Методическая статья

Измерения одного липосом для изучения Протон насосные мембранных ферментов с использованием электрохимии и Флюоресцентная микроскопия

7.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58896

⸱

21 февраля 2019 г.

 ,  , 
1School of Biomedical Sciences & the Astbury Centre for Structural Molecular Biology, University of Leeds, 2Department of Chemistry and Nano-Science Center, University of Copenhagen

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол изучать молекулярный механизм Протон транслокации через липидные мембраны одной липосом, с использованием цитохрома Бо3 в качестве примера. Сочетая электрохимии и микроскопии флуоресцирования, изменения рН в просвете одного везикулы, содержащие один или несколько фермента, могут быть обнаружены и анализируются индивидуально.

Аннотация

Протон насосные ферменты электрона передачи цепи пара окислительно-восстановительных реакций в Протон транслокации через мембрану, создавая Протон движущей силы, используемые для производства АТФ. Амфифильных характер мембранных белков требует особого внимания к их обработки, и растворения в среду естественный липидный незаменима при изучении процессов переноса мембран как Протон транслокации. Здесь мы подробно метод, который был использован для исследования механизма Протон насосные мембраны окислительно-восстановительных ферментов, принимая цитохрома Бо3 от кишечной палочки в качестве примера. Сочетание электрохимии и флуоресцентной микроскопии используется для управления состоянием редокс хиноны бассейн и монитор изменений рН в просвете. Из-за пространственное разрешение флуоресцентной микроскопии сотни липосомы могут быть измерены одновременно в то время как содержание ферментов может быть уменьшен на одного фермента или транспортер в липосомы. Анализ соответствующих одного фермента может выявить закономерности в фермента функциональной динамики, которая в противном случае могут быть скрыты от поведения населения в целом. Мы включать описание скрипта для автоматизированного анализа.

Введение

На уровне ансамбля или macroscale с населением фермента в тысяч до миллионов молекул, где измерения представляют среднестатистический обычно информации о механизмах фермента и кинетика. Это известно, однако, что сложные макромолекулы как ферменты могут демонстрировать разнородность в их поведении и молекулярные механизмы на уровне ансамбля не обязательно верны для каждой молекулы. Такие отклонения в масштабе отдельных молекулы были широко подтверждены исследования одного ферментов с различными методами, возникающих в ходе последних двух десятилетий1. В частности флуоресценции обнаружения отдельных ферментативной активности был использован для расследования гетерогенность ферментов активность2,3 или обнаружить эффект так называемой памяти (периоды преуспело в периоды низкой активности высокой ферментов активность и наоборот)4,5.

Многие исследования одного фермента требуют, что ферменты иммобилизованных на поверхности или пространственно фиксированной в еще один способ оставаться достаточно долго, в поле зрения для непрерывного наблюдения. Было показано, что фермент инкапсуляции в липосомах включить иммобилизации фермента и предотвращения любых негативных последствий из-за поверхность фермента или белок белковых взаимодействий6,7. Кроме того липосомы предлагают уникальную возможность для изучения одного мембранных белков в их естественный липидный бислой окружающей среды8,9,10.

Класс мембранных белков, транспортеры, осуществляет направленного транслокации веществ через клеточную мембрану, поведение, которое можно изучать только когда белки будут преобразованы в липидных бислоев (например, липосомы)11, 12,13. Например Протон транслокации, выставлены несколько ферментов цепи переноса электронов прокариот и эукариот, играет важную роль в клеточное дыхание, создавая Протон движущая сила используется для синтеза АТФ. В этом случае Протон, насосные деятельность сочетается электрона передачи, хотя детальный механизм этого процесса часто ускользает.

