (1 мл) может быть проигнорировано по сравнению с общим объемом супернатанта (30 мл). Тем временем инфекционные титр вируса в каждом супернатант измеряется assay металлической пластинкы, которая обычно проводится с помощью 6-ну тарелку. 24-ну плита используется для assay клетки привязки.

3. конкретные темпы ротавирусной инфекции

Примечание: Ротавирусная резус (RRV, генотип: G3P[3]) используется в настоящем Протоколе, потому что RRV можно быстро и легко образуют бляшки с MA104 клетками.

1. Место трубка, содержащая 1 мл суспензии вирус (10⁷ ОРП/мл) в сыворотке бесплатно средней температуре-80 ° C в водяной бане при 37 ° C, чтобы разморозить. Добавьте 1 мкг/мкл трипсина из поджелудочной железы свиней в 1 мл вирус подвеска (окончательный трипсина концентрация составляет 4 мкг/мл), а затем вихря. Инкубируйте вирус подвеска при 37 ° C и 5% CO₂ под насыщенных паров на 30 мин.
   Примечание: Трипсина из других источников могут быть использованы, но эффект на ротавирус инфективности должен испытываться заранее.
2. Разбавьте активации вируса подвеска с сыворотка свободный средних регулировать кратность инфекции (МВД) 0.1 ОРП/ячейку.
3. Добавить 1 мл суспензии разреженных вирус MA104 клеточных линий (80% притока) в колбе T75 3 дней после ячейки покрытия (2.1), инкубации при 37 ° C для 1 h и осторожно встряхните флакон каждые 15 мин.
4. Затем добавьте 30 мл сыворотки свободный носитель, содержащий 0,13 мкг/мл трипсина из поджелудочной железы свиней в колбу. Инкубируйте настой при 37 ° C и 5% CO₂ под насыщенных паров.
5. Сбор 1 мл супернатант в колбу на 0, 6, 12, 18, 24 и 36 (или 48) h послеоперационные инфекции (hpi) и заменить супернатант в 1,5 мл пробирок с помощью пипетки.
6. Проведение заморозки (-80 ° C) и расплавить на водяной бане при 37 ° C цикла три раза. Затем центрифуга трубы на 12600 x g 10 мин при 4 ° C. Соберите супернатант.
7. Фильтр супернатант с дистиллированной 0.2 мкм фильтр, чтобы удалить часть клетки. Храните супернатанта-80 ° C в холодильнике до применения к assay металлической пластинкы для измерения титр вируса.
8. Место труб, содержащий собранные супернатант (шаг 3.5) в водяной бане при температуре 37 ° C. Добавить 4 мкг/мл трипсина в 1 мл раствора десятикратного разреженных образца и инкубировать при 37 ° C за 30 мин.
9. В течение 30 минут инкубации в 3.8 чтобы начать assay металлической пластинкы для измерения титр вируса, полученные от времени курс образцов (шаг 3.5), вымойте клетки MA104 дважды в 6-ну плита с 2 мл ПБС после удаления сыворотки содержащих среднего.
10. Серийно разбавить инкубирован образцы сыворотки бесплатно среднего и прививать 1 мл разбавленной пробы в каждой скважине. Инкубировать пластину для 90 минут при 37 ° C и 5% CO₂ под насыщенных паров и осторожно встряхивайте пластину каждые 15 мин.
11. После инкубации удалите посевным материалом с 6-ну пластины. Добавьте 4 мкг/мл трипсина в средних, подготовленный в (шаг 1.3). Мягко, но сразу же добавьте 3 мл среды, смешанного с геля агарозы (соотношение составляет 1:1) в каждую лунку.
12. Держите пластины при комнатной температуре для более чем 10 мин (до тех пор, пока гель агарозы становится твердой) и проинкубируйте 2 дней при 37 ° C и 5% CO₂ под насыщенных паров.
    Примечание: Залейте средство, смешанного с агар от края колодца.
13. Добавьте 1 mL 0,015% нейтральные красный раствор разбавляют с ПБС в каждой скважине и Инкубируйте на 37 ° C и 5% CO₂ под насыщенных паров. Удаление краски через 3 ч и инкубировать 1 день при 37 ° C и 5% CO₂ под насыщенных паров.
14. На следующий день, подсчитать количество бляшек в каждой скважине и рассчитать ОРП/мл. Тщательно проверьте слияния клеток перед assay металлической пластинкы заверить налета чисел.

