Измерение холестерина в пробирке измеряем способность сыворотки или плазмы в макрофагов ячейки модели является перспективным средством как биомаркер для атеросклероза. В настоящем исследовании мы оптимизации и стандартизировать флуоресцентный метод измеряем NBD-холестерина и высок объём анализа с помощью 96-луночных пластины.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Nitrobenzoxadiazole меченых холестерина высокой пропускной способности измеряем Assay
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Атеросклероз приводит к сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ). До сих пор неясно, является ли концентрации холестерина ЛПВП (cHDL) играет причинную роль в развитии атеросклероза. Однако, важным фактором в ранних стадиях формирования атеромы доска является способности измеряем холестерина ЛПВП (способность HDL частиц принять холестерина из макрофагов) для того, чтобы избежать образование клеток пены. Это ключевой шаг в избегая накопление холестерина в эндотелия и частью обратного холестерина транспорта (РКИ), чтобы устранить холестерина через печень. Холестерин измеряем способность сыворотки или плазмы в макрофагов ячейки модели является многообещающим инструментом, который может использоваться в качестве биомаркеров для атеросклероза. Традиционно [3H]-холестерина был использован в холестерин измеряем анализов. В этом исследовании мы стремимся разработать стратегию безопаснее и быстрее, с использованием флуоресцентных помечены холестерина (NBD-холестерин) в клеточном assay проследить процесс поглощения и измеряем холестерина в THP-1-производные макрофагов. Наконец мы оптимизации и стандартизировать метод измеряем NBD-холестерина и высок объём анализа с помощью 96-луночных пластины.
Введение
По данным Всемирной организации здравоохранения текущий главных причин смерти во всем мире являются ишемическая болезнь сердца и инсульта (приходится в общей сложности 15,2 миллиона смертей)1. Оба являются сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ), которые могут предшествовать атеросклероза и разрыв атеромы бляшки в сосудах2,3.
Атеросклероз является судно стены воспалительное заболевание в котором макрофагов, Т-клетки, тучные клетки и дендритных клеток проникнуть эндотелия и накапливаются в крови, в конечном итоге формирование атеросклеротических бляшек. Атероскл....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Для этого исследования были получены утверждения этического Комитета (Comitè Ètic d'Investigació Clínica, больницы, Барселона; номер утверждения ГХБ/2014/0756) и письменного информированного согласия от всех субъектов.
1. NBD-холестерин подготовка
- Растворите NBD-холестерина (494.63 МВт; см. Таблицу материалы) в чисто этанола для получения акций (2 мм). Для 10 мг флакон растворяют содержимое весь флакон в объеме 10.1 мл этанола для получения запас 2 мм.
- Разбавить NBD-холестерин из запасов в RPMI 1640 с 10% плода говядину сыворотки и 5% пенициллина/стрептомицина (средний R10) до конечной концентрации 5 мкм....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Цель анализа измеряем холестерина необходимо определить в vitro измеряем потенциала данного сыворотка, плазма или супернатанта, содержащей частицы HDL холестерина. Этот метод состоит из загрузки обозначены холестерина в культуру клеточной линии стандартного макрофагов и вызывая контакт с тестирования образца, разбавляют в FBS-свободных СМИ с клетками. Наконец флуоресцентный уровней от НБД измеряются в средствах массовой информации и lysate. Для оптимизации измерений, effluxed холестерина от клеток к средствам массовой ин.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Флуоресцентные, меченного холестерин является перспективной стратегией для анализа и изучения свойств и метаболизма природных холестерина в пробирке. Его основными преимуществами являются, что он может быть take up клетки, позволяет для внутриклеточного и мембраны исследования распределения и может быть применен к холестерина измеряем анализы как этот протокол (рис. 7). Некоторые люминесцентные, меченного стерины позволяют холестерина отслеживания в пробирке, включая BODIPY-холестерин, Данси.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы хотели бы заявить, что они являются изобретателей заявки на патент (ЕПВ; 18382337.6-1118; 17 мая 2018) под названием «Метод для определения холестерина измеряем» на основе этого метода.
Благодарности
Эта работа частично поддерживается исследовательских грантов FIS (PS12/00866) из Instituto de Salud Карлоса III, Мадрид, Испания; Fondo Europeo Comisión para el Desarrollo региональных (ФЕДЕР); Красный де инвестигасьон en СИДА (рис), ISCIII-RETIC (RD16/0025/0002) и CERCA программы / Женералитата Каталонии. Авторы благодарят Retrovirology и вирусная лаборатория иммунопатологии Institut d'Investigacions Pi Biomèdiques августа I Сунийе (IDIBAPS). Мы благодарим т. Escribà, C. Ровира и C. Уртадо за их помощь и S. Cufí от знания и технологии передачи управления за ее руководство в деле защиты изобретения.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 96-луночная сборная пластина | Corning Inc | Costar 3912 | белая 96-луночная пластина с непрозрачным прозрачным дном |
| 96-луночная культуральная пластина | Corning Inc | Costar 3610 | белая 96-луночная пластина с плоским прозрачным дном |
| Набор для анализа оттока холестерина (клеточный) | Abcam | ab196985 | коммерческий высокопроизводительный набор для клеточного анализа, направленный на определение холестерин |
| бесцветный RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R7509 | RPMI 1640 без пехнол-красного |
| Gen5 Программное обеспечение для анализа данных | BioTek | Version 2.0 | |
| Глицин | Sigma-Aldrich | G8790-100G | Глицин, не животного использования |
| Люминометр | Biotek | SYNERGY HT | Multi-Detection Microplate Reader |
| Лизис Раствор 1 | 50 мМ Трис Буфер, 150 мМ NaCl и H<суб>2О | ||
| Раствор для лизиса 2 | собственного производства | Чистый этанол и раствор для клеточного лизиса 1:1 (v:v) | |
| NBD-холестерин | Thermo-Fisher | N1148 | 22-(N-(7-Нитробенз-2-Окса-1,3-Диазол-4-ил)Амино)-23,24-Биснор-5-Холен-3&бета;-Ол |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | Фосфат-буфер физиологический |
| раствор PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 202452-250G | полиэтиленгликоль |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | Phorbol 12-меристат B-ацетат. |
| R10 | собственного производства | RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и 5% пенициллина/стрептомицина. | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | RPMI 1640 с 2 мМ L-глутамина, содержащим 1,5 г/л бикарбоната натрия и 4,5 г/л глюкозы |
| THP-1 клетки | Sigma-Aldrich | ATCC, #TIB-202 | моноцитоподобная линия, полученная из лейкемии годовалого ребенка |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 |
Ссылки
- The top 10 causes of death. , Available from: http://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death (2018).
- Hansson, G. K., Hermansson, A. The immune system in atherosclerosis. Nature Immunology. 12 (3), 204-212 (2011).
- Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
