Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Nitrobenzoxadiazole меченых холестерина высокой пропускной способности измеряем Assay

8.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58891

⸱

7 января 2019 г.

 ,  , 
1Group of Genomics and Pharmacogenomics in HIV, Laboratory of Retrovirology and Viral Immunopathogenesis, IDIBAPS, Hospital Clínic de Barcelona

В этой статье

Краткое содержание

Измерение холестерина в пробирке измеряем способность сыворотки или плазмы в макрофагов ячейки модели является перспективным средством как биомаркер для атеросклероза. В настоящем исследовании мы оптимизации и стандартизировать флуоресцентный метод измеряем NBD-холестерина и высок объём анализа с помощью 96-луночных пластины.

Аннотация

Атеросклероз приводит к сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ). До сих пор неясно, является ли концентрации холестерина ЛПВП (cHDL) играет причинную роль в развитии атеросклероза. Однако, важным фактором в ранних стадиях формирования атеромы доска является способности измеряем холестерина ЛПВП (способность HDL частиц принять холестерина из макрофагов) для того, чтобы избежать образование клеток пены. Это ключевой шаг в избегая накопление холестерина в эндотелия и частью обратного холестерина транспорта (РКИ), чтобы устранить холестерина через печень. Холестерин измеряем способность сыворотки или плазмы в макрофагов ячейки модели является многообещающим инструментом, который может использоваться в качестве биомаркеров для атеросклероза. Традиционно [3H]-холестерина был использован в холестерин измеряем анализов. В этом исследовании мы стремимся разработать стратегию безопаснее и быстрее, с использованием флуоресцентных помечены холестерина (NBD-холестерин) в клеточном assay проследить процесс поглощения и измеряем холестерина в THP-1-производные макрофагов. Наконец мы оптимизации и стандартизировать метод измеряем NBD-холестерина и высок объём анализа с помощью 96-луночных пластины.

Введение

По данным Всемирной организации здравоохранения текущий главных причин смерти во всем мире являются ишемическая болезнь сердца и инсульта (приходится в общей сложности 15,2 миллиона смертей)1. Оба являются сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ), которые могут предшествовать атеросклероза и разрыв атеромы бляшки в сосудах2,3.

Атеросклероз является судно стены воспалительное заболевание в котором макрофагов, Т-клетки, тучные клетки и дендритных клеток проникнуть эндотелия и накапливаются в крови, в конечном итоге формирование атеросклеротических бляшек. Атеросклеротические бляшки представляют липидного ядра и холестерина кристаллы, подтверждается разрешением измерения B-режим УЗИ сонных интима медиа толщина4,5. В макрофагах холестерин измеряем сторону липидов акцептора частиц осуществляется средствами СПС привязки кассеты (ABC) рецепторов ABCA1, АТФ привязки кассеты член subfamily G 1 (ABCG1), и мусорщик рецептор SR-Би. Дисбаланс приток холестерина и измеряем в макрофагах считается ключевой процесс атеросклероза инициации6. Холестерин измеряем считается ключевым шагом в ликвидации холестерина от периферических тканей к плазме крови и печени в процессе, называемом обратный холестерина транспорта (РКИ). Холестерин переносится из макрофагов, главным образом для Аполипопротеин А1 (ApoA1) на поверхности частиц липопротеидов высокой плотности (ЛПВП). HDL затем транспорт холестерина в печени для выведения и повторного использования7,8,9.

Традиционно тритий (3H) цианокобаламина, меченного холестерин используется в холестерин измеряем10. Сигнал выбросов радиоизотопов является весьма деликатным10; Однако цианокобаламина, меченного холестерин представляет очевидные недостатки как долго протоколы, риска воздействия ионизирующего излучения и потребность в специальных радиоактивности объектов и оборудования для обеспечения безопасной обработки радиоактивных выбросов. Напротив флуоресценции была успешно включена в методы диагностики благодаря своей простоте в флуоресцентного сигнала, широкий спектр доступных флуорофоров и ее безопасности11. Несколько флуоресцентные, меченного стерины были использованы для изучения метаболизма холестерина включая dehydroergosterol (с внутренней флуоресценции), Дансил холестерина, 4,4-difluoro-3a, 4adiaza-s-indacene (BODIPY) - холестерин и 22-(N-(7- Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-YL)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-ol (NBD-холестерин). В частности НБД холестерин представляет эффективное усвоение в клетки человека12. В настоящее время имеются два различных NBD помечены холестерин: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-NBD) и 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-НБД; Рисунок 1). Холестерин, помечены 22-NBD остаток может лучше всего подходят для исследования измеряем холестерина, в то время как 25-NBD-холестерин используется главным образом в клеточной мембраны динамика исследований13,14.

