Мезенхимальных стволовых клеток изолированно от ткани пульпы и культуры совместно с раковых клеток, чтобы изучить их взаимодействия

Мезенхимальных стволовых клеток (МСК), с возможностью дифференциации и вклад регенерации мезенхимальных тканей, таких как кость, хрящ, мышцы, связки, сухожилия и жировой, были изолированы от почти всех тканей взрослого организма^{1 , 2}. Помимо обеспечения гомеостаза ткани, производя резидентов клетки в случае хронического воспаления или травмы, они производят жизненно цитокинов и факторы роста оркестровать ангиогенеза, иммунной системы и тканей ремоделирования³. Взаимодействие MSCs с раком ткани не понятных, но накапливать данные свидетельствуют о том, что MSCs может способствовать посвящения, прогрессии и метастазированием опухоли⁴.

Самонаведения способность MSCs потерпевшего или хронически воспаленной области делает их ценным кандидата на основе стволовых клеток лечение. Однако рак тканей, «никогда не Исцеление ран», также релиз цитокинов, про ангиогенных молекул и жизненно важных факторов роста, которые привлекают MSCs в cancerogenous районе⁵. Хотя есть ограниченное отчеты, показывающие тормозящее действие MSCs на рак роста^6,7, их прогрессии рака и метастазов, поощрение эффекты были широко сообщили⁸. MSCs, прямо или косвенно затрагивают канцерогенеза различными способами, включая подавление иммунных клеток, секретирующих факторы роста/цитокины, которые поддерживают рака пролиферации и миграции, ангиогенных активности и регулирования ^9,эпителия мезенхимальных перехода (EMT)¹⁰. Опухоль среда состоит из нескольких типов клеток, включая рак связанные фибробластов (CAFs) и/или миофибробласты, эндотелиальные клетки, адипоциты и иммунные клетки¹¹. Из них CAFs являются наиболее распространённый тип ячейки в области опухоли секретируют различные chemokines, поощрения роста и метастазирования рака⁸. Было показано, что производные костного MSCs могут дифференцироваться в CAFs в опухоли стромы¹².

Пульпы зуба стволовых клеток (DPSCs), характеризуется как первый зубной ткани производные MSCs Gronthos и др. ¹³ в 2000 году и затем широко расследованы другие^14,15, Экспресс плюрипотентности маркеры как Oct4, Sox2и Nanog¹⁶ и могут дифференцироваться в различные ячейки linages¹⁷. Анализ выражения генов и белков доказал, что DPSCs производить сопоставимые уровни факторов роста/цитокинов с другими MSCs Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), Ангиогенин, фактор роста фибробластов 2 (FGF2), интерлейкина-4 (Ил-4), IL-6, Ил-10, и фактор стволовых клеток (SCF), а также fms как тирозин киназы-3 лиганда (Flt - 3 Л) которые могли бы способствовать ангиогенезу, модулирует иммунные клетки и поддержки раковых клеток миграции и распространения^18,19,20 . В то время как взаимодействия MSCs с раком окружающей среды были хорошо документированы в литературе, отношения между DPSCs и раковые клетки не были оценены еще. В настоящем исследовании мы создали совместно культуру и состояния средство лечения стратегий линии клетки высоко метастатического рака простаты, PC-3 и DPSCs предложить возможные действия механизма стоматологических MSCs в прогрессии рака и метастаз.

Письменного согласия пациентов был получен после утверждения от организационного комитета по этике.

