Методическая статья

Роман последовательности открытия субтрактивный геномика

DOI:

10.3791/58877

⸱

25 января 2019 г.

 ,  , 
1Biology Department, American University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Целью настоящего Протокола является использование комбинации вычислительной и коллегия исследовательской найти Роман последовательностей, которые нельзя легко отделяться от совместно очищения последовательность, которая может быть лишь частично известна.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Субтрактивный геномики может использоваться в любых исследований, где цель заключается в том, чтобы определить последовательность генов, белка, или общего региона, который встроен в более широком контексте геномной. Субтрактивный геномики позволяет исследователю изолировать последовательности целевых объектов, представляющих интерес (T), всеобъемлющей последовательности и вычитая из известных генетических элементов (ссылка, R). Этот метод может использоваться для выявления роман последовательности, например митохондрий, хлоропласты, вирусы, или микрофлорой ограничено хромосом и особенно полезен, когда T не может быть легко изолированы от р., начиная с всеобъемлющей геномных данных (R + T), метод использует основной инструмент поиска местных выравнивание (взрыв) против ссылка последовательности или последовательности, чтобы удалить сопоставления известных последовательностей (R), оставив позади цели (T). Для вычитания работать лучше R должно быть относительно полный проект, который отсутствует т. Начиная с последовательностями, оставшиеся после вычитания проверяются через количественные полимеразной цепной реакции (ПЦР) R не нужно быть полным для работы метода. Здесь мы связываем вычислительных шагов с экспериментальной шаги в цикл, который может быть итерация по мере необходимости, последовательно удаление нескольких ссылка последовательности и уточнения поиска для T. Преимуществом субтрактивный геномики является, что полностью Роман последовательности могут быть определены даже в тех случаях, в которых физической очистки является трудным, невозможно или дорого. Недостатком метода найти подходящую ссылку для вычитания и получение T-положительные и отрицательные образцов для испытаний ПЦР. Мы описываем нашу реализацию метода в определении первый ген от ограничено микрофлорой хромосома зебры Финч. В этом случае вычислительная фильтрации участвуют три ссылки (R), последовательно удалены более трех циклов: неполная геномной Ассамблеи, сырые геномных данных и транскриптомики данных.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот метод предназначен для выявления роман целевой (T) геномной последовательности, ДНК или РНК, от геномной контекста, или ссылку (R) (рис. 1). Этот метод наиболее полезен, если цель не может быть разделены физически, или это будет дорого делать это. Только в нескольких организмов прекрасно закончили геномов для вычитания, поэтому ключевых инноваций нашего метода является сочетание вычислительных и методы скамейке в цикл позволяет исследователям изолировать последовательности, когда ссылка является несовершенным, или проект геном-модель организма. В конце цикла ПЦР тестирование используется для определения того, требуются ли дополнитель....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. de novo собрать начиная последовательности

Примечание: Любые данные следующего поколения последовательности (НГС) может использоваться, как сборки могут быть изготовлены из этих данных. Подходящие входные данные включают Illumina, PacBio, или Оксфорд Нанопор читает собранные в файл fasta. Для конкретности, этот раздел описывает сборку на основе Illumina транскриптомики для исследования зебры Финч, мы провели7; Однако имейте в виду, что специфика будет зависеть от проекта. Для нашего примера проекта сырые данные были получены из MiSeq и парных читает примерно 10 миллионов были получены от каждого образца.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

После запуска BLAST, выходной файл будет иметь список последовательностей из запроса, которые соответствуют базе данных. После вычитания Python количество несовпадающих последовательностей будет получен и проверены ПЦР. Результаты этого и последующие шаги, обсуждаются ниже.

Отрицательный результат. Существует две возможные отрицательные результаты, которые могут рассматриваться после взрыва Ссылка последовательн.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хотя субтрактивный геномики является мощным, это не печенье резец подход, требующий настройки на нескольких ключевых шагов и тщательный отбор ссылка последовательности и испытательных образцов. Если запрос Ассамблея имеет низкое качество, фильтрация шаги только изолировать Ассамблеи артефактов. Таким образом важно тщательно проверить Ассамблея de novo с помощью соответствующей проверки протокола к конкретному проекту. Для РНК seq руководящие принципы приведены на веб-сайте Троицы18 и ДНК,.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы признают Мишель Бидерман, Alyssa Педерсен и Колин J. Saldanha, за их помощь в проекте геномики зебры Финч на различных этапах. Мы также признаем Евгений Bisk для вычисления Системное администрирование кластера и низ Грант 1K22CA184297 (для J.R.B.) и низ NS 042767 (для C.J.S).

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Accustart II Taq DNA PolymeraseQuanta Bio95141
Blasic Инструмент для поиска локального выравнивания (BLAST)https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/wiki/Transcriptome-Assembly-Quality-Assessment
Bowtie 2https://www.python.org/download/releases/2.7/
BWA-MEM v. 0.7.12https://github.com/BenLangmead/bowtie2
Geneioushttps://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
PEAR v. 0.9.6http://www.mybiosoftware.com/reptile-1-1-short-read-error-correction.html
Personal Computer Biomattershttp://www.geneious.com/
PowerSYBR qPCR mixThermoFisher4367659
Python v. 2.7https://sco.h-its.org/exelixis/web/software/pear/
Reptile v.1.1https://alurulab.cc.gatech.edu/reptile
Stratagene Mx3005PAgilent Technologies401456
TransDecoder v. 3.0.1https://sourceforge.net/projects/bio-bwa/files/
Trinity v. 2.4.0https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/wiki

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barh, D., et al. A Novel Comparative Genomics Analysis for Common Drug and Vaccine Targets in Corynebacterium pseudotuberculosis and other CMN Group of Human Pathogens. Chemical Biology & Drug Design. 78 (1), 73-84 (2011).
  2. Sarangi, A. N., Aggarwal, R., Rahman, Q., Trivedi, N.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

BLASTTrinity

Похожие статьи