Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Изоляция микрососудистой эндотелиальных клеток первичного мышиных скелетных мышц

10.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58901

⸱

6 марта 2019 г.

 ,  ,  ,  , 
1Institute for Translational Neurology and Neurology Clinic, University of Muenster

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Микроваскулярная эндотелиальных клеток скелетных мышц (MMEC) форма внутренней стенки капилляров мышц и регулировать так, обмен жидкости/молекул и миграции клеток (иммунитет) между мышечной ткани и крови. Изоляция первичного мышиных MMEC, как описано здесь, позволяет всеобъемлющего в пробирке исследования группы «myovascular».

Аннотация

Эндотелиальные клетки скелетной мускулатуры капилляров (микрососудистой эндотелиальных клеток мышц, MMEC) создать барьер между поток крови и скелетных мышц, регулирующий обмен жидкости и питательных веществ, а также иммунный ответ против инфекционных агенты, контролируя иммунные клетки миграции. Для выполнения этих функций, MMEC формируют функциональные «группа myovascular» (МВУ), с дальнейшей типов клеток, фибробластов, pericytes и скелетных мышечных клеток. Следовательно дисфункция MMEC и, следовательно, МВУ способствует разнообразие миопатий. Однако механизмы регулирования MMEC в здоровье и болезни по-прежнему недостаточно понятны и их разъяснение предшествует более конкретные лечения миопатии. Изоляции и углубленного исследования первичного MMEC функций в контексте МВУ может способствовать лучшему пониманию этих процессов.

Эта статья предоставляет протокол изолировать первичной мышиных MMEC скелетных мышц, механических и ферментативные диссоциации, включая очистки и культура обслуживания шаги.

Введение

С кислородом, субстратов и других необходимых молекул поставляются через кровоток, клеток и органов. Этот обмен происходит в капиллярах, мельчайших сосудов. Капилляров образуются слоя внутренний эндотелиальных клеток (EC), целостность которого остается необходимым условием для успешного регуляции гомеостаза мышц между внутрисосудистого и интерстициального пространства. Для обеспечения выборочной переход клеток и растворимых факторов, ЕС составляют монослоя, плотно соединены и adherens соединения 1. Помимо своей роли как барьер для питательных веществ или продуктов метаболизма EC регулируют набор лейкоцитов при воспалительных процессах. Воспаление или ткани повреждение приводит к вверх регулирование молекул адгезии на поверхности EC и производство chemokines, содействия лейкоцита привязанность и переселение в целевой ткани 2. Следовательно ЕС критически участвуют в регуляции воспалительных процессов, таких как обороны против патогенов или восстановления тканей.

Дисфункция ЕС, непосредственно связанные с сосудистые заболевания, хроническая почечная недостаточность, тромбоз тяжелой возбудителя инфекции. Кроме того ЕС практически всегда участвуют в орган конкретных аутоиммунных заболеваний таких, как сахарный диабет или рассеянный склероз 3. Поэтому функцию барьера между поток крови и органов контролируется согласованного взаимодействия различных типов клеток. В скелетных мышцах микрососудистой эндотелиальных клеток (MMEC) вместе с мышечных клеток, фибробластов и pericytes образуют функциональный блок, «myovascular» (МВУ). Таким образом дисфункции МВУ может играть решающую роль в патофизиологии миопатий. Однако более глубокое понимание этих механизмов регулирования все еще отсутствует и в настоящее время препятствует выявлению новых, срочно необходимых, терапевтических целей в миопатий.

Для расследования сложных физиологических и патофизиологических механизмов, обычно используются Животные модели. Однако в пробирке модели предлагают преимущество сосредоточиться на предмет интереса, исключив различных смешанных факторов. Чтобы исследовать процессы в пробирке это необходимо изолировать чистой и жизнеспособных первичных элементов. В отличие от клеточных линий первичные элементы изолированы от трансгенных животных позволяют исследовать последствия генетических модификаций в пробирке.