Недавно мы продемонстрировали возможность флуоресцентного обнаружения пара с электрохимии для изучения Протон накачки активность ферментов одного терминала убихинола оксидазы Escherichia coli (цитохромы Бо3) Восстановленный в липосомах14. Это было достигнуто путем инкапсуляции рН чувствительной мембраны непроницаемый Люминесцентную краску в Люмене липосомы, подготовленных от э. coli полярных липидов (рис. 1A). Количество белка был оптимизирован так, что большинство липосомы либо содержащиеся не или только одна молекула восстановленный фермента (в зависимости от распределения Пуассона). Два субстратов цитохрома Бо3 были предоставлены путем добавления убихинон смесь липидов, который сформировал липосомы и кислорода (окружающей среды) в растворе. Липосомы затем малонаселенных адсорбированные на полупрозрачных Сверхплавное золото электрода, покрытые собственн-собранные монослоя 6-mercaptohexanol. Наконец электрод монтируется на нижней части простого spectroelectrochemical клеток (рис. 1B). Электрохимический управления хиноны бассейн окислительно-восстановительного состояния позволяет гибко запустить или остановить ферментативной реакции в любой момент, в то время как рН чувствительных краска используется для мониторинга изменений рН внутри просвета липосомы результате Протон транслокации, ферменты. С помощью интенсивности флуоресценции второй, липидов прыгните Люминесцентную краску, размер и объем отдельных липосомы могут определяться и таким образом количественной фермента Протон, насосные деятельности. Используя эту технику, мы особенно обнаружили, что цитохромы Бо3 молекулы способны войти в состояние спонтанной утечки, что быстро рассеивается Протон движущей силой. Цель этой статьи заключается в внедрения метода измерений одного липосомы в деталях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка смеси липидов/UQ-10/FDLL

Примечание: E. coli липиды используются для приготовления липосомы должно быть aliquoted и тщательно смешивается с убихинон-10 (фермент субстрата) и длинноволновых Флюоресцентная краска меченых липиды (для определения размера липосомы) до восстановление.

  1. С помощью шприца стекла, промаркированные передачи акций хлороформ полярных липидов выписка из Escherichia coli (25 мг/мл) в стеклянных флаконах сделать аликвоты 5 мг.
  2. Добавьте 50 мкл 1 мг/мл убихинон-10 (UQ-10; в хлороформе) на липиды сделать окончательный соотношение UQ-10: липиды масштаба 1: 100 (1% w/w).
  3. 20 мкл 1 мг/мл (0,4% w/w) длинноволновых Флюоресцентная краска меченых липидов (FDLL), в смесь липидов/UQ-10.
  4. Однородный раствор хлороформ на коротких vortexing и выпарить большую часть хлороформ под нежный поток азота или аргона. Полностью удалите следы хлороформа дальнейшее испарение под вакуумом для по крайней мере 1 час.
    Примечание: Липидов аликвоты могут храниться в инертной атмосфере при-20 ° C в течение нескольких месяцев.

2. Восстановление цитохрома Бо3

Примечание: Для очистки цитохрома Бо3 от кишечной палочки, следуйте протокол от Rumbley и др. 15 для обеспечения высокой чистоты образцов изначально сложить фермента, добавьте размер-гель-проникающей хроматографии после Шаг очищение сродства, характеризуется Rumbley et al. 15

