Микроваскулярная эндотелиальных клеток скелетных мышц (MMEC) форма внутренней стенки капилляров мышц и регулировать так, обмен жидкости/молекул и миграции клеток (иммунитет) между мышечной ткани и крови. Изоляция первичного мышиных MMEC, как описано здесь, позволяет всеобъемлющего в пробирке исследования группы «myovascular».
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Изоляция микрососудистой эндотелиальных клеток первичного мышиных скелетных мышц
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Эндотелиальные клетки скелетной мускулатуры капилляров (микрососудистой эндотелиальных клеток мышц, MMEC) создать барьер между поток крови и скелетных мышц, регулирующий обмен жидкости и питательных веществ, а также иммунный ответ против инфекционных агенты, контролируя иммунные клетки миграции. Для выполнения этих функций, MMEC формируют функциональные «группа myovascular» (МВУ), с дальнейшей типов клеток, фибробластов, pericytes и скелетных мышечных клеток. Следовательно дисфункция MMEC и, следовательно, МВУ способствует разнообразие миопатий. Однако механизмы регулирования MMEC в здоровье и болезни по-прежнему недостаточно понятны и их разъяснение предшествует более конкретные лечения миопатии. Изоляции и углубленного исследования первичного MMEC функций в контексте МВУ может способствовать лучшему пониманию этих процессов.
Эта статья предоставляет протокол изолировать первичной мышиных MMEC скелетных мышц, механических и ферментативные диссоциации, включая очистки и культура обслуживания шаги.
Введение
С кислородом, субстратов и других необходимых молекул поставляются через кровоток, клеток и органов. Этот обмен происходит в капиллярах, мельчайших сосудов. Капилляров образуются слоя внутренний эндотелиальных клеток (EC), целостность которого остается необходимым условием для успешного регуляции гомеостаза мышц между внутрисосудистого и интерстициального пространства. Для обеспечения выборочной переход клеток и растворимых факторов, ЕС составляют монослоя, плотно соединены и adherens соединения 1. Помимо своей роли как барьер для питательных веществ или продуктов метаболизма EC регулируют набор лейкоцитов при воспалительных процессах.....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты на животных были утверждены местными властями и проведены согласно закону о немецких животных (84-02.05.20.13.097).
1. Общие замечания на эксперименты на животных
- Выполните все мыши экспериментов в соответствии с руководящими принципами соответствующих институционального ухода за животными и Комитета.
- Держите мышей в стандартизированных условиях и по данным международных руководящих принципов, таких, как Федерации для лабораторных животных науки ассоциаций (FELASA).
Примечание: В целом этот метод изоляции может использоваться для мышей, независимо от возраста, пола или генетический фо....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Один день после изоляции, первичный мышиных MMEC и остаточного другие клетки образуют конгломераты и придерживаться нижней части культуры блюд (день 1рис. 1A ). С дня 7 могут наблюдаться плоские и удлиненные клетки. Однако, до сих пор виден загрязнением других, главным образом клетки сфероида, (день 7рис. 1A ). Таким образом еще один цикл CD31 положительный выбор через MCS не требуется. Далее первичный мышиных MMEC размн.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Микроваскулярная эндотелиальные клетки обеспечивают барьерные функции во всех тканях и результаты их дисфункции в болезни ассоциированных органов 3. Кроме того орган конкретных исследования микрососудистой ЕС может проложить путь для новых терапевтических стратегий. Таким образом более глубокое понимание микрососудистой EC функции в условиях физиологического и патофизиологические является большой научный интерес. Модуляции лейкоцита/эндотелия взаимодействия успешно используется для лечения рассеян.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют не конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Эта работа была поддержана, «еще Kröner-Fresenius-Stiftung» (2018_A03 TR), «Инновационные Medizinische Тюрингия (МВФ) Münster» (I-RU211811 для TR) и Немецкий исследовательский фонд (DFG, INST 2105/27-1, меня 3283/5-1 и меня 3283/6-1 к SGM). Иллюстрированный изображения, предоставляемые Хайке Blum.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,25% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | 25200-056 | готовый к применению |