1. DPSC изоляции и культура

1. Передача зубы мудрости, полученных от молодых людей в возрасте от 17 и 20 до 15 мл пробирки, содержащие полный Дульбекко изменения среднего орла (DMEM) [низкий глюкозы DMEM СМИ, дополненная плода бычьим сывороточным (ФБС) 10% и 1% пенициллина/стрептомицина / амфотерицин (PSA) решение], в течение 8 ч после резекции. Держите холодной материал ткани (4 ° C) во время передачи, чтобы избежать потенциальных смерти клетки.
2. Осторожно извлеките ткани пульпы, стерильные извлечения щипцы от центра зуба, место ткани пульпы в среде DMEM холодной полный в 10 см культуры ткани блюда и размельчите их на мелкие кусочки (2-3 мм), скальпель.
   Примечание: Все экспериментальные процедуры должны осуществляться в стерильных условиях в Ламинарный шкаф. Этот неферментативного техника была ранее использованных^21,22,23.
3. Место небольшой целлюлозы тканей внутри тканевой культуры лечение 6-ну пластины и 200 мкл полного DMEM СМИ освещать каждый куски ткани небольшой пульпы.
4. Проинкубируйте культуры ткани скважин при 37 ° C в атмосфере увлажненный воздух (80% влажности) с 5% CO₂ 2 h предоставлять ткани вложение.
   Примечание: Этот шаг может быть продлен до 3-4 ч, контролируя испарения средств массовой информации.
5. Добавьте соответствующие тома (2-2,5 мл) полный DMEM среды скважин и инкубировать при 37 ° C в атмосфере увлажненный воздух с 5% CO₂ для клеток для распространения из ткани.
   Примечание: Клетки становятся видимыми после примерно 4 дня и достичь confluency после 8-9 дней.
6. Когда клетки достигают 80% confluency, извлеките из 6-ну плиты, мыть с 2 мл-фосфатный буфер (PBS) и добавить 2 мл трипсина. Проинкубируйте 2 мин в инкубаторе при 37 ° C с атмосферой увлажненный воздух и 5% CO₂. Затем добавьте 2 мл полного среднего DMEM, следуют 2 мин инкубации подавляют трипсина. Центрифуга клетки на 300 x g за 5 мин до Пелле клетки.
7. Проход ячейки колбы в полной DMEM СМИ и хранилище для дальнейших экспериментов. Добавить 15 мл полного DMEM СМИ T-75 колб и передачи клетки из двух скважин 6-ну пластины для одной фляги T-75 и инкубировать при 37 ° C с атмосферой увлажненный воздух и 5% CO₂.