Линии клетки обычно используется в пробирке холестерина измеряем анализов являются Моноцит подобных клеток, таких как клетки человека лейкоз производные THP-1, мышиных Raw 264.7 клетки15или J774.1. Все эти клетки могут быть дифференцированы в макрофагов в пробирке с использованием phorbol 12-миристат 13-ацетат (PMA), но THP-1-производные макрофагов (dmTHP-1) лучший отражают и имитировать человека макрофаги16.

В настоящем исследовании, мы оптимизации и стандартизировать флуоресцентный метод высокой пропускной способностью для определения способности измеряем холестерина сыворотки образцов на dmTHP-1, используя 22-NBD-холестерина в качестве альтернативы [3H]-холестерина. Кроме того мы сравниваем оптимизированный флуоресцентные технику с стандартного аналогового радиоактивных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Для этого исследования были получены утверждения этического Комитета (Comitè Ètic d'Investigació Clínica, больницы, Барселона; номер утверждения ГХБ/2014/0756) и письменного информированного согласия от всех субъектов.

1. NBD-холестерин подготовка

  1. Растворите NBD-холестерина (494.63 МВт; см. Таблицу материалы) в чисто этанола для получения акций (2 мм). Для 10 мг флакон растворяют содержимое весь флакон в объеме 10.1 мл этанола для получения запас 2 мм.
  2. Разбавить NBD-холестерин из запасов в RPMI 1640 с 10% плода говядину сыворотки и 5% пенициллина/стрептомицина (средний R10) до конечной концентрации 5 мкм (например, получить 10 мл NBD-холестерина в конечной концентрации 5 мкм), Разбавление 25 мкл акций NBD-холестерина (2 мм) в среде R10. Этот объем является достаточным для 96-луночных пластины.

2. клетки культуры и заполнения (день-2)

  1. Культура клетки THP-1 в среде R10 при 37 ° C, 5% CO2. Приспособиться к 0,3 x 106 клеток/мл каждые 3 дня.
  2. Заполнение ячеек в белой 96-луночных плита с плоской, четкое дно на 0,2 х 106 клеток/колодец в среде R10 (100 мкл на хорошо).
  3. Лечить клетки с 100 Нм phorbol 12-миристат 13-ацетат (PMA; от 10 мкм запас) для 48-72 ч инкубации при 37 ° C, 5% CO2 дифференцировать THP-1 клеток в dmTHP-1.
    Примечание: Рекомендуется использовать 5 мкл PMA акций (10 мкм) в 500 мкл R10 среды. До этого подготовьте 10 мкм PMA запасов путем растворения лиофилизированные 1 g флакон 10 мл диметилсульфоксида (ДМСО), аликвота и запасов при-20 ° C.
  4. В качестве альтернативы (предложение) объединить шаги 2.2 и 2.3 для лучшего гомогенизации. Подготовка 10 мл THP-1 клеток в 15 мл, добавить 200 мкл PMA акций (10 мкм), осторожно перемешать и сразу же семян 100 мкл в колодец на пластину. Инкубируйте клетки, как описано в шаге 2.3.

