Изоляция, очищение, и дифференциация Остеокласт прекурсоров из костного мозга крысы

Краткое содержание

Остеокласты представляют собой тканеспецифические макрофаги, полученные из моноцитов-макрофагов линии гемопоэтических стволовых клеток. Этот протокол описывает, как изолировать клетки костного мозга, чтобы получить большое количество остеокластов при одновременном снижении риска несчастных случаев, найденных в традиционных методах.

Аннотация

Остеокласты большие, многоядерные, и кости-расрезные клетки моноцитов-макрофагов линии, которые формируются путем слияния моноцитов или прекурсоров макрофагов. Чрезмерное резорбция кости является одним из наиболее значимых клеточных механизмов, ведущих к остеолитических заболеваний, включая остеопороз, периодонтит, и перипротеза остеомолиза. Основной физиологической функцией остеокластов является поглощение как гидроксиапатитового минерального компонента, так и органической матрицы костной ткани, генерирующей характерный вид резорбции на поверхности костей. Есть относительно мало остеокластов по сравнению с другими клетками в организме, особенно у взрослых костей. Недавние исследования были посвящены тому, как получить более зрелые остеокласты за меньшее время, что всегда было проблемой. В лабораториях в целях получения более зрелых остеокластов были разработаны некоторые усовершенствования в методах изоляции и культуры. Здесь мы вводим метод, который изолирует костный мозг за меньшее время и с меньшими усилиями по сравнению с традиционной процедурой, используя специальное и простое устройство. С использованием градиента центрифугирования плотности, мы получаем большое количество полностью дифференцированных остеокластов из крысиного костного мозга, которые определены классическими методами.

Введение

Костный гомеостаз – это сложный физиологический процесс, регулируемый остеокластами костной ткани и образующие костные остеобласты¹. Равновесие между остеобластным и остеокластов активностью при посредничестве остеобластов и остеокластов, соответственно, крайне важно для поддержания здоровья костей и гомеостаза, поскольку возмущения в костном гомеостазе могут приводить к заболеваниям костей, таким как аномальный рост костей или потеря плотности костной ткани. Как уникальные кости-резорбции, остеокласты имеют важное значение при заболеваниях, связанных с аномальной костной разрушения, включая остеопороз, периодонтит, и перипротеза остеолиза^2,3.

Развитие Остеокласт в основном делится на два этапа. Методы, созданные Бойде et al.⁴ и камерами et al.⁵ , составили первый этап в 1980-х годах. Они получили относительно обильные остеокласты из костей новорожденных животных, что является быстрым периодом реконструкции. Остеокласты выпускаются путем фрагментации и перемешивания костей в специальной среде. Тем не менее, клетки, полученные этим методом, являются низкими по количеству и чистоте. Вторым этапом было развитие культур дальнего действия остеокластов, использование клеток гематопоэтических родословных, полученных из костного мозга⁶. Цитокинов, таких как 1а, 25-дигидроксивитамин D3, простагландин Е2 (PGE-2) и паратиреоидный гормон (ПТГ), которые добавляются в среду культуры, действуют через систему остеобластов/стромальных клеток, чтобы стимулировать образование остеокластов^7,8 . Однако чистота и количество остеокластов, полученных этим методом, не могут удовлетворить потребности современной молекулярной биологии. Затем, открытие макрофагов колонии-стимулирующий фактор (м-КСФ) и рецептор активатора для ядерного фактора-Клаб лиганда (rankl) сделать остеокластогенез легче^9,10,11, и метод использования м-КСФ и RANKL непосредственно стимулировать образование остеокластов широко используется во всем мире. Тем не менее, есть еще некоторые детали в методологии, которые должны быть улучшены.