2. характеристика DPSCs

1. Морфологический анализ.
   1. Клетки (шаг 1.6) семян в культуре ткани с покрытием колбы (или 6-ну пластины) в полной среде DMEM для по крайней мере 8 ходов соблюдать морфологии клеток.
   2. Визуализировать клетки в световой микроскоп и определить морфологию фибробластоподобных клеток. Клетки должны прикрепить к блюдам культуры и имеют морфологию шпинделя подобных клеток.
      Примечание: в качестве альтернативы, клетки могут быть культивировали как отдельные клетки на срок до 14 дней в колодец пластины наблюдать колонии формирования потенциала, который является характеристикой конкретного фибробластов и MSCs.
2. Выполнение анализа поверхности маркер.
   1. Trypsinize клетки от шаге 1.7. Извлеките из T-75 колбу культуры ткани, стирать с 2 мл PBS и добавить 2 мл трипсина. Проинкубируйте 2 мин в инкубаторе при 37 ° C с атмосферой увлажненный воздух и 5% CO₂. Затем добавьте 2 мл полного среднего DMEM, следуют 2 мин инкубации подавляют трипсина. Центрифуга клетки на 300 x g за 5 мин до Пелле клетки.
   2. Исправьте клетки с параформальдегида 4% за 20 мин при комнатной температуре в 1,5 мл пробирок и затем вымыть их с 500 мкл PBS 3 раза для удаления параформальдегида.
   3. Инкубируйте фиксированные ячейки с антителами против CD29, CD34, CD14, CD45, CD90, CD105, CD166 и CD73 за 1 час при температуре 4 ° C в 100 мкл PBS.
      Примечание: Концентрация антител используемых-0,5 мкг/мл. CD34, CD14, CD45 используются и как негативные маркеры, а CD29, CD90, CD105, CD166 и CD73 используются как положительный клеточный поверхностных маркеров для MSCs.
   4. Вымыть клетки 3 раза с PBS и использовать соответствующие вторичные антитела флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC), фикоэритрин (PE), и т.д. для маркировки. Инкубируйте клетки с вторичные антитела 1: 500 разбавляют в 100 мкл PBS для 30 мин при температуре 4 ° C и стирка 3 раза с PBS.
   5. Хранить пробы в темноте для потока cytometry анализ и выявить положительные и отрицательные пятнать подачей cytometry.
      Примечание: Используйте клетки неокрашенных управления организовать вперед и боковых скаттер. Расположите стробирования из положительно окрашенных населения, исключая мёртвые клетки, мусора и снимите цветного населения. Использовать 100 мкм сопло с 45 psi оболочка давление и собирать 10000 событий, чтобы определить положительные DPSCs путем организации каналов.
3. Выполняют дифференциация DPSCs.
   1. Семян 1 × 10⁴ клетки на 24-ну пластин в полное DMEM СМИ и инкубировать в течение 24 ч при 37 ° C в атмосфере увлажненный воздух с 5% CO₂.
   2. Сформулировать дифференциация носителей с помощью конкурировать среде DMEM как базового средства массовой информации. Подготовьте Остеогенные СМИ путем смешивания 100 Нм дексаметазон, 10 мм β-метронидазол и аскорбиновой кислоты 0,2 мм. Подготовьте хондрогенном СМИ, смешивая 1 × инсулин трансферрина селен (СТС-G), 100 Нм дексаметазон, 100 нг/мл, преобразовывая фактор роста бета (TGF-β), аскорбиновой кислоты 14 мкг/мл и 1 мг/мл, бычьим сывороточным альбумином (БСА). Подготовьте адипогенном СМИ, смешивая 100 Нм дексаметазон, 5 мкг/мл инсулин, 0.5 мм 3-изобутил-1-метилксантина (IBMX) и 60 мкм индометацином.
      Примечание: Дифференциация СМИ могут храниться при температуре 4 ° C для по крайней мере одной недели.
   3. Изменения роста костно-, Хондро-или adipo генной дифференциации СМИ и медиа обновления два раза в неделю в течение двух недель.
   4. Подтвердите дифференциация по фон Kossa и Альциановый синий окрашивание, активность фермента (активность щелочной фосфатазы), иммуноцитохимии и количественных полимеразной цепной реакции (ПЦР) анализы согласно ранее описанные протоколы²¹.
      1. Фон Kossa и Альциановый синий stainings на клетки, которые крепятся с помощью параформальдегида 4% при комнатной температуре на 10 мин мыть фиксированные ячейки с PBS и выведение их с vonKossa комплект в соответствии с рекомендациями изготовителя наблюдать отложения кальция .
      2. Подготовьте Альциановый синий окрашивание раствора путем растворения 1.00 g Альциановый синий краситель в 100 мл уксусной кислоты 3% (v/v) для дальнейшего окрашивания. Вымойте фиксированные ячейки с PBS и запятнать клетки для 30 мин раствором Альциановый синий. Визуализируйте окрашенных образцов в световой микроскоп.

3. Подготовка среднего состояния (CM)

1. Замените СМИ клеток от шаге 1.7 свежий полный DMEM 24 h до коллекции см.
   Примечание: Рекомендуется проход 2-4.
2. Соберите условие среднего (см) от искусственного DPSCs, когда клетки достигают 80% confluency. Центрифуга собранных средств массовой информации на 300 g x 5 мин для удаления отходов ткани материала и ячейки мусора.
   Примечание: в качестве альтернативы используйте 0,2 мкм шприц фильтры для удаления мусора из состояния среды.
3. Супернатант собирать и хранить при температуре от-20 ° C для дальнейших экспериментов.
   Примечание: Держите супернатант в-80 ° C для длительного хранения.

4. лечение раковых клеток с см.