3. аполипопротеина B обедненный сыворотки (ABDS) подготовка (день 2 или 3)

  1. Подготовить раствор полиэтиленгликоля (PEG), разбавляют Глицин в PBS 10% (с стерильных H2O) к концентрации 200 мм на рН 7,4. Добавление 10 g PEG 8000 для получения ПЭГ 40 мл 200 мм глицин 20% (w/v). Mix решение энергично для гомогенизации.
  2. Применить 4 частей 20% КОЛЫШЕК на 10 частей сыворотки/плазмы на каждом образце сыворотки/плазмы в 1,5 мл трубку и оставить смесь на льду 25 мин17 (например, 100 мкл плазмы или сыворотки, добавить 40 мкл 20% PEG решение).
  3. Центрифуга PEG-аполипопротеина B осадок на 13 000 x g 15 мин при 4 ° C.
  4. Слейте осадок. Супернатант передать новой трубки.
    Примечание: Мы предлагаем подготовку ABDS на день 3 (свежие). Если это не возможно, подготовить ABDS на 2 день и держать его при температуре 4 ° C на ночь.

4. NBD-холестерин клеток загрузки (день 2)

  1. Отказаться от культуры среднего dmTHP-1 и вымыть клетки дважды с 1 x фосфат амортизированное saline (PBS).
  2. Тензометрические силоизмерители с 5 мкм NBD-холестерина (100 мкл на хорошо) в среде R10 и инкубировать на ночь при 37 ° C, 5% CO2.

5. инкубации с акцепторами холестерина (день 3)

  1. Отказаться от среднего и вымыть клетки дважды с PBS.
  2. Инкубировать клетки с 2-5% ABDS или желаемого концентрация акцепторной очищенный липидов (HDL, АПД, ароЕ и т.д.) разводят в бесцветных RPMI 1640 среднего (100 мкл на хорошо) для 4-6 ч при 37 ° C.
    Примечание: Включить отрицательный контроль (C-) состоящий из бесцветных RPMI 1640 среды без позитивного управления (C +) (например, ABDS из числа здоровых доноров) или очищенного HDL и акцепторов. Обратите внимание что положительный контроль применяется, особенно когда пациент образцы (болезнь условия), анализ (дополнительный рис. 1).
  3. Подготовьте запас 200 мл раствора лизис клетки 1 (буфер Tris 50 мм, 150 мм NaCl, H2O). Смешайте раствор 1 на 1:1 (v: v) соотношение лизис клеток с чистого этанола для получения лизис решения 2.

6. флуоресцентного сигнала захвата (день 3)

  1. Обнаружение средств массовой информации NBD-холестерин
    1. Удалите средство клеток из пластин и собирают его в новой белой 96-луночных плита с непрозрачной плоским дном.
    2. Для оптимального флуоресценции обнаружения сигнала в образцах СМИ добавьте 100 мкл чистого этанола в 100 мкл каждого среднего образца, чтобы получить в соотношении 1:1 в 96-луночных белые пластины.
    3. Держите пластины с обработанной СМИ дальнейшие меры интенсивности флуоресценции (FI) на длине волны 463⁄536 Нм (возбуждение/излучение) в люминометра.
  2. Внутриклеточные NBD-холестерин обнаружение
    1. Вымойте клетки дважды с PBS.
    2. Для получения внутриклеточных холестерина, Лизируйте клетки путем инкубации их с 100 мкл раствора 2 лизиса на колодец и встряхнуть пластины при комнатной температуре (RT) 25 мин.
    3. Для оптимального флуоресценции обнаружения сигнала в образцах lysate клетки, захват интенсивности флуоресценции lysates клетки в том же белый 96-луночных пластины с четкой плоский снизу (же пластины, в котором клетки были посеяны в шаге 2.2).
  3. 6.3 измеряют интенсивность флуоресценции (FI) в Люминометр при настройке параметра чувствительность до 50 в программном обеспечении (см. Таблицу материалы).

7. результаты анализа

  1. Уровень холестерина измеряем образца выражают в процентах рассчитывается по следующей формуле:
    figure-protocol-1
  2. Получить окончательные меры измеряем холестерина (CE) путем вычитания CE отрицательного контроля (образец загружен с НБД холестерин, но инкубировали с бесцветными RPMI 1640 средний, без холестерина акцепторов) от CE из образцов с учетом:
    figure-protocol-2