4. клетки привязки Assay

Примечание: Этот протокол основан на докладе Gilling¹³.

1. Добавьте 1 мкг/мкл трипсина из поджелудочной железы свиней в 1 мл вирус подвеска (окончательный трипсина концентрация составляет 4 мкг/мл), а затем вихря (таким же образом как и 2.1). Разбавьте вирус подвеска с сыворотки свободный среднего для регулировки MOI 1 ОРП/клетка.
2. Затем, вымыть клетки MA104 дважды на 24-ну пластины с 1 мл трис амортизированное saline (TBS; 2,53 г/Л Tris база, 6.54 г/Л NaCl, 0,3 г/Л хлористого калия, 0,046 г/л Na₂HPO₄ до 1 Л дистиллированной водой).
3. Прививок 100 мкл разбавленного вирус подвески для каждой скважины 24-ну плиты с клеток и Инкубируйте на 4 ° C 90 мин, с нежным пожимая каждые 15 мин.
4. Удалите вирус посевным материалом и вымыть клетки дважды с 1 мл раствора TBS. Чтобы извлечь двуцепочечные РНК (ds) ротавируса, добавить 140 мкл 1 x PBS и 560 мкл буфера извлечения РНК (см. Таблицу материалы) для каждой скважины. Mix адекватно с пипеткой (около 10 x, или до тех пор, пока туман или загрязнения ячеек в буфере не видел).
5. После восстановления двойной мель РНК (dsRNA) по данным производителя протокол, место 1,5 мл пробирки, содержащие экстракт двуцепочечной ДНК на блоке тепла при 95 ° C за 5 мин до денатурировать двуцепочечной ДНК, а затем сразу же место трубы на льду и инкубировать для более чем 2 мин.
6. Синтез cDNA с помощью обратной транскрипции Кит (см. Таблицу материалы). 4 мкл раствора денатурированного вирусной РНК для ПЦР-пробирки, содержащие 16 мкл смеси (Таблица 1) и тщательно перемешать его с пипетку, чтобы не создавать пузыри. Спин вниз трубы.
7. Выполнение обратной транскрипции с тепловой циклователь на условиях, показано в таблице 2. Если cDNA сразу не используется, храните ПЦР-пробирки, содержащие cDNA в-20 ° C до 1 год.
8. Использовать для количественного PCR праймеры (вперед 5'-ACCATCTACACATGACCCTC-3', обратный; 5'-GGTCACATAACGCCCC-3')¹⁴ и щуп, вставив утоления (ПЦР зонды; 5'- / FAM/ATGAGCACA/утоления/ATAGTTAAAAGCTAACACTGTCAA/ТАМРА-3'), ориентации 963-1049 региона NSP3 генома сегмента Ротавирусная (Ст3 штамм, GenBank: X81436).
   Примечание: Утоления вставляется в зонд, разработанный Цзэн et al.¹⁴
9. Разбавленных стандартных плазмида серийно (10¹ до 10⁶ копий/мл) с ПЦР класс воду в смесь ПЦР (Таблица 3) и сделать главный микс (20 мкл/образец) для ПЦР после таблицы 4.
10. 20 мкл мастер смеси хорошо 96-луночных ПЦР плиты, а затем смешать 5 мкл cDNA образцов или 5 мкл стандартных плазмида, закупорить 10 раз. Начало реакции ПЦР системы в соответствии с условиями, указанными в таблице 4.
11. Чтобы вычислить ротавирусной генома, привязан к поверхности клеток MA104, проводить линейной регрессии между значениями Ct и известный геном количество стандартных плазмида и оценить количество образцов генома. Затем Рассчитайте коэффициент вириона чисел привязки к клеткам (G_t) для тех, кто в первоначальном посевным материалом (₀G).