Здесь метод, чтобы изолировать первичной мышиных MMEC описан с помощью механических и ферментативные диссоциации, следуют магнитные активированных клеток, сортировка методов (MCS) для очистки. Для этой цели используются магнитные шарики против конкретных поверхностных маркеров. Тромбоцитов эндотелиальных клеток адгезии молекулы-1 (PECAM1, CD31) выражается главным образом на ЕС и может использоваться для обогащения этого типа ячейки. Чтобы оправдать высокие ячейки чистоты, клеток кроветворных происхождения исключены негативный выбор для белка тирозинкиназы фосфатазы рецептор типа C (PTPRC, CD45). Кроме того контроль качества, культивирование первичного мышиных MMEC, потенциальные применения и ограничения, а также особые соображения представлены.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты на животных были утверждены местными властями и проведены согласно закону о немецких животных (84-02.05.20.13.097).

1. Общие замечания на эксперименты на животных

  1. Выполните все мыши экспериментов в соответствии с руководящими принципами соответствующих институционального ухода за животными и Комитета.
  2. Держите мышей в стандартизированных условиях и по данным международных руководящих принципов, таких, как Федерации для лабораторных животных науки ассоциаций (FELASA).
    Примечание: В целом этот метод изоляции может использоваться для мышей, независимо от возраста, пола или генетический фон. Для получения достаточного числа клеток, 4 – 10 недельных самцов предпочесны, потому что биологических свойств может меняться с возраста и пола.

2. Подготовка решений, средств массовой информации и покрытия

  1. Подготовка пищеварения (DS) решение путем смешивания 2,2 мл из Dulbecco´s изменение Eagle среднего (DMEM) с 200 мкл коллагеназы-Dispase и 45 мкл Desoxyribonuclease (DNase).
  2. Подготовка 500 мл среды эндотелиальных клеток (ECM) путем смешивания 450 мл DMEM с 50 мл FCS (примерно 10%), bFGF фактор роста фибробластов основные 0,25 мл (20 мкг/мл; приблизительно 0,05%) и 5 мл пенициллин стрептомицином (примерно 1%). Выполнение стерильной фильтрации в стеклянной трубки (диаметр поры фильтра: 0.2 мкм). Потом хранить решение при 4 ° C.
  3. Слой плиты культуры клеток, как описано ниже.
    1. Для выращивания свежевыделенных первичной мышиных MEC покрытия по всей поверхности с 1 мл на хорошо 6 хорошо клетки культуры плита покрытия раствором желатина на основе скорости (см. Таблицу материалы) согласно инструкции производителя для 3-5 мин на номер Температура (RT).
    2. Аспирационная и отменить решение покрытия. Промойте каждую лунку с 2 мл стерильного фосфатный буфер (PBS), рН 7,1-7,5 в два этапа подряд стирки.
    3. Аспирационная и отбросить PBS. Заполните скважин с объемом 1 мл ECM.

3. изоляция первичного мышиных микрососудистой эндотелиальных клеток (MMEC)