  1. Мкл 312.5 40 мм MOPS-Кох/60 мм K2,4, рН 7,4, чтобы один Алиготе липидов/UQ-10/FDLL сухой смеси (5 мг, шаг 1.4) и смешать с вихревой до липидной пленки полностью высокомобильна, следуют 2 мин лечения в ультразвуковой ванне.
  2. 125 мкл 25 мм 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic кислоты (МК), pH фактора Люминесцентную краску, которая должна быть инкапсулированным липосомы.
  3. 137.5 мкл 250 мм n октиловый β-D-glucopyranoside (OGP) сурфактанта, смешать с использованием вихря и sonicate ультразвуковой водяной бане 10 минут, чтобы убедиться, что все липиды являются солюбилизирован в мицеллах ПАВ. Перенесите дисперсии в 1,5 мл пластиковую трубку.
    Примечание: Облачно подвеска липидов должна стать прозрачной после солюбилизация с ПАВ.
  4. Добавьте необходимое количество цитохрома Бо3 (см. Примечание ниже) и добавить сверхчистой воды, чтобы сделать общий объем 50 мкл (цитохромы решение Bø3 плюс вода). Инкубируйте на 4 ° C на 10 мин на роликовый миксер.
    Примечание: Типичный для условий одной фермента составляет 0,1 – 0,2% (w/w белково липидные, т.е. 5-10 мкг белка), хотя она может быть увеличена до 1 – 2% (50-100 мкг белка), если цель заключается в том, чтобы наблюдать только электрохимические деятельность (см. ниже). Как отрицательный контроль липосомы без цитохрома Бо3 может быть подготовлен.
  5. Весят 2 x 50 мг и 2 x 100 мг полистирола микрошарики в четыре 1,5 мл труба шапки и закрыть парафином пленкой для предотвращения высыхания.
    Примечание: Перед использованием, полистирола микрошарики должны быть вымыты с метанолом, воды и хранятся в воде согласно инструкции производителя.
    Примечание: Если используется смесь вода/microbead, полистирола микрошарики можно удобно быть переданы крышку с микропипеткой с широким наконечником. Вода может затем удален из микрошарики, с помощью микропипеткой с тонким кончиком.
  6. Добавьте 1st50 мг полистирола микрошарики в растворения смесь (шаг 2.4), надевая крышку с полистирола микрошарики 1,5 мл пластиковые трубки с дисперсией и выполняя короткие спина на пару секунд. Инкубируйте на 4 ° C на Роликовый Смеситель для полистирола микрошарики адсорбировать ПАВ для 30 мин.
    1. Повторите добавлениями полистирольные микрошарики и инкубаций следующим: добавить 50 мг микрошарики для 60 мин инкубации; Добавьте 100 мг микрошарики для 60 мин инкубации; и добавить 100 мг микрошарики для 120 мин инкубации.
      Примечание: Решение выше поселились микрошарики превратит полупрозрачные во время шага 2.6, как образуются proteoliposomes.
  7. Отдельные решения proteoliposome из полистирола микрошарики, с помощью микропипеткой с тонким кончиком. Разбавить дисперсии в 90 мл 20 мм MOPS-Кох/30 мм K2так4, рН 7,4 (МОПЫ буфера) и передачи в трубке ультрацентрифуга Ti45.
  8. Ультрацентрифуги дисперсии, используя тип 45 Ti ротор в 125 000 x g (rМакс) за 1 ч до Пелле proteoliposomes.
    Примечание: Меньше пробирок может использоваться хотя разрежения в большой буферный объем помогает уменьшить концентрацию не инкапсулированные ЮНИСТИЛ в окончательном подвеска.
  9. Отбросить супернатанта, промойте окатышей с 20 мм MOPS-Кох/30 мм K2,4, рН 7,4 буфера (без resuspending гранулы). После отмены промывки буфера, вновь приостановите proteoliposomes в 500 мкл буфера MOPS, закупорить его взад и вперед с тонкий кончик микропипеткой. Затем переезд в 1,5 мл пластиковую трубку.
  10. Центрифуга подвеска для 5 мин при 12000 g x для удаления мусора. Перенесите супернатант (восстановленный proteoliposomes) в новый флакон.
  11. Сохранить восстановленный proteoliposomes дисперсии на 4 ° C на ночь и использовать в течение 2 дней.

3. Изготовление полупрозрачные Золотые электроды

Примечание: Золото гладкая поверхность получается 30 Нм толстый слой золота 99.99% из атомарным образом гладкой кремниевой пластины зачистки методом шаблон. Небольшая толщина золотого слоя имеет важное значение, поскольку она должна быть полупрозрачным разрешить флуоресценции наблюдения. Подробная информация о золотым напылением (физическое парофазное осаждение, PVD) можно найти в других местах16 и только шаблон зачистки покрыта здесь. Кроме того Сверхплавное золотые фишки могут быть приобретены в другом месте (см. Таблицу материалы).

  1. Клей до 9 стекла Крышка скользит (0,17 мм) на поверхность выварочная золота, с использованием эпоксидной низким флуоресценции bi компонента. Вылечить клея при 80 ° C для 4 ч.
  2. Как раз перед модификация с собственн-собранные монослоя (шаг 4) Отсоедините скользит крышка стекла из кремниевых пластин с лезвием. Из-за тонкости скользит крышка заботиться при отключении скользит крышка не треснуть или сломать стеклянных скольжениях.

4. модификация поверхности золота с собственн-собранные монослоя (SAM)

  1. Подготовьте 5 мл водного раствора 1 мм 6-mercaptohexanol (6MH).
  2. DIP свежезаваренным отдельностоящий золото покрытием крышки скользит (шаг 3.1) в 6MH раствор и оставить на 20-25 ° C на ночь (> 16 h) сформировать SAM.
    Примечание: Тиоловых решения имеют неприятный запах, поэтому закрытый сосуд должен использоваться при инкубации золото покрытием крышки выскальзования.
  3. Следующий день, удалить золото покрытием крышки выскальзования из 6MH раствора, кратко мыть с водой или метанола и затем изопропанолом. Сухой под нежные газового потока.

5. электрохимические тестирование Proteoliposomes деятельности

Примечание: Электрохимическая активность фермента сначала проверяется на слое тесно Упакованные липосомы (шаг 5) и Нижняя везикул покрытия используются в одном везикулы эксперимент для измерения изменения рН в просвете липосомы (шаг 6).