В настоящее время наиболее часто используемый метод остеокластов, описанный Марино et al.¹² и пей et al.¹³, часто требует удаления окружающих тканей вокруг кости и использует стерилизованные иглы для смыва костного мозга с Завершенные средства массовой информации. Есть некоторые недостатки этого процесса, в том числе тот факт, что (1) удаление окружающих тканей вокруг кости требует много времени и большой хирургической техники, (2) кости хрупкие и может привести к оттоку костного мозга, (3) полость костного мозга может быть слишком крошечные, чтобы флеш, и (4) есть риск травмы Stick иглы. Чтобы избежать этих проблем, мы центрифугирования труб, содержащих кости для костного мозга, а не иглы промывка костного мозга. Здесь мы представляем стабильный и безопасный метод, который изолирует костный мозг за меньшее время и с меньшими усилиями по сравнению с традиционной процедурой. Вместе с использованием градиента центрифугирования плотности мы получаем большое количество полностью дифференцированных остеокластов в пробирке.

Протокол

Все методы, связанные с животными, описанным здесь, одобрены институциональным Комитетом по уходу и использованию животных (ИАКУК) Нанкинского университета китайской медицины.

1. Настройка

1. Подготовьте несколько продольно срезанные 1 мл пипетки (1 см) и несколько 1,5 мл микроцентрифуг. Положите пипетки советы и микроцентрифуги на 103 КНА и 121 ° c для 20 мин и убедитесь, что они стерильны.
2. Приготовьте коробку со льдом и несколько стерильных тарелок, чтобы сохранить изолированные ткани во время процедуры изоляции.

2. Подготовка культурной среды

1. Подготовьте полную среду культуры. Использование минимального необходимого среднего альфа-и-мем, содержащего окончательное решение 1% пенициллина/стрептомицина и 10% фетальной бычьей сыворотки (ФПС).
2. Фильтр СМИ от шага 2,1 с помощью фильтра 0,22 мкм.
3. Подготовьте среду индукции костного мозга. Для 50 mL раствора добавьте 125 мкл м-ФГО при концентрации 10 000 нг/мл (таблица материалов) до 49,875 мл полной питательной среды (от шага 2,2), чтобы сделать окончательное решение 25 нг/мл м-СМЖ.
4. Подготовьте среду индукции остеокластов. Для 50 mL из раствора, добавить 500 мкл из RANKL в концентрации 10 000 нг/мл (таблица материалов) до 49,5 мл костного мозга индукции среды (от шага 2,3), чтобы сделать окончательное решение 25 нг/мл м-КСФ и 100 нг/мл rankl.

3. изоляция клеток костного мозга, полученных

1. Эвтаназии
   1. Усыпляйте четыре крысы Спраг даули на CO₂ вдыхании следуют шейки дислокации, и погрузить их в 75% этанола в течение 1 мин.
      Примечание: Убедитесь, что животные одного пола и того же возраста. Рекомендуются животные от 2 до 3 недель. Две крысы готовятся к центробежные метод, в то время как два других предназначены для традиционного метода.
2. Традиционный метод
   1. Поместите животных на дезинфицирующее доска в положении лежа на спине. Сделайте небольшой разрез (приблизительно 1 см) в проксимальном бедре, чтобы очистить кожу, используя стерильные ножницы.
   2. Вскрыть из бедра и tiпредвзятость. Вырезать двусторонние соединения частей вокруг бедра, колена и голеностопа суставов, чтобы изолировать и бедренные кости осторожно и нежно. Отрезать часть тканей вокруг кости; быть тщательным. Не делайте переломов и бедренные кости в течение всего процесса.
   3. Поместите очищенные кости в блюдо с 5 мл полной культуры среды. Отрезать длинную кость с стерильными ножницами и использовать 1 мл шприц иглы для смыва костного мозга тщательно с 10 мл полных средств массовой информации до мозга полости становится белым.
   4. Перенесите клеточную подвеску от шага 3.2.3 к трубке 50 mL, а затем, фильтруйте ее с помощью стрейнера 70 мкм, чтобы удалить оставшиеся ткани.
   5. Добавьте 5 мл буфера лизиса красных кровяных клеток (таблица материалов) в клеточную подвеску. Инкубировать клетки в течение 8 минут на льду. Затем, центрифуга клеток на 250 x g в течение 5 минут, чтобы дать ячейки гранул.
   6. Аспирин от среды и ресуспензируем клетки в 10 мл полных средств массовой информации. Подсчитайте ячейки с помощью хемоцитометер и вычислите время, затраченное на шаги из этого раздела (раздел 3,2).
3. Улучшенный метод
   1. Поместите животных на дезинфицирующее доска в положении лежа на спине. Сделать небольшой разрез (около 1 см) в проксимальных бедренных костей с стерильными ножницами, чтобы очистить кожу.
   2. Вскрыть из бедра и tiпредвзятость. Правильно отрезать часть тканей вокруг кости (не нужно полностью удалять). Не делайте переломов и бедренные кости в течение всего процесса.
   3. Промыть Тикос и бедренных костей с 12 мл фосфата-буферизованные физиологический раствор (PBS) и разрезать их пополам. Поместите в наконечник пипетки 1 мл (от шага 1,1), который затем ставится в пробирку микроцентрифуги и центрифугируются 3x при 1 000 x g для 45 s при температуре 4 °c.
   4. После центрифугирования удалите кончик пипетки, содержащий кость, и оставьте костный мозг в трубке. Добавьте 200 мкл полных носителей в трубку микроцентрифуги и повторите пипетки, чтобы полностью разрушить костный мозг.
   5. Перенесите клеточную подвеску от шага 3.3.4 к трубке 50 mL, а затем, фильтруйте ее с помощью стрейнера 70 мкм, чтобы удалить оставшиеся ткани.
   6. Подсчитайте ячейки, используя хемоцитометер, и вычислите время, затраченное на шаги из этого раздела (раздел 3,3).