  1. Усыпить один взрослый 4 – 12 недель старые, мужчины мыши от шейки матки дислокации без каких-либо анестезии. Цель состоит в том, чтобы быстро отделить спинного мозга таким образом, чтобы обеспечить животное с быстрой и безболезненной смерти.
  2. Север конечностей.
    1. Используйте хирургический острый/Блант (передний край 42 мм, прямой) и острыми/острыми ножницами (передний край 23 мм, прямой), прямой (зубчатые, 2 мм x 1,25 мм x 12 см) и изогнутые (зубчатые, 1.3 мм x 1 мм x 13 см) щипцов.
    2. Лечением всех хирургических инструментов с 70% этиловом спирте.
    3. Положение на спине животного, смочите ноги с 70% этиловом спирте. Разорвать всю ногу путем разрезания на тазобедренного сустава с острыми/Блант хирургические ножницы. Место конечностей в культуры блюдо с закрытыми порами (35 мм x 10 мм).
      Примечание: Теперь выполнять каждый шаг под стерильную Ламинарный шкаф и работать с стерилизации инструментов.
  3. Изолировать мышечной ткани (преимущественно использовать musculus четырехглавой мышцы бедра или musculus трицепс Трёхглавая от обеих ног).
    1. Разрезать кожи от бедра на кончик пальца, используя острый/острыми ножницами и Изогнутый пинцет. Удерживайте палец или зверолов прямой пинцетом. Отслаиваются кожи пинцетом изогнутые от ноги до бедра.
    2. Изолировать musculus четырехглавой мышцы бедра , резка сухожилия от колена и разорвать мышцы вдоль бедра до бедра. Изолируйте Трёхглавая musculus трицепс , разрыв ахиллова сухожилия. Далее разрезать вдоль большеберцовой кости в подколенной ямки и удалить мышцы.
      Примечание: Если крупных сосудов (A. femoralis, A. tibialis передней, задней A. tibialis, A. малоберцовая) являются видимыми в изолированной мышцы, удалите судов, чтобы избежать загрязнения путем macrovascular эндотелия.
    3. Для удаления больших судов, удерживая часть мышц, не содержащие большие сосуды с изогнутой щипцами и отрезать его рядом с судна. Для этого протокола 1 g или меньше мышечной ткани, равным четырехглавой мышцы бедра и трицепс Трёхглавая рекомендуется.
    4. Мкл 2 445 DS (из шага 2.1) к ячейке культуры блюдо (35 мм x 10 мм) и определить вес.
    5. Передача всех частей мышцы к этому блюду культуры клеток, содержащих 2445 мкл DS и определить вес. Разница обоих измеренных значений дает сухого веса мышечной ткани, которая не должна превышать 1 г.
    6. Вырежьте всей мышечной ткани на мелкие кусочки (≤2 мм кубов, около 100 штук), используя острый/острыми ножницами.
  4. Отделить мышечной ткани.
    Примечание:     этот шаг занимает около 120 мин.
    1. Магазин мышцы/DS подвеска при 37 ° C (инкубатор с 5% CO2) для 1,5 ч. смешать подвеска тщательно каждые 20 мин около 5 минут, используя шприц 1мл инсулин.
    2. Перевести 70 мкм нейлон клеток стрейнер на 50 мл трубки подвеска и собирать через поток. Промойте фильтр ячейки с 8 мл DMEM и собирать через поток.
    3. Сбросить фильтр и центрифуги суспензию клеток для 10 мин на 300 x g при 20 ° C. Тщательно удалите супернатант.
      ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Пелле легко потерять.
    4. Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 мл лизировать буфер аммония хлорид калия (ACK) (см. прилагается Таблица материалов) для лизиса красных кровяных клеток и Инкубируйте 30 s на RT. Добавить 9 мл DMEM + 10% FCS для остановки реакции и передачи суспензию клеток к t 15 мл убе.
  5. Разрушающим CD45+ клетки после CD45 микрошарики изготовителя. Для всех следующих шагов CD45+ истощение использовать буфер MCS (см. прилагается таблица материалов).
    Примечание:     этот шаг занимает около 60 мин.
    1. Определить число клеток с помощью Нойбауэр клеток подсчета палата (ожидать около 5 х 106 клеток / g мышечной ткани).
    2. Центрифуга подвеска на 300 x g 10 мин при 4 ° C. Возьмите супернатант полностью и Ресуспензируйте Пелле клеток в 90 мкл MCS буфера (за 107 клеток или меньше). Добавьте 10 мкл CD45 микрошарики (за 107 клеток или меньше).
    3. Перемешать суспензию клеток и Инкубируйте 15 мин в холодильник на 4 – 8 ° C.
    4. Добавьте 1 мл MCS буфера (за 107 клеток или меньше). Центрифуга на 300 x g 10 мин при 4 ° C. Полностью удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки в 500 мкл буфера MCS.
    5. Для разделения магнитных клеток используйте столбец большие магнитные (ОБК) с резервуар объемом 8 мл и емкостью до 2 х 109 всего клеток. Расположите УТС в магнитном поле разделителя.
    6. Промойте с 3 мл буфера МКН в водохранилище ОБК. После ополаскивания, место 15 мл Конические трубки ниже столбца для сбора потока через. Применить подвеска вся ячейка (500 мкл) на столбец и дайте ему полностью потока.
    7. Промойте колонку три раза путем добавления 3 мл буфера МКН в водохранилище и подождать до тех пор, пока column´s резервуар пуст перед выполнением следующего шага стирки.
    8. Собрать немеченого клетки, передавая столбец использовать для дальнейшего разделения шаги (представляющий CD45 фракция– ). Помечены клетки (представляющий CD45+ фракция) накопленных в столбце, может быть удален.
  6. Накапливать CD31+ клетки следующие CD31 микрошарики с инструкциями производителя. Для всех следующих шагов CD31+ накопление использовать буфер MCS.
    Примечание:     этот шаг занимает около 60 мин.
    1. Определить номер ячейки, используя ячейку Нойбауэр, считая палата (ожидать около 4 х 106 клеток / g мышечной ткани).
    2. Центрифуга получил суспензию немеченого клеток от шаг 3.5 для 10 мин на 300 x g при 4 ° C.
    3. Полностью удалите супернатант. Ресуспензируйте гранулы в 90 мкл буфера MCS и добавить 10 мкл CD31 микрошарики (за 10 клеток всего7 или меньше). Смешать вся подвеска и Инкубируйте 15 мин в холодильник на 4 – 8 ° C.
    4. Добавить 1 мл MCS буфер и центрифуги на 300 x g 10 мин при 4 ° C. Возьмите супернатант и Ресуспензируйте клетки в 500 мкл буфера MCS.
    5. Для разделения магнитных клеток используйте столбец средних магнитные (MMC) с резервуар объемом 3,5 мл и емкостью до 2 x 108 всего клеток.
    6. Расположите консоль MMC в магнитном поле разделителя. Промойте MMC с 500 мкл буфера MCS. После ополаскивания, место 15 мл Конические трубки ниже столбца для сбора потока через.
    7. Применить подвеска вся ячейка (500 мкл) на столбец и дайте ему полностью потока.
    8. Промойте колонку три раза путем добавления 500 мкл буфера MCS и подождать до тех пор, пока столбец резервуар пуст перед выполнением следующего шага стиральная. Немеченого клетки, передавая столбце представляют CD45– CD31– фракции. Сохраните их для дальнейшего контроля качества.
    9. Удалить столбец из сепаратора и поместите его на трубку подходящего коллекции (15 мл). Пипетка 2 мл MCS буфер на столбец. Немедленно промойте магнитно помечены клетки, твердо толкает поршень в столбце. Этот CD45– CD31+ фракция представляет обогащенных первичных мышиных EC.
    10. Суспензию клеток центрифуги для 5 мин на 350 x g при 20 ° C. Полностью удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки (ожидать около 0,6 х 106 клеток / g мышечной ткани) в 1 мл ECM (см. шаг 2.2.). Передачи (0,5 – 0,7 х 106 клеток) в один колодец пластины с покрытием 6-ну культуры (из шага 2.3) содержащий 1 мл ECM.
  7. Для выращивания инкубации клеток при 37 ° C и 5% CO2 в стерильных инкубатора. Обновите ECM каждые два-три дня.