  1. Соберите золото покрытием покрытие скольжения spectro электрохимической ячейки (см. Рисунок 1). Сделать контакт для золота с плоской проволоки за пределами области, заданной резиновое уплотнительное кольцо.
  2. Добавить 2 мл буферного раствора электролита и поместите ссылку и Электроды вспомогательные в ячейку.
    Примечание: Чем более подробно говорится в разделе обсуждение, электроды ссылки без хлорида предпочтительны для предотвращения формирования АС (I) Cl в электрохимии. Здесь, Hg/Hg2т4 (сб. K2т4) электрод сравнения используется и потенциалы даны по сравнению с Стандартный электрод водорода (SHE) с помощью 0.658 V против она для Hg/Hg2т4 (сб. K2так4).
  3. Запуск электрохимических импедансной спектроскопии (0,1 Гц – 100 кГц) на открытой ячейке потенциальных (OCP) потенциал для оценки качества Сэм. Преобразование значения импеданса для допуска и разделить на 2πω участок Коул-Коул сюжет, где ω — частота (см. следующие ссылки16,17,18 подробные сведения о преобразовании и интерпретации импеданс спектры).
    Примечание: Компактный и плотной Самс 6MH должны дать закрыть полукруга Коул-Коул участок и дать значения емкости в диапазоне 2,5-3,0 МКФ/см2 (рис. 2A). Если получены значительные отклонения от форму полукруга или емкость вне диапазона значений, измените электрода.
  4. Запуск пустой циклических voltammograms (CVs) с сканирования 100 и 10 МВ/s в регионе потенциальные-0.3 – 0,8 V. Типичная CV показано на (рис. 2B, пунктирная линия).
    Примечание: Это должно продемонстрировать почти чисто емкостной поведение и отсутствие значительных faradaic тока, даже в условиях атмосферного кислорода используется здесь.
  5. Добавить proteoliposomes (0,5 мг/мл концентрация окончательный липиды, 1-2% (w/w) соотношение липидов цитохрома Бо3 ) электрохимической ячейки и слегка перемешать с пипеткой. Подождите, пока адсорбции proteoliposomes на поверхности электрода готовой (30-60 мин при комнатной температуре).
    Примечание: Циклический voltammograms (CVs) на 10 МВ/s может выполняться во время адсорбции proteoliposomes следить за процессом. Адсорбция завершается, когда подряд CVs остановить изменение. В следующих учебниках можно найти информацию о методах CV. 19 , 20
  6. Мыть ячейки, изменяя буферный раствор, по крайней мере 10 раз, но избежать оставляя поверхности электрода полностью сухой.
  7. Запустите электрохимических импедансной спектроскопии OCP (рис. 2A, синяя линия) чтобы убедиться, что Сэм на электроде-золото остается неизменным и CVs с сканирования ставки 10 и 100 МВ/s соблюдать убихинола каталитического окисления (и сокращения кислородная) цитохрома Бо 3 начало потенциалов сокращения электрохимических хиноны о 0 V против она) (рис. 2B).