4. Очистка по плотности градиента центрифугирования

1. Отрегулируйте суспензию ячейки от 3.2.6 шага или шага 3.3.5 до 2 мл с мэм.
2. Подготовьте одну стерильную силиконовый центробежную трубку и добавьте 8 мл раствора разделения клетки (таблица материалов) в трубку.
3. Добавить суспензию ячейки от шага 4,1 к решению ячейки разделения. Придерживайтесь пипетки наконечник на внутреннюю поверхность трубки и держать 45 ° на внутреннюю поверхность. После добавления подвески будет отображаться четкий предел между слоем клеток и раствором разделения.
   Примечание: Операция требует большой заботы и должна выполняться медленно.
4. Центрифуга слоистых раствор в горизонтальной центрифуги при 500 x g в течение 30 мин. После центрифугирования, аспирин от мутный второй слой, который содержит целевые клетки, сверху вниз.
   Примечание: Отменить ускорение и замедление центрифуги до центрифугирования. Есть шесть слоев после центрифугирования; Первый слой является слой разбавителя, второй слой моноцитов слой, третий слой слой мононуклеарных клеток, четвертый слой прозрачного разделения жидкости один слой, пятый является гранулированный слой клеток, и шестой слой является Красная Клетка Слой.
5. Перенесите целевые ячейки в новую трубку. Добавить 5 мл PBS для мытья клеток 3x. После каждого мытья, центрифуга целевых клеток на 250 x g в течение 5 минут, чтобы дать ячейки гранул.
6. Ресуспензируем клеток гранулы с костного мозга среды индукции и подсчета клеток с помощью хемоцитометер. Добавьте 5 – 8 мл среды индукции костного мозга от шага 2,3, чтобы получить окончательное решение ячейки 300 000 клеток/мл. Добавить 1 мл к каждому хорошо 24-хорошо пластины.

5. Культура и дифференциация

1. После инкубации клеток при температуре 37 ° c в течение 24 ч, осторожно аспоат от среды и добавить 1 мл Остеокласт индукции среды для каждого хорошо. Осторожно взволновать пластину и поместить ее в инкубатор при температуре 37 ° c.
2. Измените среду индукции остеокластов каждые 48 h. При этом, изменить 0,8 mL из среды в колодец и агитировать пластины осторожно.
   Примечание: Большие, motile, и многоядерные остеокласты должны наблюдаться в колодец под Перевернутый Микроскоп, как правило, вокруг дней 4-6.