4. Первичные мышиных MMEC очистки

  1. Выполните второй цикл CD31+ накопление, следуя инструкциям производителя (CD31 микрошарики мыши протокола; см. шаг 3.6.).
    1. Отсоедините клетки раствором трипсина/ЭДТА, когда они находятся в 80 – 90% слияния (обычно после 7 дней). Для этого промойте каждой скважины с 2 мл стерильного PBS, в двух шагах подряд стирки. Используйте 800 мкл раствора трипсина/ЭДТА на 6-Ну и Инкубируйте на 37 ° C и 5% CO2 в стерильных инкубатор для 3-5 мин остановка ферментативной активности с помощью 1200 мкл DMEM, содержащий как минимум 10% FCS.
    2. Центрифуга суспензию клеток для 5 мин на 350 x g при 20 ° C.
    3. Выполните второй CD31-MCS шаг для повышения чистоты (согласно инструкциям manufacturer´s CD31 микрошарики; 3.6 см.).
    4. Соблюдать слияния клеток через яркие поля или с помощью стандартных фазово контрастной микроскопии
      20 x увеличение и 0,35 объектив числовая апертура. Смотрите Рисунок 1.
      Примечание: Клетки могут быть использованы для соответствующих экспериментов или хранится в культуре пассированый. Используйте клетки для экспериментов оперативно в нижней проходы. Не рекомендуется использовать клетки после прохождения
      8 – 10.

5. контроль качества

  1. После второго CD31-MCS-шаг выполните проточной цитометрии первичного мышиных MMEC.
    1. Подготовка трубки СУИМ, добавив 1 мл буфера потока цитометрии (FC) (см. прилагается Таблица материалов).
    2. Отсоедините клетки раствором трипсина/ЭДТА, когда они находятся в 100% слияния (обычно после 14 дней). Для этого промойте каждой скважины с 2 мл стерильного PBS, в двух шагах подряд стирки. Используйте 800 мкл раствора трипсина/ЭДТА на 6-Ну и Инкубируйте на 37 ° C и 5% CO2 в стерильных инкубатор для 3-5 мин остановка ферментативной активности с помощью 1200 мкл DMEM, содержащие 10% FCS.
    3. Определите номер ячейки с помощью Нойбауэр клеток подсчета палаты и добавить менее 1 x 105 клеток в подготовленных трубки СУИМ.
    4. Суспензию клеток центрифуги для 10 мин на 300 x g при 4 ° C. Выполните два Стиральная, удалив супернатанта, resuspending клеток в 1 мл ФК буфера и центрифугирование 10 мин на 300 x g при 4 ° C.
    5. Подготовка окрашивание смесь, добавив анти мышь мышь CD45-PE (1: 100) борьбе с ФК буфера и CD31-FITC антитела (1: 100).
    6. Ресуспензируйте клетки в 100 мкл окрашивания микс в СУИМ трубы. Инкубируйте 30 мин при 4 ° C. Добавьте 1 mL ФК буфера. Суспензию клеток центрифуги для 5 мин на 300 x g при 4 ° C. Тщательно удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки в 200 мкл буфера ФК.
    7. Мера клетки в проточный цитометр после стробирования стратегия показано на рисунке. 2A.
  2. Можно также выполните, иммунофлюоресценции окрашивание первичных мышиных MMEC после второго CD31-MCS-шаг.
    1. Пальто coverslips.
      1. Передача стерильные 13 мм диаметром круглые стекло coverslip в колодец 24 хорошо плиты. Пальто coverslip, добавляя 300 мкл раствора покрытия скорость на хорошо. Инкубируйте 3 – 5 мин при комнатной температуре (RT).
      2. Аспирационная и отменить решение покрытия. Промойте каждую лунку с 2 мл стерильного PBS в два этапа подряд стирки. Аспирационная и отбросить PBS.
      3. Семян 1 x 105 клеток в 1 мл ECM на покрытые coverslip и Инкубируйте на 37 ° C и 5% CO2 в стерильных инкубатор, до тех пор, пока клетки являются 99% притока.
    2. Выполнение фиксации и окраски иммунофлюоресценции.
      1. Удалите средство ECM культивируемых клеток от 5.2.1.3.
      2. Исправить культивируемых клеток путем добавления параформальдегида 4% 300 мкл (PFA) с рН 7,4 на колодец, за 10 мин при 4° C.
        ОСТОРОЖНОСТЬЮ: PFA токсичных и должны быть обработаны с осторожностью.
      3. 3 выполните Стиральная, добавив 1 мл PBS на хорошо и удалить супернатант после 5 мин на RT.
      4. Подготовьте блокирования решения с 5% BSA, 0,2% Тритон-X и 1% козьего сыворотки в PBS.
      5. Добавить 300 мкл блокирования решения каждой скважины и инкубировать 1 час на RT.
      6. Удалить супернатант и 200 мкл на хорошо антитела анти PECAM-1 (CD31) (1: 200) в 5% BSA, 1% козьего сыворотки в PBS и Инкубируйте на 4 ° C на ночь.
      7. Выполните 3 мытье шаги путем добавления 1 мл PBS на колодец и удаления супернатанта после 5 минут в каждом шаге в рт.
      8. Подготовьте раствор вторичное антитело, содержащий Cy3-конъюгированных антител IgG против крыс (1: 500) в 1% BSA и PBS. 300 мкл на хорошо раствор вторичных антител и инкубировать 1 час на RT в темноте.
      9. Выполните 3 мытье шаги путем добавления 1 мл PBS на колодец и удаления супернатанта после 5 минут в каждом шаге в рт.
    3. Взять coverslips круглые стекла тщательно с щипцами и перенести его на слайд микроскопии. Добавьте соответствующее количество монтажа средних содержащие DAPI на слоя клеток и тщательно поставить стекло на него (см. прилагаемые Таблицы материалы).
    4. Соблюдать клетки с соответствующим флуоресценции микроскопом с источником света флуоресцирования (120 Вт) и два фильтра набора: набор фильтров возбуждения/выбросов с 550/25 Нм и 605/70 нм длины волн для обнаружения Cy3 540/562 Нм.
    5. Используйте фильтр второй набор с возбуждения/выбросов волны 365/50 Нм и 445/50 Нм для обнаружения DAPI 350/440 Нм. Использовать масштаб 40 x и 80% интенсивности 14.5 МВт/см2 для DAPI приобретение продолжительностью 30 г-жа для обнаружения Cy3 использовать 80% 67.5 МВт/см2 приобретение продолжительностью 60 мс.
