Многоцветная потока на основе цитометрии количественная оценка митохондрии и лизосом в Т-клеток

Chin-Wen Wei; Tyng-An Zhou; Ivan L. Dzhagalov; Chia-Lin Hsu

doi:10.3791/58844

Method Article

Многоцветная потока на основе цитометрии количественная оценка митохондрии и лизосом в Т-клеток

DOI:

10.3791/58844

⸱

January 9th, 2019

Chin-Wen Wei¹ , Tyng-An Zhou¹ , Ivan L. Dzhagalov¹ , Chia-Lin Hsu¹

¹Institute of Microbiology and Immunology, National Yang-Ming University

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта статья показывает мощный метод количественного определения митохондрий или лизосом в живых клетках. Сочетание конкретных Лизосома или митохондрии красители с дневно конъюгированных антител против поверхностных маркеров позволяет количественная оценка этих органеллы в смешанных клеточных популяций, как первичной клетки заготавливаемым от образцов тканей, с использованием многоцветная проточной цитометрии.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Т-клетки используют различные обменные программы их функциональным потребностям во время дифференциации и пролиферации. Митохондрии являются важнейших клеточных компонентов, отвечающих за энергоснабжения клеток; Однако избыток митохондрии также производят реактивнооксигенных видов (ров), которые могут привести к смерти клетки. Таким образом количество митохондрий должны постоянно корректироваться в соответствии с потребностями клеток. Это динамическое регулирование достигается частично через функцию лизосомы, которые удаляют излишки/поврежденных органеллы и макромолекул. Следовательно сотовой митохондриальных и лизосомальных содержание являются основные показатели для оценки метаболической перестройки клеток. С развитием зонды для органеллы, хорошо изученных Лизосома или митохондрии конкретных красители стали доступны в различных форматах для обозначения сотовой лизосом и митохондрии. Многоцветная проточной цитометрии является общим инструментом для профиль клеток фенотипов и имеет возможность быть интегрированы с другими анализов. Здесь мы представляем подробный протокол о том, как совместить органеллы конкретных красители с поверхностных маркеров, окрашивание измерить количество лизосом и митохондрий в популяциях различных Т-клеток на проточный цитометр.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Активация и пролиферацию клеток T являются важнейшие шаги для монтажа успешных иммунных реакций. Последние достижения показывают, что тесно связано с развитием и функции клеток T клеточный метаболизм. К примеру наивно T клетки полагаются в основном на окислительное фосфорилирование (OXPHOS) для удовлетворения спроса на энергию во время рециркуляции среди средних лимфоидных органов. После активации наивно T клетки претерпевают радикальные метаболических перепрограммирования, включая индукцию аэробного гликолиза для увеличения производства АТФ и выполнить огромную метаболические требования во время дифференцировки клеток и распространения. Клетки, которые не в состоянии....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описанную здесь процедуру сбора ткани мыши был одобрен институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) национального университета Ян-мин.

1. Подготовка лимфоцитов подвеска из лимфоидных органов

Усыпить мыши утвержденным методом как CO₂ ингаляции в камере Прозрачный акриловый, следуют шейки матки дислокации для обеспечения смерти.
Примечание: Держите скорость потока CO₂ 20% при перемещении в минуту палаты и не выше 5 psi (фунт на квадратный дюйм). Она занимает 2-3 мин для мыши потерять сознание. CO₂ поток поддерживать по крайней мере за 1 мин после животного остановилось дыхание (....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Идентификация основных Т-клеток подмножеств селезенки и вилочковой железы

Вкратце Одноячеистый суспензий из селезенки и вилочковой железы были лизированы красных кровяных клеток, инкубировали с 2.4G2 супернатанта, следуют органеллы конкретных краситель и поверхности маркер, окрашивание с флуоресцентным конъюгированных антител (Таблица 1). Развития прогрессирование тимоцитов можно описать с помощ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол сочетает в себе органеллы специфичные красителей и поверхности маркер окрашивания для количественного определения количество митохондрий или лизосом в популяциях различных Т-клеток. Этот метод был разработан для преодоления ограничения ячейки номер и однородности требования для традиционных методов, таких как электронная микроскопия и анализ immunoblot. Это особенно полезно при анализе редких клеточных популяций и одновременно изучения несколько типов клеток, в то же время.

Продо.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют не конфликты интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В разработке этого протокола был поддержан грантов из Тайваня министерства науки и технологии (большинство) NSC103-2320-B-010-002-MY2 и MOST104-2628-B-010-002-MY4 C.L. Hsu. К.В Вэй является получателем отличные тезис награду от Института микробиологии и иммунологии, национального университета Ян-мин.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
Щипцы Graefe 10 см (прямые и зубчатые)	Dimeda
11 см Iris ножницы (прямые с острыми/острыми головками)	Dimeda
центрифужная пробирка 15 мл	Thermo Fisher Scientific	339650
5 мл шприц	TERUMO
Чашка Петри 6 см	α-plus
70 &микро; m Нейлоновое сетчатое фильтр	SPL Lifesciences	93070
Хлорид аммония (NH₄Cl)	Sigma	A9434
Антимышь CD25	Biolegend	102007	Клон: PC61
Антимышь CD4	Biolegend	100453	Клон: GK1.5
Антимышь CD44	Biolegend	103029	Клон: IM7
Антимышь CD62L	Biolegend	104407	Клон: MEL-14
Антимышь CD8	Biolegend	100713	Клон:53-6.7
Антимышиный TCRβ	Biolegend	109233	Клон: H57-579
BD LSRFortessa	BD Biosciences
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)	Bio basic	6381-92-6
FALCON 5мл полистирольная трубка с круглым дном (FACS туба)	BD Biosciences	352052
фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS)	Гиклон	ATD161145
Flowjo, LLC	BD Biosciences
Гидроксиэтилпиперазитансульфоновая кислота (HEPES)	Sigma	H4034
L-глутамин (200 мМ)	Gibco	A2916801
LysoTracker Green DND26	Thermo Fisher Scientific	L7526
MEM заменимые аминокислоты (100X)	Gibco	11140050
MitoTracker Green FM	Thermo Fisher Scientific	M7514
Пенициллин-стрептомицин (10 000 ЕД/мл)	Gibco	15140122
Бикарбонат калия (KHCO3)	J.T.baker	298-14-6
Раствор йодида пропидия	Sigma	25535-16-4
RPMI 1640 среда (порошок)	Gibco	31800089
Бикарбонат натрия (NaHCO3)	Sigma	S5761
Пируват натрия (100 мМ)	Gibco	11360070

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Buck, M. D., O'Sullivan, D., Pearce, E. L. T cell metabolism drives immunity. Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).
Marelli-Berg, F. M., Fu, H., Mauro, C. Molecular mechanisms of metabolic reprogramming in proliferating cells: i....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Многоцветная потока на основе цитометрии количественная оценка митохондрии и лизосом в Т-клеток

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles