Микрофлюидика сопряжения с микроэлектродные массивы для изучения нейронные связи и распространения аксональное сигнала

Summary

Этот протокол призван продемонстрировать как совместить в пробирке микроэлектродные массивы с microfluidic приборы для изучения потенциал действия передачи в нейрональных культур. Анализ данных, а именно определение и характеристика размножения потенциалы действия, выполненных с использованием новых передовых, но удобный и свободно доступны, вычислительные средства.

Abstract

Микроэлектродные массивы (МЭС) широко используются для изучения функции нейронов в пробирке. Эти устройства позволяют одновременно неинвазивные записи/стимуляции электрофизиологических деятельности для длительных периодов. Однако свойство зондирования сигналы от всех источников вокруг каждого микроэлектродные может стать неблагоприятным при попытке понять связи и сигнал распространения в нейронных цепей. В нейронной сети несколько нейроны могут быть активированы одновременно и может генерировать перекрывающихся потенциалы действия, что делает его трудно дискриминацию и отслеживать распространение сигнала. С учетом этого ограничения мы создали установку в пробирке , сосредоточена на оценке электрофизиологических коммуникации, которая сможет изолировать и усилить аксональное сигналов с высоким пространственным и временным разрешением. При взаимодействии microfluidic приборы и МЭС, мы способны устроены нейрональных культур с хорошо контролируемых выравнивание аксонов и микроэлектродов. Эта установка позволяет записи Спайк распространения с высоким соотношением сигнал шум в течение нескольких недель. В сочетании с алгоритмами анализа специализированных данных, он предоставляет подробную количественную оценку нескольких связи связанных свойств, таких как скорость распространения, недостаточность проводимости, скорострельность, антероградная шипы и кодирования механизмов.

Этот протокол демонстрируется, как создать настройку разобщенным нейрональных культуры над субстрата интегрированных МЭС, культуры нейронов в этой установки и успешно регистрировать, анализировать и интерпретировать результаты таких экспериментов. Здесь мы покажем, как установленные настройки упрощает понимание нейронные связи и распространения аксональное сигнала. Эти платформы проложить путь для новых моделей в vitro топографии инженерии и controllable нейронной сети. Они могут использоваться в контексте однородных культур нейронов, или с совместного культуры конфигураций, где, например, связь между сенсорных нейронов и другие типы клеток мониторинг и оценку. Эта установка обеспечивает очень интересные условия для изучения, например, нейроразвития, нейронных цепей, информация, кодирование, нейродегенеративные и neuroregeneration подходов.

Introduction

Понимание электрической связи в нейронных цепей является фундаментальным шагом раскрыть нормальной функции, и разработать терапевтические стратегии для решения дисфункции. Нейроны интегрировать, вычислить и реле потенциалы действия (APs), которые распространяются вдоль их тонкой аксоны. Традиционные электрофизиологических методов (например, патч зажим) являются мощные методы для изучения активности нейронов, но часто ограничиваются более клеточных структур, например Сома или дендритов. Методы визуализации предлагают альтернативу для изучения аксональное сигналов с высоким пространственным разрешением, но они являются технически трудно выполнять и не разрешать....

Protocol

По мнению Европейского союза (ЕС) Директива 2010/63/ЕС (транспонированы в законодательство Португалии Decreto-лей 113/2013) были выполнены все процедуры с участием животных. Экспериментальный протокол (0421/000/000/2017) был одобрен Комитетом по этике обоих Португальский официального органа по вопросам благополучия животных и эксперименты (Direção-Geral де Alimentação e Veterinária - DGAV) и принимающего учреждения.

1. Подготовка культуры средств массовой информации и другие решения

Примечание: Свежие Подготовьте решения покрытие в день ее использования. Неиспользуемые покрытие решения и средства массовой ....

Results

Используя протокол, описанный здесь, E-18 корковых нейронов крысы посеян на µEF имеют возможность развивать и оставаться здоровым в этих условиях культуры для более месяца. Как только 3-5 дней в культуре корковых нейронов растут их аксоны через microgrooves к аксональное отсек µEF (рис. 1). После 15 дней в культуре корковых нейронов, культивируемых на µEF, как ожидается, демонстрируют устойчивый уровень активности и ожидается распространение действий потенциа.......

Discussion

Протокола, представленные здесь показано, как собрать µEF, состоит из устройства microfluidic и МПС с стандартным коммерчески доступные конструкции и как анализировать записанные данные.

При проектировании эксперимент, исследователи должны учитывать, что модель в vitro ограничен МПС фиксированной сетки, которая сдерживает microgroove договоренностей. Использование конкретного microfluidic или МПС дизайн будет зависеть от конкретных потребностей экспериментальный, но, в общем, те же ша.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
B-27 Добавка (50X)	Thermo Fisher Scientific	LTI17504-044
Разветвленный полиэтиленимин) (ПЭИ), 25 кДа	Сигма-Олдрич	408727	Очистить разветвленный ПЭИ путем диализа с использованием отсечной мембраны с концентрацией 2,5 кДа в течение 3 дней при температуре 4°С; С против 5 мМ раствора HCl (обновляется ежедневно). Сублимационную сушку очищенного PEI.
Сетчатый фильтр для клеток (40 & микро; м)	Falcon	352340
Конические микротрубки (1,5 мл)	VWR	211-0015
Одноразовый подгузник, 60x40 см	Bastos Viegas SA	455-019
Щипцы Dumont #5, прямые	Fine Science Tools	91150-20
Щипцы Dumont #5/45	Fine Science Tools	11251-35
Щипцы Dumont #7, изогнутые	Fine Science Tools	91197-00
Сыворотка с тепловой инактивацией плода крупного рогатого скота Premium	Biowest	S181BH-500ML
Ламинин от Engelbreth-Holm-Swarm	Sigma-Aldrich	L2020-1MG	Приготовьте стоковый раствор ламинина в концентрации 1 мг/мл путем растворения порошка в соответствующем объеме недобавленной среды. Хранить раствор ламинина при температуре -20°С; C в малых аликвотах (20 & микро; L) во избежание повторных циклов замораживания/оттаивания.
L-глютамин 200mM	Thermo Fisher Scientific	LTID25030-024
Neubauer улучшенная счетная камера (гемоцитометр)	Marienfeld	630010
Нейробазальная среда (1X)	Thermo Fisher Scientific	21103-049	Базальная среда, используемая для нейрональных культур
PDMS микрофлюидные устройства	не применимо	не применимо	Состоит из двух ячеечных посевных отсеков, соединенных между собой 20 микроканавками с 450 мкм; m длина и время; 10 μ m высота и время; 14 μ м ширины и разделены на 86 & микро; m (общее промежуток 100 μ м).
Пенициллин-стрептомицин (P/S) раствор (100X)	Biowest	L0022-100
PES шприцевой фильтрующий блок (Ø 30 мм), 0,22 &; М	Frilabo	1730012
Полипропиленовые конические трубки, 15 мл	Thermo Fisher Scientific	07-200-886
Полипропиленовые конические тубы, 50 мл	Thermo Fisher Scientific	05-539-13
Полистирольные диспосабельные серологические пипетки, 10 мл	Thermo Fisher Scientific	1367811D
Полистирольный диспозибель серологические пипетки, 5 мл	Thermo Fisher Scientific	1367811D
Стандартная регенерированная целлюлозная мембрана (2 кДа)	Spectrum labs	132107
Стандартные хирургические ножницы	Fine Science Tools	91401-14
Интегрированные в подложку планарные MEA (256 микроэлектродов)	Многоканальные системы	256MEA100/30iR-ITO	252 регистрирующих электрода из нитрида титана (TiN) и 4 внутренних электрода сравнения, организованных в квадратную сетку 16 на 16. Каждый записывающий электрод имеет 30 & микро; м в диаметре и с интервалом в 100 мкм.
Наконечник для шприца с люэровским замком, 10 мл&nbл;	Terumo Europe	5100-X00V0
Наконечник для шприца с люэровским замком, 50 мл	Terumo Europe	8300006682
Terg-A-Zyme	Sigma-Aldrich	Z273287	Энзимно-активное порошковое моющее средство, используемое для очистки МЭА
Планшеты для культивирования тканей, 35 мм	StemCell Technologies	27150
Планшеты для культивирования тканей, 90 мм	Frilabo	900095
раствор Trypan Blue (0,4%)	Sigma-Aldrich	T8154
Трипсин (1:250)	Thermo Fisher Scientific	27250018
Виниловая лента 471	3M	B40071909