  3. Выполняйте количественного PCR.
    1. Изоляция мРНК.
      1. Выполните стандартные процедуры, с помощью кислоты Гуанидиновые тиоцианат фенола (AGTP) реагента для изоляции мРНК. Используйте как минимум 0.5 x 106 клеток от CD45– CD31– (см. шаг 3.6.8), CD45– CD31+ (см. шаг 3.6.9.) фракций и культивируемых первичной мышиных MMEC (4.1.3)
      2. Суспензию клеток центрифуги для 10 мин на 300 x g при 20 ° C. Полностью снять супернатант. Ресуспензируйте Пелле клеток в 500 мкл суспензии клеток реагента и передачи AGTP в 2-мл пробирку реакции. Инкубируйте 5 мин на RT.
      3. 100 мкл хлороформе и встряхнуть для 15 s. инкубировать на 3 мин на RT.
      4. Подвеска центрифуги для 15 мин на 12000 x g при 4 ° C.
      5. Снять верхний водной фазе (содержащие РНК) тщательно и передачи в 1,5 мл реакции. 250 мкл изопропанола и проинкубируйте втечение 10 мин на RT.
      6. Выполните шаг центрифугирования в 12000 x g для 10 мин при 4 ° C.
      7. Возьмите супернатант и осторожно добавьте 1 mL 75% этанола. Центрифуга на 7500 x g 5 мин при 4 ° C.
        Примечание: Пелле легко потерять.
      8. Полностью удалите супернатант. Пусть Пелле сушат на воздухе для 5 – 10 мин.
        Примечание: этанола должен быть удален, но не слишком сухой.
      9. Растворяют гранулы в 30 мкл лечение Диэтилпирокарбонат воды, содержащей в и тепла в течение 10 минут при температуре 55 ° C.
        Примечание: Чистоты и концентрации РНК может быть измерен спектральных фотометр.
    2. Выполните синтез cDNA (обратная транскриптаза ПЦР).
      1. Подготовить mastermix, содержащий: 10 мкл буфера PCR (5 x), 2,5 мкл desoxyribonucleosid трифосфата (dNTP (10 мм)), 0.5 мкл случайных смесь одноцепочечной праймера (0,2 мкг / мкл), 1 мкл АБС битор РНКазы (40 ед / мкл, 0,4 обратной транскриптазы (200 U/мкл) и 5,6 мкл diethylpyrocarbonat очищенной воды (см таблица материалов).
      2. Разбавьте 500 нг РНК в 30 мкл воды Диэтилпирокарбонат лечение в 0.2 мл ПЦР пробирок и добавить весь mastermix 20 мкл.
      3. Использование ПЦР велосипедист, выполняя следующие шаги: 10 мин 25 ° C, 30 мин 50 ° C, 5 мин 85 ° C и удерживайте при 4 ° C.
  4. Выполняйте количественного PCR (ПЦР).
    Примечание: Выполните ПЦР образцов в дубликаты или triplicates.
  5. Используйте грунт с двумя различными флуоресценции красители. Грунтовка с поглощением 495 нм и выбросов 517 Нм для гена интереса.
  6. Для обнаружения экспрессии генов маркер Спутниковое ячейки, используйте грунты для парных поле белка 7 (Pax7) и M-Кадгерины (Cdh15) (см. прилагается Таблица материалов).
  7. Для обнаружения экспрессии генов маркер эндотелиальных клеток, используйте грунты для Клаудин-5 (Cld5), occludin (Ocln) и zonula occludens-1 (Tjp1 или ZO1) (см таблица материалов).
  8. Как ссылка ген 18s рРНК, используйте грунт с поглощением 538 Нм и выброс 554 Нм длины волны.
  9. Подготовьте mastermix ПЦР для каждого гена интереса с соответствующей грунтовки. MasterMix содержит: 10 мкл буфера ПЦР (2 x), 1 мкл грунтовка для гена интереса (10 мкм), 1 мкл грунтовка для 18s рРНК и 4 мкл нуклеиназы свободной воды.
  10. 16 мкл mastermix, один колодец 96-луночных реакции плиты. 4 мкл cDNA (полученные от шага 5.3.2.) за хорошо содержащие mastermix.
  11. Использовать в реальном времени PCR велосипедист, выполняя следующие шаги: проведение этапа с 50 ° C на 2 мин и 95 ° C на 10 мин Велоспорт сцену с 40 циклов 95 ° C 15 s и 60 ° C за 1 мин.