1. Выполните анализ жизнеспособности клеток.
   1. Семя PC-3 клетки (клетки человека рак простаты) на 96-луночных пластин на плотность клеток 5 × 10³ клеток/скважины в полное DMEM и инкубировать в камере увлажненной при 37 ° C и 5% CO₂ на 24 часа.
   2. Лечить клетки с 10, 20, 30, 40 и 50% см (v/v), смешанного с полным DMEM за 24 ч.
   3. Измерения жизнеспособности клеток с помощью 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxy-phenyl)-2-(4-sulfo-phenyl)-2H-tetrazolium (МТС)-проба как описано ранее,²⁴.
2. Выполняйте терминала deoxynucleotidyl dUTP трансферазы Ник конце маркировки (TUNEL) анализа.
   1. PC-3 клетки семян на культуры клеток 6-ну пластины на плотность ячеек 2 × 10-⁵ клеток/Ну и инкубировать в камере увлажненной при 37 ° C и 5% CO₂ на ночь.
   2. Смешайте 20% CM (v/v) с завершить DMEM среднего и применить к ячейкам на 24 часа.
   3. Trypsinize клетки и приостановить в 50 мкл реакционной смеси TUNEL (маркировка решения + решение фермента, поставляется с комплектом) и инкубировать при 37 ° C 60 мин в атмосфере CO₂ увлажненные и 5%.
      Примечание: Для trypsinization, извлеките из 6-ну клетки культуры плиты, мыть с 1 мл раствора PBS и 500 мкл трипсина. Проинкубируйте 2 мин в инкубаторе при 37 ° C с атмосферой увлажненный воздух и 5% CO₂. Добавьте 1 mL полного среднего DMEM, следуют 2 мин инкубации подавляют трипсина. Центрифуга клетки на 300 x g за 5 мин до Пелле клетки.
   4. Промойте с PBS и анализа клеток в PBS с помощью проточной цитометрии.
3. Анализ ПЦР.
   1. PC-3 клетки семян на культуры клеток 6-ну пластины на плотность ячеек 2 × 10-⁵ клеток/Ну и инкубировать в увлажненные инкубатора при 37 ° C и 5% CO₂ на ночь.
   2. Смешайте 20% CM (v/v) с завершить DMEM среднего и применить к ячейкам на 24 часа.
   3. Trypsinize клетки и собирать Пелле ячейки для изоляции и cDNA синтез РНК.
      Примечание: Удалить СМИ от 6-ну клетки культуры плиты, мыть с 1 мл раствора PBS и 500 мкл трипсина. Проинкубируйте 2 мин в инкубаторе при 37 ° C с атмосферой увлажненный воздух и 5% CO₂. Добавьте 1 mL полного среднего DMEM, следуют 2 мин инкубации подавляют трипсина. Центрифуга клетки на 300 x g за 5 мин до Пелле клетки.
   4. Выполните ПЦР эксперименты согласно ранее описанных протокол²⁵.
4. Выполнение миграции клеток раковых клеток.
   1. Семян 1 × 10-⁵ PC-3 клетки на 12-ну пластин и инкубировать в увлажненные инкубатор на ночь при 37 ° C и 5% CO₂.
   2. Поцарапать клетки с наконечником стерильные 200 мкл и изменения среднего сразу с свежей среды, содержащие различные концентрации см [например, 10, 20, 30, 40 и 50% см (v/v), смешанного с полным DMEM].
   3. Наблюдать за царапин под инвертированным микроскопом и принимать фотографии в разные временные интервалы (0 до 24 ч).
   4. Мера скретч закрытие с помощью изображений J программного обеспечения, используя формулу:
      
      Примечание: Откройте скретч изображение с изображением J программного обеспечения. Нарисуйте линию, которая имеет ту же величину, как линейки шкалы, которая уже существует в изображении. Нажмите кнопку анализировать, задать масштаб и соблюдать расстояние в пикселях, как увеличение нарисованные линии. Написать размер линейки шкалы в известных расстояние часть, организовать блок (пиксели, см и т.д.) и нажмите кнопку ОК. Перейдите в раздел анализ снова и нажмите на измерениях. Сначала это даст размер линейки шкалы как выбранной единицы. Нажмите на один край нуля и перетащите до достижения другой конец нуля. Обратите внимание на значение для каждой точки времени (0-h и 24 h). Подключите эти значения в формулу выше и рассчитать скретч закрытия.

5. клетки миграции косвенный контакт раковых клеток и DPSCs

1. Семенной 3 × 10⁴ DPSCs на 24-ну пластины пластины с 0,4 мкм поры и инкубировать в увлажненные инкубатор на ночь при 37 ° C.
2. PC-3 клетки семян на 24-ну плиты на плотность клеток 5 × 10⁴ и инкубировать в увлажненные инкубатор на ночь при 37 ° C и 5% CO₂.
3. Скретч-PC-3 клетки с наконечником стерильные 200 мкл, изменения среды с свежие среднего и место вставки, перевозящих DPSCs на PC-3 клетки.
4. Соблюдать клетки под инвертированным микроскопом и принимать фотографии на различные промежутки времени (0-24 ч) для анализа миграции клеток.