6. тартрат-устойчивые кислоты фосфатазы окрашивание

Примечание: Остеокласты мултинуклеате будут присутствовать после 4 – 6 дней, если индукция (раздел 5) будет успешной.

1. Подготовьте фиксативный раствор, объединив 4 мл 37% формальдегида, 32,5 мл ацетона и 12,5 мл раствора цитрата. Храните фиксиительное решение при температуре 4 °C.
2. Подготовьте тартрат-резистентные кислоты фосфатазы (ловушка) пятно решение (таблица материалов), добавив 50 МКН нитрит натрия, 50 мкл быстрого граната БЦ базового решения, 50 мкл нафсол AS-BI фосфата решение, 200 мкл ацетатного раствора, и 100 мкл тартрат раствор в 4,55 мл обожионизированной воды, которая предварительно разогревается до 37 °C. Затем смешайте мягко инверсией для 1 мин, и дайте ему постоять 2 мин.
3. После успешной индукции остеокластов, аспоат от среды, и осторожно промойте скважин 3x с PBS.
4. Довести фиксативное решение до комнатной температуры (RT). Добавьте 2 мл фиксиительного раствора в скважины на 30 с и не позволяйте клеткам высохнуть.
5. Аспирин раствор, Осторожно промойте его 3x с обожонизированной воды, которая предварительно разогрет до 37 ° c, а затем, аспирин воды.
6. Добавить 2 мл ловушки пятно решение для 1 ч на 37 ° c и сохранить образец в темноте.
7. После 1 ч, аспирин пятно, и осторожно промойте образец с обожионизированной воды, которая предварительно разогрет до 37 ° c, а затем, аспоте воды.
8. Противоокрашивать клетки в течение 1 мин в раствор гематоксилина. После окрашивания, аспирин раствор для гематоксилина и аккуратно мыть клетки 3x с деионизированной воды.
9. Изображение остеокластов с использованием микроскопии Брайта, и ловушки⁺ клетки с тремя или более ядрами появятся фиолетовые.

7. кость резорбция анализ с использованием Толуидин синий окрашивание

1. Предварительная обработка ломтиков кости
   1. Вырезать свежего крупного рогатого скота бедренной кости коры на 2 см толщиной ломтиками вдоль продольной оси микроэлектрической пилы. Затем вырезать и измельчить ломтики с твердой ткани измельчители в 80 мкм.
   2. Вымойте ломтики в стакане с деионизированной водой и 100 Гц УЗИ для 1 ч, и повторите 3x.
   3. Погрузите ломтики в 75% спирта на 2 ч. Затем, аспирин от алкоголя и подвергать каждую сторону ломтиками ультрафиолетовым светом для 1 ч на чистую платформу.
   4. Перед посадкой клеток, погрузить ломтики в культуре среды, по крайней мере 2 ч.
2. Толуидин синий окрашивание
   1. Поместите предварительно обработанные кусочки кости в 24-хорошо пластины. Завод клетки, как упоминалось в шаге 4,6 и побудить клетки, как упоминалось в разделе 5.
   2. После появления остеокластов (после 4 – 6 дней), промойте ломтики с 1 мл 0,25 м гидроксида аммония, и sonicate их 3x в течение 5 минут каждый, чтобы удалить живые клетки, чтобы анализ резорбции ямы на ломтиков костей. Затем удалите Гидроксид аммония и испачкать ломтики с 1 мл 1% (т/т) толуидиновых синего раствора на ломтик в течение 2 мин.
   3. Вымойте ломтики с PBS. Случайным образом выберите пять просмотров и выполните полуколичественный анализ области резорбции с помощью программного обеспечения для анализа изображений.