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Один день после изоляции, первичный мышиных MMEC и остаточного другие клетки образуют конгломераты и придерживаться нижней части культуры блюд (день 1рис. 1A ). С дня 7 могут наблюдаться плоские и удлиненные клетки. Однако, до сих пор виден загрязнением других, главным образом клетки сфероида, (день 7рис. 1A ). Таким образом еще один цикл CD31 положительный выбор через MCS не требуется. Далее первичный мышиных MMEC размн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Микроваскулярная эндотелиальные клетки обеспечивают барьерные функции во всех тканях и результаты их дисфункции в болезни ассоциированных органов 3. Кроме того орган конкретных исследования микрососудистой ЕС может проложить путь для новых терапевтических стратегий. Таким образом более глубокое понимание микрососудистой EC функции в условиях физиологического и патофизиологические является большой научный интерес. Модуляции лейкоцита/эндотелия взаимодействия успешно используется для лечения рассеян...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют не конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана, «еще Kröner-Fresenius-Stiftung» (2018_A03 TR), «Инновационные Medizinische Тюрингия (МВФ) Münster» (I-RU211811 для TR) и Немецкий исследовательский фонд (DFG, INST 2105/27-1, меня 3283/5-1 и меня 3283/6-1 к SGM). Иллюстрированный изображения, предоставляемые Хайке Blum.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,25% Trypsin-EDTAThermo Fisher25200-056готовый к применению
буфер150 мМ NH4Cl, 10 мМ KHCO3, 0,1 мМ EDTA в воде при pH 7,3
Anti-mouse CD31-FITC (клон MEC13.3)Biolegend102506Контроль изотипа: FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl
Anti-mouse CD45-PE (клон 30-F11)Biolegend103106Контроль изотипа: PE Rat IgG2b, κ Изотип Ctrl
bFGFPeprotech100-18BОсновной фактор роста фибробластов
BSASigma AldrichA4503
CD31 Микрогранулымыши Miltenyi Biotec130-097-418
CD45 Микрогранулы мышиMiltenyi Biotec130-052-301
Коллагеназа-диспазеRoche10269638001Коллагеназа из V. alginolyticus, диспаза из B. polymyxa
Corning Costar TC-Trained TC-обработанные многолуночные 6-луночные планшетыCorning3516
Cy3-конъюгированное антитело IgG к крысамdianova712-166-153
DAPI (реагент ProLong Gold antifade с DAPI)Thermo FisherP36935
дезоксирибонуклеазаSigma AldrichD4513Дезоксирибонуклеаза I из поджелудочной железы крупного рогатого скота
Диэтилпирокарбонат обработанной водыThermo FisherAM9916
DMEM, содержащая добавку глутамина и пируватThermo Fisher31966-021подогреть до 37 градусов; C перед использованием
dNTP Mix (10 мМ)Thermo FisherR01921 мл
EDTASigma AldrichE5134
FACS tubesSarstedt551,579
Falcon 70 μ m Клеточное ситечкоCorning352350
FC буфер0,1% BSA, 0,2% NaN<суб>3, 2 мМ ЭДТА
Фетальная сыворотка для теленкаSigma AldrichF6178Фетальная сыворотка для теленка
Поправляемая жизнеспособность Краситель eFluor780Thermo Fisher65-0865-14
Щипцы (зубчатые, прямые, 12 см)Fine Science Tools11002-12
Щипцы (зубчатые, прямые, 12 см)Fine Science Tools11009-13
Инсулиновый шприц 100 Solo 1 мл (Omnifix)Braun9161708V
(колонки LS)Miltenyi Biotec130-042-401для CD45-MACS-step
MCS буфер0,5% БСА, 2 мМ ЭДТА в PBS при pH 7,2
Средняя магнитная колонка (колонка MS)Miltenyi Biotec130-042-201для CD31-MACS-step
Нуклеазная вода ThermoFisherR0581
PBSSigma AldrichPhosphate буферизованный физиологический раствор, готовый к использованию
ПЦР буфер (5x)Thermo FisherEP0742в комплекте с обратной транскриптазой
Pecam1 крыса &альфа;-мышьSantaCruzSc-52713100 &; г/мл
Пенициллин-стрептомицинSigma AldrichP4333
первичные мышечные мышечные клеткиcelprogen66066-01
Primer Cdh15 (M-Cadherin)Thermo FisherMm00483191_m1FAM меченый
праймер Cldn5 (claudin-5)Thermo FisherMm00727012_s1FAM меченый
Primer Ocln (окклюдин)Thermo FisherMm00500912_m1FAM меченый
праймер Pax-7Thermo FisherMm01354484_m1FAM меченый
праймер Tjp-1 (Zonula occludens 1)Thermo FisherMm00493699_m1FAM меченый
праймер 18s рРНК (эукариотический эндогенный контроль)Thermo Fisher4310893EVIC меченый
кПЦР буфер (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X)Thermo FisherK02312 х 1,25 мл; для 200 реакций каждая
Случайная смесь одноцепочечного праймераThermo FisherSO142Random Hexamer Primer
Обратная транскриптаза (200 U/μ L) + ПЦР-буфер (5x)Thermo FisherEP0742
(40 Ед/&м; L)Ножницы Thermo FisherEO0381
(режущая кромка 23 мм, острый/острый)Ножницы Fine Science Tools14088-10
(режущая кромка 42 мм, острый/тупой)Fine Science Tools14001-13
Скоростной раствор для нанесения покрытийPeloBiotechPB-LU-000-0002-00
ACK Большие магнитные колонки Ингибитор рназы