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Цель анализа измеряем холестерина необходимо определить в vitro измеряем потенциала данного сыворотка, плазма или супернатанта, содержащей частицы HDL холестерина. Этот метод состоит из загрузки обозначены холестерина в культуру клеточной линии стандартного макрофагов и вызывая контакт с тестирования образца, разбавляют в FBS-свободных СМИ с клетками. Наконец флуоресцентный уровней от НБД измеряются в средствах массовой информации и lysate. Для оптимизации измерений, effluxed холестерина от клеток к средствам массовой ин...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Флуоресцентные, меченного холестерин является перспективной стратегией для анализа и изучения свойств и метаболизма природных холестерина в пробирке. Его основными преимуществами являются, что он может быть take up клетки, позволяет для внутриклеточного и мембраны исследования распределения и может быть применен к холестерина измеряем анализы как этот протокол (рис. 7). Некоторые люминесцентные, меченного стерины позволяют холестерина отслеживания в пробирке, включая BODIPY-холестерин, Данси...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы хотели бы заявить, что они являются изобретателей заявки на патент (ЕПВ; 18382337.6-1118; 17 мая 2018) под названием «Метод для определения холестерина измеряем» на основе этого метода.

Благодарности

Эта работа частично поддерживается исследовательских грантов FIS (PS12/00866) из Instituto de Salud Карлоса III, Мадрид, Испания; Fondo Europeo Comisión para el Desarrollo региональных (ФЕДЕР); Красный де инвестигасьон en СИДА (рис), ISCIII-RETIC (RD16/0025/0002) и CERCA программы / Женералитата Каталонии. Авторы благодарят Retrovirology и вирусная лаборатория иммунопатологии Institut d'Investigacions Pi Biomèdiques августа I Сунийе (IDIBAPS). Мы благодарим т. Escribà, C. Ровира и C. Уртадо за их помощь и S. Cufí от знания и технологии передачи управления за ее руководство в деле защиты изобретения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
96-луночная сборная пластинаCorning IncCostar 3912белая 96-луночная пластина с непрозрачным прозрачным дном
96-луночная культуральная пластинаCorning IncCostar 3610белая 96-луночная пластина с плоским прозрачным дном
Набор для анализа оттока холестерина (клеточный)Abcamab196985коммерческий высокопроизводительный набор для клеточного анализа, направленный на определение холестерин
бесцветный RPMI 1640Sigma-AldrichR7509RPMI 1640 без пехнол-красного
Gen5 Программное обеспечение для анализа данныхBioTekVersion 2.0
ГлицинSigma-AldrichG8790-100GГлицин, не животного использования
ЛюминометрBiotekSYNERGY HTMulti-Detection Microplate Reader
Лизис Раствор 150 мМ Трис Буфер, 150 мМ NaCl и H<суб>2О
Раствор для лизиса 2собственного производстваЧистый этанол и раствор для клеточного лизиса 1:1 (v:v)
NBD-холестеринThermo-FisherN114822-(N-(7-Нитробенз-2-Окса-1,3-Диазол-4-ил)Амино)-23,24-Биснор-5-Холен-3&бета;-Ол
PBSSigma-AldrichP3813Фосфат-буфер  физиологический
раствор PEG 8000Sigma-Aldrich202452-250Gполиэтиленгликоль
PMASigma-Aldrich79346Phorbol 12-меристат B-ацетат.
R10собственного производстваRPMI 1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и 5% пенициллина/стрептомицина.
RPMI 1640Sigma-AldrichR8758RPMI 1640 с 2 мМ L-глутамина, содержащим 1,5 г/л бикарбоната натрия и 4,5 г/л глюкозы
THP-1 клеткиSigma-AldrichATCC, #TIB-202моноцитоподобная линия, полученная из лейкемии годовалого ребенка
Tween 80Sigma-AldrichP1754