8. сканирующая электронная микроскопия

1. Приставка кусочки кости от шага 7.2.1 с 1 мл 2,5% глутаральдегид на ломтик для 2 ч в РТ, а затем, sonicate ломтики 3x для 3 мин каждый с 1 м Гидроксид аммония для удаления клеток и удаления гидроксида аммония.
2. Вымойте кусочки кости 3x за 12 минут каждый с PBS.
3. Fix кусочки кости с 1% осминой кислоты в течение 2 ч на RT.
4. Выполните обезвоживание градиента этанола, с 50%, 70%, 80%, 90%, и 95% этанола, в течение 15 минут для каждого градиента, а затем, замените этанол с изоамил ацетат для 15 мин.
5. Пальто ломтики с золотом палладий, а затем проанализировать путем сканирования электронной микроскопии.

9. иммунофлуоресцентное окрашивание кальцитонина рецептора

Примечание: Остеокласты мултинуклеате будут присутствовать после 4 – 6 дней, если индукция успешна (раздел 5).

1. Аспирин от среды и осторожно мыть хорошо 3x с PBS.
2. Исправьте клетки на 10 мин с 4% параформальдегида, который предварительно охлаждается до 4 °C.
3. Добавить 1 мл PBS с 0,3% нонионический сурфактант в колодец на 30 мин на льду. Затем, аспирин от PBS с 0,3% нонионический сурфактант и добавить 1 мл PBS с 5% ФПС на хорошо за 30 мин на льду.
4. Аспирин от PBS и инкубировать мембраны с анти-кальцитонина рецептора (анти-рейтинг кликов) на 1:100 разрежения в PBS при температуре 4 °C в одночасье.
5. Аспирин от раствора, и инкубировать мембраны с Alexa-488-спряжения анти-кролика IgG антител на 1:1000 разбавления в PBS для 1 ч на RT.
6. Аспирин от раствора и осторожно мыть клетки 3x с PBS. Контрпятно ядер с Хехст 33342 пятно на 3 мин в рт.
7. Аспирин от раствора, и осторожно мыть клетки 3x с PBS. Соблюдайте интенсивность КЛИКОВ по флуоресцентной микроскопии.

Результаты

Цель протокола заключалась в том, чтобы удобно изолировать и очищать большое количество прекурсоров остеокластов и успешно вызывать остеокласты. Дополняя M-СМЖ и RANKL, гигантские остеокласты были замечены в дни 5-6. Формирование остеокластов было успешно идентифицировано пятнать ловушки (рис. 1A). Большие и фиолетовые клетки рассматривались как ловушки-позитивные клетки с несколькими ядрами (обычно три ядра). С помощью этого метода, это было типично для полу...

Обсуждение

Способность получать и изучать остеокласты в пробирке является критическим и фундаментальным навыком для любого исследователя, желающего изучать костный метаболизм, что может помочь понять механизмы костной поглощающей болезни и развить новые терапевтические агенты. В настоящем исследовании описан протокол с некоторыми изменениями на основе предыдущих методов.

Используя пипетки и микроцентрифужные трубки для получения костного мозга, это в значительной степени уменьшило время работы по получен...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Кислая фосфатаза, лекоциты (TRAP) набор	Sigma-Aldrich	387A
Автоматический слайсер твердых тканей	Lecia	RM2265
Бедренная кость			Приобретенные нами
Клеточный инкубатор	Heraus	BB16/BB5060
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота	Sarana	s-fbs-au-015
Козья анти-кроличья IgG H& L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150077
Измельчители твердых тканей	Lecia	SP-2600
Histopaque Kit	TianJing Haoyang	TBD2013DR	Силикатная центробежная трубка и раствор для разделения клеток
Hochest33342	Sigma-Aldrich	B2261
Инвертированный фазово-контрастный микроскоп	Olympus	CKX31
Инвертированный флуоресцентный микроскоп	Lecia	DMI-3000
MEM, без глутамина	Gibco	11090-081
Пенициллин-стрептомицин, жидкий	Gibco	15140122
кролик Антикальцитониновый рецептор	Bioss	bs-0124R
Рекомбинантная крыса M-CSF	PeproTech	400-28
Рекомбинантная крыса sRANK Лиганд	PeproTech	400-30
Буфер для лизиса эритроцитов	Absin	abs47014932
Сканирующая электронная микроскопия	FEI	Quanta 200
Толуидин синий	Sigma-Aldrich	89649