| буфер | 150 мМ NH4Cl, 10 мМ KHCO3, 0,1 мМ EDTA в воде при pH 7,3 | ||
| Anti-mouse CD31-FITC (клон MEC13.3) | Biolegend | 102506 | Контроль изотипа: FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl |
| Anti-mouse CD45-PE (клон 30-F11) | Biolegend | 103106 | Контроль изотипа: PE Rat IgG2b, κ Изотип Ctrl |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | Основной фактор роста фибробластов |
| BSA | Sigma Aldrich | A4503 | |
| CD31 Микрогранулы | мыши Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
| CD45 Микрогранулы мыши | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Коллагеназа-диспазе | Roche | 10269638001 | Коллагеназа из V. alginolyticus, диспаза из B. polymyxa |
| Corning Costar TC-Trained TC-обработанные многолуночные 6-луночные планшеты | Corning | 3516 | |
| Cy3-конъюгированное антитело IgG к крысам | dianova | 712-166-153 | |
| DAPI (реагент ProLong Gold antifade с DAPI) | Thermo Fisher | P36935 | |
| дезоксирибонуклеаза | Sigma Aldrich | D4513 | Дезоксирибонуклеаза I из поджелудочной железы крупного рогатого скота |
| Диэтилпирокарбонат обработанной воды | Thermo Fisher | AM9916 | |
| DMEM, содержащая добавку глутамина и пируват | Thermo Fisher | 31966-021 | подогреть до 37 градусов; C перед использованием |
| dNTP Mix (10 мМ) | Thermo Fisher | R0192 | 1 мл |
| EDTA | Sigma Aldrich | E5134 | |
| FACS tubes | Sarstedt | 551,579 | |
| Falcon 70 μ m Клеточное ситечко | Corning | 352350 | |
| FC буфер | 0,1% BSA, 0,2% NaN<суб>3, 2 мМ ЭДТА | ||
| Фетальная сыворотка для теленка | Sigma Aldrich | F6178 | Фетальная сыворотка для теленка |
| Поправляемая жизнеспособность Краситель eFluor780 | Thermo Fisher | 65-0865-14 | |
| Щипцы (зубчатые, прямые, 12 см) | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Щипцы (зубчатые, прямые, 12 см) | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Инсулиновый шприц 100 Solo 1 мл (Omnifix) | Braun | 9161708V | |
| (колонки LS) | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | для CD45-MACS-step |
| MCS буфер | 0,5% БСА, 2 мМ ЭДТА в PBS при pH 7,2 | ||
| Средняя магнитная колонка (колонка MS) | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | для CD31-MACS-step |
| Нуклеазная вода Thermo | Fisher | R0581 | |
| PBS | Sigma Aldrich | Phosphate буферизованный физиологический раствор, готовый к использованию | |
| ПЦР буфер (5x) | Thermo Fisher | EP0742 | в комплекте с обратной транскриптазой |
| Pecam1 крыса &альфа;-мышь | SantaCruz | Sc-52713 | 100 &; г/мл |
| Пенициллин-стрептомицин | Sigma Aldrich | P4333 | |
| первичные мышечные мышечные клетки | celprogen | 66066-01 | |
| Primer Cdh15 (M-Cadherin) | Thermo Fisher | Mm00483191_m1 | FAM меченый |
| праймер Cldn5 (claudin-5) | Thermo Fisher | Mm00727012_s1 | FAM меченый |
| Primer Ocln (окклюдин) | Thermo Fisher | Mm00500912_m1 | FAM меченый |
| праймер Pax-7 | Thermo Fisher | Mm01354484_m1 | FAM меченый |
| праймер Tjp-1 (Zonula occludens 1) | Thermo Fisher | Mm00493699_m1 | FAM меченый |
| праймер 18s рРНК (эукариотический эндогенный контроль) | Thermo Fisher | 4310893E | VIC меченый |
| кПЦР буфер (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X) | Thermo Fisher | K0231 | 2 х 1,25 мл; для 200 реакций каждая |
| Случайная смесь одноцепочечного праймера | Thermo Fisher | SO142 | Random Hexamer Primer |
| Обратная транскриптаза (200 U/μ L) + ПЦР-буфер (5x) | Thermo Fisher | EP0742 | |
| (40 Ед/&м; L) | Ножницы Thermo Fisher | EO0381 | |
| (режущая кромка 23 мм, острый/острый) | Ножницы Fine Science Tools | 14088-10 | |
| (режущая кромка 42 мм, острый/тупой) | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Скоростной раствор для нанесения покрытий | PeloBiotech | PB-LU-000-0002-00 |
Ссылки
- Rodrigues, S. F., Granger, D. N. Blood cells and endothelial barrier function. Tissue Barriers. 3 (1-2), e978720(2015).
- Michiels, C. Endothelial cell functions. Journal of Cellular Physiology. 196 (3), 430-443 (2003).
- Pierce, R. W., Giuliano, J. S. Jr, Pober, J. S.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
Первичные эндотелиальные клетки мышечной ткани мыши (MMEC)эндотелиальные клетки скелетных мышцмеханическая и ферментативная диссоциациямагнитная сепарация клетокпозитивная селекция CD31негативная деплеция CD45культура эндотелиальных клетоканализ методом проточной цитометриимаркеры сателлитных клеток мышц