Ссылки

  1. The top 10 causes of death. , Available from: http://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death (2018).
  2. Hansson, G. K., Hermansson, A. The immune system in atherosclerosis. Nature Immunology. 12 (3), 204-212 (2011).
  3. Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature. 473 (7347), 317-325 (2011).
  4. Ilhan, F. Atherosclerosis and the role of immune cells. World Journal of Clinical Cases. 3 (4), 345(2015).
  5. Greaves, D. R., Gordon, S. Immunity, atherosclerosis and cardiovascular disease. Trends Immunol. 22, (2001).
  6. Yamamoto, S., Narita, I., Kotani, K. The macrophage and its related cholesterol efflux as a HDL function index in atherosclerosis. Clinica Chimica Acta. 457, 117-122 (2016).
  7. Escolà-Gil, J. C., Rotllan, N., Julve, J., Blanco-Vaca, F. In vivo macrophage-specific RCT and antioxidant and antiinflammatory HDL activity measurements: New tools for predicting HDL atheroprotection. Atherosclerosis. 206 (2), 321-327 (2009).
  8. Santos-Gallego, C. G., Ibanez, B., Badimon, J. J. HDL-cholesterol: Is it really good? Differences between apoA-I and HDL. Biochemical Pharmacology. 76 (4), 443-452 (2008).
  9. Rothblat, G. H., Phillips, M. C. High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport. Current Opinion in Lipidology. 21 (3), 229-238 (2010).
  10. Hafiane, A., Genest, J. HDL-mediated cellular cholesterol efflux assay method. Annals of Clinical and Laboratory Science. 45 (6), 659-668 (2015).
  11. Szalaia, R., Hadzsiev, K., Melegh, B. Cytochrome P450 Drug Metabolizing Enzymes in Roma Population Samples: Systematic Review of the Literature. Current Medicinal Chemistry. 23, 1-26 (2016).
  12. Mcintosh, A. L., et al. Fluorescent Sterols for the Study of Cholesterol Trafficking in Living Cells. Probes and Tags to Study Biomolecular Function: for Proteins, RNA, and Membranes. , 1-33 (2008).
  13. Ostašov, P., et al. FLIM studies of 22- and 25-NBD-cholesterol in living HEK293 cells: Plasma membrane change induced by cholesterol depletion. Chemistry and Physics of Lipids. 167, 62-69 (2013).
  14. Song, W., et al. Characterization of fluorescent NBD-cholesterol efflux in THP-1-derived macrophages. Molecular Medicine Reports. 12 (4), 5989-5996 (2015).
  15. Liu, N., Wu, C., Sun, L., Zheng, J., Guo, P. Sesamin enhances cholesterol efflux in RAW264.7 macrophages. Molecules. 19 (6), 7516-7527 (2014).
  16. Qin, Z. The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature. Atherosclerosis. 221 (1), 2-11 (2012).
  17. Low, H., Hoang, A., Sviridov, D. Cholesterol Efflux Assay. Journal of Visualized Experiments. (61), 5-9 (2012).
  18. Gimpl, G., Gehrig-Burger, K. Cholesterol reporter molecules. Bioscience Reports. 27 (6), 335-358 (2007).
  19. Zhang, J., Cai, S., Peterson, B. R., Kris-Etherton, P. M., Heuvel, J. P. Vanden Development of a Cell-Based, High-Throughput Screening Assay for Cholesterol Efflux Using a Fluorescent Mimic of Cholesterol. ASSAY and Drug Development Technologies. 9 (2), 136-146 (2011).
  20. Rader, D. D. J. Molecular regulation of HDL metabolism and function: implications for novel therapies. Journal of Clinical Investigation. 116 (12), 3090-3100 (2006).
  21. Davidson, W. S., et al. The effects of apolipoprotein B depletion on HDL subspecies composition and function. Journal of Lipid Research. 57 (4), 674-686 (2016).
  22. Park, S. H., et al. Sage weed (Salvia plebeia) extract antagonizes foam cell formation and promotes cholesterol efflux in murine macrophages. International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1105-1112 (2012).
  23. Litvinov, Y., Savushkin, E. V., Garaeva, E. A. D. A. Cholesterol Efflux and Reverse Cholesterol Transport: Experimental Approaches. Current Medicinal Chemistry. 371 (25), 2383-2393 (2016).
  24. Phillips, A., Mucksavage, M. L., Wilensky, R. L., Mohler, E. R. Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis. N Engl J Med. 364 (2), 127-135 (2011).
  25. Rohatgi, A., et al. HDL Cholesterol Efflux Capacity and Incident Cardiovascular Events. New England Journal of Medicine. 371 (25), 2383-2393 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

NBDTHP 196
Nitrobenzoxadiazole меченых холестерина высокой пропускной способности измеряем Assay
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.