6. Определение ферментативные Протон накачки микроскопии флуоресцирования

  1. Измените золото электрод как в шаге 5, но с использованием 100 x менее proteoliposomes по сравнению с шагом 5.5 (т.е., 5 мкг/мл). Для исследования одного фермента, снизить Ботситохрома3 соотношение липидов до 0,1-0,2% (w/w).
    Примечание: Липосомы будет редко адсорбироваться на поверхности электрода, позволяя один пузырек мониторинг по микроскопии флуоресцирования. В этих условиях сингл фермента количество фермента, лишенных подвижности на поверхности электрода является недостаточным для наблюдения каталитического тока.
  2. Место электрохимической ячейки на нефть цели (60 X) Перевернутый флуоресценции микроскоп с каплей масла для погружения. Используя соответствующие фильтры для флуоресценции FDLL, сосредоточиться на поверхности электрода. Одноместный липосомы должен появиться как яркие пятна на дифракционный предел Микроскоп/цели. Возьмите изображения FDLL флуоресценции.
  3. Переключиться на один из ЮНИСТИЛ флуоресценции наборы фильтров на микроскопе для проверки, что ЮНИСТИЛ флуоресценции четко видны и отличить от фона (в то время выбранной экспозиции, см. шаг 6.4). Увеличение интенсивности света, если это не так.
  4. Программа Микроскоп программное обеспечение для выполнения загрузки приурочен изображений, чередуя два ЮНИСТИЛ наборы фильтров (меню приложений | Define/Run приобретение ND). Задайте задержку между изображения приобретений минимум. В этом эксперименте используйте 1 s облучения и 0.3 s Задержка (из-за башни движения).
    Примечание: Соотношение между интенсивностью флюоресценции в этих двух каналов будет позже преобразована в рН внутри липосомы в каждый момент времени. Продолжительность приобретения может варьироваться по курсу ожидаемых рН; в этой статье используется 5 мин.
  5. Настройте параметры потенцио изменить потенциал во время захвата изображений. Например, в этом эксперименте, используйте следующую последовательность: 0 – 60 s: никакой потенциал применяется (т.е. OCP); 60-s: 180 – 0,2 V (против она); 180-300 s: 0.4 V (против она). В этом случае, только прикладной потенциал на втором этапе (– 0,2 V против она) достаточно эффективно уменьшить хиноны бассейн.
  6. Запустите одновременно приобретение приурочен изображения (микроскоп) и потенциальных последовательности (потенцио), вручную запустив оба измерения в то же время.
    Примечание: Эксперимент может повторяться на электроде-же несколько раз путем перемещения микроскопа в другую область на поверхности. Задержка между приобретений должно быть по крайней мере 5-10 мин для обеспечения полной рН уравновешивания липосом на поверхности. Различные длительности и потенциальные модели могут применяться в зависимости от необходимости, хотя изображений время ограничено из-за Фотообесцвечивание ЮНИСТИЛ во время приобретения.

7. Анализ изображений флуоресцирования

Примечание: Типичный эксперимент производит набор изображений с шаг по времени (например, 2.6 s) для каждого из двух каналов, то есть, (продолжительность * 2 / 2.6) изображения. Пример такой набор записанных во время эксперимента одного фермента изображений доступны через репозиторий исследования данных Лидс21. Обработка изображений состоит из нескольких шагов, используя Фиджи (ImageJ) и высокого уровня математического анализа, язык программирования (далее как сценарии программного обеспечения, смотрите Таблицу материалов для подробной информации).

  1. Используйте Фиджи отдельный файл промежуток времени, выровнять изображения и сохранять как отдельные каналы и сроки.
    1. Открытое время перерыва файл, используя Bioformats импортера в Фиджи (команда макрос: запустить («био-форматы импортер»)).
    2. Использовать плагин StackReg для выравнивания каждого кадра к первой для учета возможных стадии движений или тепловой дрейф произошла во время приобретения (команда макрос: запустить («StackReg», «трансформация = перевод»)).
    3. Сохраните отдельные несжатые файлы для каждого канала и каждый шаг по времени в формате TIFF в одну папку.
    4. Извлечь точное время марок для каждого кадра из метаданных файла промежуток времени и сохранить их в виде CSV-файла в той же папке, что и изображения. Кроме того экстракт штампы времени с помощью приобретения программного обеспечения и вручную сохранить в CSV-файл с помощью программного обеспечения таблицы.
      Примечание: Папка с изображениями и штампы времени теперь готов для анализа сценариев программного обеспечения. 7.1.1 шаги. – 7.1.4. может быть автоматизирована с помощью сценария Фиджи (сценарий, написанный на Python для пакетной обработки файлов промежуток времени, использовать «Ctrl-Shift-N» (в Windows), а затем файл | Открыть для загрузки скрипта).
  2. Использование сценариев программного обеспечения для автоматизированной обработки изображений. Загрузить указанный код программного обеспечения и нажмите кнопку запустить до конца. При появлении запроса выберите папку, содержащую изображения с шагом 7.1.
    Примечание: Сценарий для анализа предоставляется как живой сценарий mlx формате, с обширные комментарии, для выявления единого липосомы, подогнать их функции 2D-Гаусса, их фильтрации и подсчитать значения рН в каждый момент времени. Следующие вложенные действия выполняются автоматически при выполнении сценария.
    1. Загрузите все изображения сроков для одного эксперимента в память.
    2. В среднем все изображения для одного канала (выберите канал с высокой интенсивностью флуоресценции) и использовать усредненный изображение для выявления все максимумы, которые могут соответствовать одной липосомы.
    3. Fit выявленных максимумов на среднем изображение для 2D-Гаусса функционировать и сохранить полученный подходят параметры для каждого липосомы (см. рис. 4A например установлены липосомы).
    4. Фильтр максимумов согласно ожидаемый единый липосомы критерии, такие как размер, цикличность и интенсивности. Отклонить липосомы, которые установлены плохо из-за низкой сигнал/шум, тесно соседних липосом или слишком близко к краю изображения.
    5. Загрузить отметки времени из внешнего файла и подходят каждой фильтрованной липосом функции 2D-Гаусса на каждом изображении сроки отдельно.
      Примечание: Использование параллельного программирования и многоядерных ЦП может значительно повысить скорость вычисления на данном этапе.
    6. Фильтр липосомы снова согласно аналогичные критерии как шаг 7.2.4 но прикладной для каждого периода времени.
    7. На каждом шаге по времени определите соотношение интенсивности флуоресценции липосом как отношение томов, окруженная установлены функции 2D-Гаусса на два канала. Вычислить рН от соотношение интенсивностей определяется из двух каналов ЮНИСТИЛ и использовании калибровочной кривой (шаг 8). Участок результирующие кривые рН время для липосомы и наблюдать их рН изменения при применении потенциал.