6. совместно культура пробирного и Cytometry анализ потока

1. Ярлык PC-3 клетки и DPSCs с помощью PKH67 (зеленый) и PKH26 (красный) люминесцентные клеток компоновщика красители, соответственно²⁶.
2. Trypsinize DPSCs и PC-3 клетки, соответственно. Извлеките из T-75 культуры ткани колбу, мыть с 2 мл PBS и добавить 2 мл трипсина. Проинкубируйте 2 мин в инкубаторе при 37 ° C с атмосферой увлажненный воздух и 5% CO₂. Добавьте 2 мл полного среднего DMEM, следуют 2 мин инкубации подавляют трипсина.
3. Центрифуга клетки на 300 g x 5 минут, удалить супернатант и Ресуспензируйте клеток окатышей в раствор красителя, подготовленный в буфере разбавителя C поставляется комплект (см. Таблицу материалы).
4. Инкубировать клетки в раствор красителя для 10 мин и прекратить окрашивание реакции, добавив 100 мкл FBS. Центрифуга клетки на 300 g x 5 минут, удалить супернатант и вымыть клетки с полный рост среднего до совместного культивирования.
5. Плита с надписью клетки (5 × 10-4/также) на 6-ну пластин в соотношении 1:1 (DPSCs: PC3). Поддерживать совместно культивируемых клеток в полной DMEM.
6. Соберите клетки после 48 ч или 24 ч инкубационных периодов центрифугированием клеток на 300 x g 5 мин и мытье с PBS.
7. Ресуспензируйте клетки в 300 мкл флуоресценции активированный ячейки, сортировка буфера (FACS) в 5 мл вокруг нижней цитометрии расходомерных трубок. Вихрь разойтись агрегаты клеток прямо перед анализа проб.
8. Используйте 100 мкм насадку с 45 psi давление оболочкой.
   Примечание: Очень высокий расход потока может уменьшить чувствительность флуоресценции обнаружения.
9. Используйте неокрашенных управления и единого цветные ячейки для настройки соответствующих вперед и стороне точечных лазерных напряжения типов клеток и компенсации, как упоминалось ранее²⁷.
   Примечание: Использование стробирования для живых клеток исключить ячейки мусор, мертвые клетки или агрегатов.
10. Собирать 10 000 событий (100,000 предпочтительно) определить процент положительных DPSCs зеленый и красный PC-3 клетки, устраивая FL-1 (зеленый) и FL-2 (красный) каналы.

Рисунок 1 изображает общие характеристики MSC DPSCs в условиях культуры. DPSCs оказывают морфология фибробластоподобных клеток после покрытия (Рисунок 1B). MSC поверхностные антигены (CD29, CD73, CD90, CD105 и CD166) очень выражаются во время гемопоэтических маркеры (CD34, CD45 и CD14) являются отрицательные (рис. 1 c). В DPSCs культуре следуют дифференциация коктейль приложения (рис. 1 d)наблюдаются изменения на уровне молекулярных и морфологических связанных с костно-Хондро- и adipo генной дифференциации.

Для определения активности молекул выделяется от DPSCs по миграции и пролиферации клеток рака простаты, мы применили см, который собирается из искусственного Стоматологическая стволовых клеток и проанализированы пролиферации клеток рака и мигрирующих поведение. СМ лечение (20% v/v) был выбран на основе анализа жизнеспособности клеток МТС. PC-3 клетки, получавших стволовых клеток см были подвергнуты TUNEL пробирного и ПЦР анализ для определения регулирования смерти и apoptotic клеток под контролем и экспериментальных условиях. Мы пришли к выводу, что см лечение повышает жизнеспособность клеток и сокращение гибели клеток в культуре PC-3 клетки. Для оценки ли см DPSCs влияет на PC-3 рак клеток миграции был проведен ex vivo миграции assay клетки (царапинам проба). Лечение с концентрацией 10% и 20% CM (v/v) увеличение нуля закрытие значительно по сравнению с контрольной группой на 24 ч (рис. 2). Аналогичным образом 20% CM (v/v) лечения индуцированных upregulation внеклеточная матрица белка гена выражения, такие как коллаген I, фибронектин и Ламинин, которые играют значительную роль в миграции клеток.