Обзор двух протоколов для конкретных темпов и клеток привязки assay налета-очищенная RRV штаммов показан на рисунке 1A и 2A, соответственно.

В assay для определенного роста окончательный вирус титр достигает более 107 ОРП/мл при распространении на колбу T75. Если максимальная концентрация меньше чем 107 ОРП/мл, MA104 клетки не могут стать вырожденная или RRV не был активирован, трипсина. Для оценки конкретных прирост с использованием инфекционных блок данных доступны некоторые модели роста. В этом протоколе модифицированных Гомпертца модель12 используется в качестве примера;

где N0 (104 ОРП/мл в этом исследовании) и Nt (104 -108 ОРП/мл) являются инфекционные титр вируса (ОРП/мл) на 0 и т (пример: 0, 6, 12, 18, 24, 36) hpi, соответственно, является асимптотического значения [журнала (N∞/n0 )] (пример: 3-4), мкг-это конкретные темпы [1/ч], e — константа Napier и λ является период задержки [h]. Параметры модели получаются путем расчета функции анализа программного обеспечения, которое уменьшает сумму квадратов разницы между значениями наблюдаемые и смоделированные. В примере на рисунке 1Bконкретные прирост (µ) оценивается в 0.197 [1/ч] и период задержки (λ)-6,61 [h], применяя метод наименее квадратных модифицированная модель Гомпертца и относительной вирус титр в стационарной фазы (начальный титр Вход шкала) (A) — 3,15 [журнала (N∞/n0)]. Мы протестировали 6 клонов ротавирусной инфекции в общей сложности, и расчетные значения конкретных прирост составлял от 0,19 до 0,27 [1/мин]. Эти расчетные значения являются надежными, потому что коэффициент определения значений в модели фурнитуры более чем 0,98.

RRV вирионы привязки к поверхности клетки были около 103 копий/мл (привязка эффективность составила около 1%) при использовании 24-ну пластины для assay клетки привязки (рис. 2B). Assay обычно проводится три раза для каждого образца, и если в образец наблюдается большая вариативность в номер копии, могут возникнуть некоторые проблемы как чрезмерно мойки и недостаточно активация RRV трипсином. Значение Ct ПЦР, превышающей около 36,0 не является предпочтительным и считается ниже предела обнаружения в наших условиях ПЦР.

Таблица 1: Мастер перемешать композиции для синтеза cDNA ротавирусной генома.

Таблица 2: Реакция условие для синтеза cDNA ротавирусной генома.

Таблица 3: Мастер перемешать состав для количественного PCR ротавирусной генома.

Таблица 4: Реакция условие для количественного PCR ротавирусной генома.

Рисунок 1: схема обзор оценки роста ротавирусная и кривая роста ротавирусной. (A) инфекционные единица ротавирусной измеряется с assay металлической пластинкы. (B) кривой (синяя линия) была аппроксимирована модифицированных Гомпертца модели, основанной на данных наблюдений в нашей лаборатории (белый круг). Темпы роста конкретных [µ]; 0.197 [h-1], отстают в период (λ); 6.61 [h], относительная вирус титр на стационарном этапе начальный титр (логарифмическая шкала) 3.15 [журнала (N∞/n0)]. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: Схематичный обзор и представитель результат assay клетки привязки пяти RRV штаммов, очищенного от бляшек в нашей лаборатории. (A) A клетки культуры пластины прививанным с ротавирусом инкубировали при 4 ° C для ингибирования нашествия вирусов в клетки. После инкубации и удаление несвязанных вирусных частиц клеток подсчитать количество геномов, происходящих из связанных вирусных частиц на поверхности клеток с RT-ПЦР. (B) в результате клетки привязки пробирного был отображается как binding КПД (%), который был соотношение связанных вирусных частиц для тех, кто присутствует в посевным материалом. Смелые бар: средний, конца коробки: отклонение квартиль, конец строки: максимальная и минимальная. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Авторы не имеют ничего сообщать.