8. выполнение калибровочной кривой ЮНИСТИЛ флуоресцирования

Примечание: Чтобы преобразовать ЮНИСТИЛ флуоресценции соотношение intravesicular рН, калибровочной кривой должны быть сначала учредила что будет учитывать особые условия экспериментов, таких, как золото пропускания, качество фильтры, и т.д. Этот шаг должен выполняться только один раз или два раза и калибровочные данные могут использоваться как параметры настройки и измерения остаются неизменными в шаге 6.

  1. Подготовьте электрода с редкой адсорбированных липосомы (без цитохрома Бо3 как описано в разделе шаги 5 и 6.1).
  2. Добавьте 2 мкл раствора 0,1 мг/мл грамицидина в этанол в 2 мл буфера для создания концентрации 100 нг/мл.
  3. Захват двух изображений флуоресценции для двух каналов ЮНИСТИЛ.
  4. ТАК изменить pH клетки путем добавления небольших аликвоты 1 М HCl или 1 M H24. Измерение pH буфера с стандартный pH метр и захватить два изображения флуоресценции для двух каналов ЮНИСТИЛ.
  5. Повторите шаги 8.4 для рН 6-9.
  6. С помощью алгоритма от 7.2, подходят, фильтрации и вычислить среднее соотношение ЮНИСТИЛ флуоресценции отдельных липосом при каждом pH. Захватить ЮНИСТИЛ соотношение среднего все липосом.
  7. Соответствовать результате рН коэффициент зависимости к следующим уравнением:
    figure-protocol-1, где pK, R и Rbустановку параметров.
  8. Воспользуйтесь pK, R и Rbпреобразовать ЮНИСТИЛ соотношение отдельных липосомы шаге 7.2.7. для значения рН.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Качество золота модифицированные покрытие скольжения (электрод) с СЭМОМ 6MH проверяется перед каждой эксперимент с электрохимических импедансной спектроскопии. Рисунок 2A показывает представитель участки Коул-Коул, измеряется с использованием электрохимических импедансной спектроскопии, до и после адсорбированные липосомы. Если качество Сэм является достаточным, импедансной спектроскопии должны продемонстрировать почти чисто емкостной поведение в участке Коул...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Метод, описанный подходит для изучения Протон накачки дыхательных мембранных белков, которые могут быть преобразованы в липосомах и имеют возможность обмениваться электронов с бассейном хиноны. Протон, насосные деятельность может контролироваться на уровне сингл фермента, используя краски pH фактора (ratiometric), инкапсулированных в липосомы люмен (рис. 1A).