Ссылки

  1. Rodrigues, S. F., Granger, D. N. Blood cells and endothelial barrier function. Tissue Barriers. 3 (1-2), e978720(2015).
  2. Michiels, C. Endothelial cell functions. Journal of Cellular Physiology. 196 (3), 430-443 (2003).
  3. Pierce, R. W., Giuliano, J. S. Jr, Pober, J. S. Endothelial cell function and dysfunction in critically ill children. Pediatrics. 140 (1), Epub 2017 Jun 1 (2017).
  4. Nasdala, I., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H., et al. A transmembrane tight junction protein selectively expressed on endothelial cells and platelets. Journal of Biological Chemistry. 277 (18), 16294-16303 (2002).
  5. Sano, H., Sano, Y., Ishiguchi, E., et al. Establishment of a new conditionally immortalized human skeletal muscle microvascular endothelial cell line. Journal of Cellular Physiology. 232 (12), 3286-3295 (2017).
  6. Kappos, L., Bates, D., Edan, G., et al. Natalizumab treatment for multiple sclerosis: Updated recommendations for patient selection and monitoring. Lancet Neurology. 10 (8), 745-758 (2011).
  7. Birbrair, A., Zhang, T., Wang, Z. M., et al. Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential. Stem Cell Research. 10 (1), 67-84 (2013).
  8. Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (93), e52204(2014).
  9. Hwang, I., An, B. S., Yang, H., Kang, H. S., Jung, E. M., Jeung, E. B. Tissue-specific expression of occludin, zona occludens-1, and junction adhesion molecule A in the duodenum, ileum, colon, kidney, liver, lung, brain, and skeletal muscle of C57BL mice. Journal of Physiology and Pharmacology. 64 (1), 11-18 (2013).
  10. Frye, C. A., Patrick, C. W. Jr Isolation and culture of rat microvascular endothelial cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 38 (4), 208-212 (2002).
  11. Le, G. Y., Essackjee, H. C., Ballard, H. J. Intracellular adenosine formation and release by freshly-isolated vascular endothelial cells from rat skeletal muscle: Effects of hypoxia and/or acidosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 450 (1), 93-98 (2014).
  12. Cheung, K. C., Marelli-Berg, F. M. Isolation of microvascular endothelial cells. Bio-protocol. 8 (12), (2018).
  13. Ieronimakis, N., Balasundaram, G., Reyes, M. Direct isolation, culture and transplant of mouse skeletal muscle derived endothelial cells with angiogenic potential. PLoS One. 3 (3), e0001753(2008).
  14. Pham, M. T., Pollock, K. M., Rose, M. D., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

MMECCD31CD45
Изоляция микрососудистой эндотелиальных клеток первичного мышиных скелетных мышц
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.