Мы использовали два различных культуры методы для установления прямых и косвенных Сопредседатель культур PC-3 клетки и DPSCs условиях ex vivo . Транс ну система была выбрана для создания среды косвенного взаимодействия для PC-3 клетки рака. PC-3 клетки были посеяны на нижней части хорошо пластины и вставок, перевозящих DPSCs были размещены на верхней части. Потому что мы стремились создать в прямое взаимодействие, транс ну мембраны с 0,4 мкм поры были использованы для предотвращения движения физические клетки DPSCs из верхней части в нижней части через мембрану. Выделяется молекул из DPSCs увеличился нуля закрытие PC-3 клетки значительно по сравнению с клетки управления. PC-3 клетки культивировали совместно с DPSCs продемонстрировал 51% нуля закрытия хотя клетки управления закрытия 38% после 24 часов (рис. 3A). Прямого Совместно культур, содержащих соотношение 1:1 DPSCs и PC-3 клетки были использованы для анализа самоорганизации стволовых клеток и клеток рака. Клетки окрашивали красителями красной и зеленой мембраны для различения различных типов клеток под микроскопом. PC-3 клетки, окрашенных с красной флуоресцентной краской были окружены DPSCs ламповую структуры после инкубационного периода 24 h. Совместно культивируемых клеток окрашенных с флуоресцентными красителями были проанализированы проточной цитометрии, основанный на окрашивание флуоресценции, и соотношения ячеек были обнаружены. DPSCs и PC-3 клетки создана хорошо организованная структура, в которой PC-3 клетки распространяются быстро после 48 ч (рис. 3B). Хотя клетки были посеяны в равной пропорции (1:1) для прямого сотрудничества культуры, 62.22% PC-3 клетки были определены после 48 ч инкубации, указав более высокие темпы распространения PC-3 клетки.

Рисунок 1: характеристика пульпы зуба стволовых клеток (DPSCs). (A) целлюлозы ткани, полученные от центра зуба. (B) фибробластоподобных клеток морфология DPSCs. шкалы бар: 100 мкм. (C) потока cytometry анализ DPSCs. CD29, CD73, CD90, CD105 и CD 166 являются позитивные поверхностных маркеров, а CD14, CD34, и CD45 негативные поверхностных маркеров. NC: отрицательный контроль (роста среднего лечения клетки). (D) дифференциация DPSCs для типов мезенхимальных клеток было подтверждено с фон Kossa, окрашивание, Альциановый синий окрашивание и липидного капель (шкалы бар: 200 мкм). Остеокальцин, коллаген типа II (Col II) и белок, связывающий жирные кислоты 4 (FABP4) immunostainings показал костно - Хондро- и адипогенном дифференциация DPSCs. Шкала бар: 200 мкм. Эта цифра приспособлен от Доган и др. 34. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: коллекции состояния среды (CM) от DPSCs для анализа клеток жизнеспособность и нуля. TUNEL позитивные клетки были снижены на 20% CM (v/v) приложения. Количественное измерение скретч закрытия показал, что см ростом миграции PC-3 клетки. СМ: кондиционером среднего; NC: отрицательный контроль (роста среднего лечения клетки). * P < 0,05. Эта цифра приспособлен от Доган и др. 34. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: методология для assay переноса транс ну клетки и Сопредседатель культуры. (A) PC-3 клетки скретч закрытие в системе Транс ну совместно культуры. (B) Взаимодействие Шаблон окрашенных DPSCs (зеленая Флуоресценция) и PC-3 клетки (красной флуоресценцией) после 24 h и 48 h совместно культуры (посева соотношение 1:1). PC-3 клетки больше был обнаружен в отношении DPSCs. Шкала бар: 200 мкм. Эта цифра приспособлен от Доган и др. 34. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Авторы не имеют ничего сообщать.