Метод основан на способности убихинон (или другие хиноны), включены в липидный бислой, обмениваться электр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Авторы признают СИББН (BB/P005454/1) для финансовой поддержки. NH финансировалась Программа следователь ВИЛЛУМ Фонд молодых.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
6-Меркапто-1-гексанол (6MH)Sigma45108897%
8-гидроксипирен-1,3,6-трисульфоновая кислота (HPTS)BioChemika56360
Алюминиевый держатель (Электрохимическая ячейка)Изготовлен30x30x7 мм; внутренний диаметр: 26 мм; диаметр отверстия: 15 мм
Вспомогательный электродплатиновой проволоки
ChloroformVWR Химикаты83627
E.coli полярные липидыAvanti100600C25 мг/мл в хлороформе
Эпоксиднаясмола EPO-TEK301-2FLнизкофлуоресцентная эпоксидная смола
Фиджи (ImageJ 1.52d)Необходимые плагины: StackReg и TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)
Фильтр куб ("ATTO633")Chroma Technology CorporationПример: 620/60 нм; DM: 660 нм; Em: 700/75 нм
Фильтр куб ("HPTS1")Chroma Technology CorporationEx: 470/20 нм; ДМ: 500 нм; Em: 535/48 нм
Фильтрующий куб ("HPTS2")Chroma Technology CorporationEx: 410/300 нм; ДМ: 500 нм; Em: 535/48 нм
Фильтр куб ("Texas Red")Chroma Technology CorporationEx: 560/55 нм; DM: 595 нм; Em: 645/75 нм
Флуоресцентные меченые красителями липиды (FDLL)ThermoFisher ScientificT1395MPTexasRed-DHPC был использован в этой работе (λ exc 595 нм; &лямбда; em 615 нм)
Флуоресцентные липиды, меченные красителями (FDLL) (альтернатива)ATTO-TECAD 633-161ATTO633-DOPE могут быть использованы в качестве альтернативы (λ отлх 630 нм; &лямбда; em 651 nm)
Гелевая фильтрационная колонкаGE Healthcare28-9893-33HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, для дополнительной очистки белка
Стеклянные покровные стеклаVWR International631-0172No 1.5
Стеклянный шприцHamilton1725 RNR250 &; L
Стеклянные флаконыScientific Glass Laboratories LtdT101/V1емкость 1,75 мл
ЗолотоGoodFellow99,99%
ГрамацидинSigmaG5002
Сульфат ртути электрод сравненияРадиометр (Hash)E21M012
МикроцентрифугаEppendorfMinispin NL040
МикроскопФотоаппарат дляEclipse Ti
AndorZyla 5.5 sCMOS
Лампа для микроскопаNikonIntensilight C-HGFI
NIS-Elements AR 5.0.2Программноеобеспечение для сбора данных для микроскопа
n-Octyl β-D-глюкопиранозидMelford LaboratoriesB2007
Nova 1.10MetrohmПрограммное обеспечение для управления потенциостатом
ОбъективNikonPlan Apo λ 60x/1.4 масло
OriginPro 2017OriginLabПрограммное обеспечение для прокладки плоттинга
Уплотнительное кольцо (электрохимическая ячейка)OrinokoВнутренний диаметр: 16 мм; сечение: 1,5 мм
Пластиковые трубкиEppendorf3810X1,5 мл
Микрогранулы полистиролаBio-RAD152-3920Biobeads, 20-50 меш
PotentiostatMetrohm AutolabPGSTAT 128N
PotentiostatCH InstrumentsCHI604C
R2017aНеобходимые наборы инструментов: «Набор инструментов для обработки изображений», «Набор инструментов для параллельных вычислений», «Набор инструментов для подгонки кривой», «Набор инструментов для идентификации системы», «Инструментарий оптимизации»
Кремниевые пластиныIDB Technologies LTDSi-C2 (N< 100>P)Ø Тефлоновая ячейка 25 мм, толщина 525 мкм
(электрохимическая ячейка)Изготовлен по индивидуальному заказуВнешний диаметр: 26 мм; внутренний диаметр: 13,5 мм
Ультраплоские поверхности из золота с обнаженными угламиPlatypus TechnologiesAU.1000.SWTSGАльтернативные готовые к использованию ультраплоские поверхности из золота (толщина менее 100 нм по запросу)
Тонкие наконечники для микропипетокSarstedt70.1190.100или аналогичные наконечники для загрузчика геля 200 & микро; L
Ubiquinone-10SigmaC-9538
УльтрацентрифугаBeckman-CoulterL-80XPс ротором Ti 45
Ультразвуковая ваннаFisher ScientificFB15063
на заказ микроскопа Nikon Nikon Scripting software Matlab

Ссылки

  1. Claessen, V. I., et al. Single-Biomolecule Kinetics: The Art of Studying a Single Enzyme. Annual Review of Analytical Chemistry. 3 (1), 319-340 (2010).
  2. Rojek, M. J., Walt, D. R. Observing Single Enzyme Molecules Interconvert between Activity States upon Heating. PLoS ONE. 9 (1), e86224(2014).
  3. Velonia, K., et al. Single-Enzyme Kinetics of CALB-Catalyzed Hydrolysis. Angewandte Chemie International Edition. 44 (4), 560-564 (2005).
  4. Lu, H. P., Xun, L., Xie, X. S. Single-molecule enzymatic dynamics. 282 (5395), Science. New York, N.Y. 1877-1882 (1998).
  5. Engelkamp, H., Hatzakis, N. S., Hofkens, J., De Schryver, F. C., Nolte, R. J. M., Rowan, A. E. Do enzymes sleep and work? Chemical Communications. 9 (9), 935-940 (2006).
  6. Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G. Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 105 (48), 12165-12170 (2001).
  7. Hsin, T. -M., Yeung, E. S. Single-Molecule Reactions in Liposomes. Angewandte Chemie International Edition. 46 (42), 8032-8035 (2007).
  8. García-Sáez, A. J., Schwille, P. Single molecule techniques for the study of membrane proteins. Applied Microbiology and Biotechnology. 76 (2), 257-266 (2007).
  9. Onoue, Y., et al. A giant liposome for single-molecule observation of conformational changes in membrane proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1788 (6), 1332-1340 (2009).
  10. Jefferson, R. E., Min, D., Corin, K., Wang, J. Y., Bowie, J. U. Applications of Single-Molecule Methods to Membrane Protein Folding Studies. Journal of Molecular Biology. 430 (4), 424-437 (2018).
  11. Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins. BBA - Bioenergetics. 1231 (3), 223-246 (1995).
  12. Jesorka, A., Orwar, O. Liposomes: Technologies and Analytical Applications. Annual Review of Analytical Chemistry. 1 (1), 801-832 (2008).
  13. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  14. Li, M., et al. Single Enzyme Experiments Reveal a Long-Lifetime Proton Leak State in a Heme-Copper Oxidase. Journal of the American Chemical Society. 137 (51), 16055-16063 (2015).
  15. Rumbley, J. N., Furlong Nickels, E., Gennis, R. B. One-step purification of histidine-tagged cytochrome bo3 from Escherichia coli and demonstration that associated quinone is not required for the structural integrity of the oxidase. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure and Molecular Enzymology. 1340 (1), 131-142 (1997).
  16. Jeuken, L. J. C., et al. Phase separation in mixed self-assembled monolayers and its effect on biomimetic membranes. Sensors and Actuators, B: Chemical. 124 (2), 501-509 (2007).
  17. Barsoukov, E., Macdonald, J. R. Impedance Spectroscopy Theory, Experiment, and Applications. , John Wiley & Sons. Chapters 1-2 (2005).
  18. Jeuken, L. J. C., Connell, S. D., Henderson, P. J. F., Gennis, R. B., Evans, S. D., Bushby, R. J. Redox Enzymes in Tethered Membranes. Journal of the American Chemical Society. 128 (5), 1711-1716 (2006).
  19. Compton, R. G., Banks, C. E. Chapter 4. Understanding voltammetry. , World Scientific Publishing Europe Ltd. Singapore. (2018).
  20. Girault, H. H. Chapter 10. Analytical and Physical Electrochemistry. , EPFL Press. Lausanne. (2004).
  21. Mazurenko, I., Jeuken, L. J. C. Timelapse (movie) of single vesicles fluorescence change upon potential application. , (2018).
  22. Li, M., Khan, S., Rong, H., Tuma, R., Hatzakis, N. S., Jeuken, L. J. C. Effects of membrane curvature and pH on proton pumping activity of single cytochrome bo3enzymes. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1858 (9), 763-770 (2017).
  23. Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. MATLAB code for the analysis of proton transport activity in single liposomes. , (2017).
  24. Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. Time-resolved fluorescence microscopic data (traces) of individual lipid vesicles with proton transport activity. , (2017).
  25. Paula, S., Volkov, A. G., Van Hoek, A. N., Haines, T. H., Deamer, D. W. Permeation of protons, potassium ions, and small polar molecules through phospholipid bilayers as a function of membrane thickness. Biophysical Journal. 70 (1), 339-348 (1996).
  26. Brookes, P. S., Hulbert, A. J., Brand, M. D. The proton permeability of liposomes made from mitochondria) inner membrane phospholipids: No effect of fatty acid composition. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1330 (2), 157-164 (1997).
  27. Eriksson, E. K., Agmo Hernández, V., Edwards, K. Effect of ubiquinone-10 on the stability of biomimetic membranes of relevance for the inner mitochondrial membrane. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1860 (5), 1205-1215 (2018).
  28. Seneviratne, R., et al. A reconstitution method for integral membrane proteins in hybrid lipid-polymer vesicles for enhanced functional durability. Methods. , 1-8 (2018).
  29. Veshaguri, S., et al. Direct observation of proton pumping by a eukaryote P-type ATPase. Science. 351 (6280), 1-6 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

bo3pH HPTS

Похожие статьи