Neurospheres выращивают как 3D культур являются мощным инструментом для изучения биологии глиомы. Здесь мы представляем протокол для выполнения иммуногистохимия при сохранении 3D структура глиомы neurospheres через встраивание парафина. Этот метод позволяет характеристика глиомы нейросферы свойств, таких как stemness и нейронных дифференциации.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Оценка биомаркеров в глиомы, иммуногистохимия на парафин врезанных 3D глиомы нейросферы культур
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Анализ выражения протеина в глиомы актуальна для ряда аспектов в изучении его патологии. Многочисленные белки были описаны как биомаркеров с приложениями в диагноз, прогноз, классификации, состояние прогрессии опухоли и состояния дифференцировки клеток. Эти анализы биомаркеров полезны также для характеристики опухоли neurospheres (NS) генерируется глиомы пациентов и глиомы модели. Опухоль NS обеспечивают ценный в vitro модель для оценки различных характеристик опухоли, из которого они являются производными и может более точно зеркало глиомы биологии. Здесь мы описываем метод подробный анализ биомаркеров в опухоли NS с помощью иммуногистохимия (IHC) на опухоли парафин врезанных NS.
Введение
Глиомы являются первичных твердых опухолей центральной нервной системы, классифицируются по их Фенотипические и генотипические характеристики согласно Всемирной организации здравоохранения1. Эта классификация включает в себя наличие или отсутствие драйверов мутаций, которые представляют собой привлекательный источник биомаркеров2. Биомаркеры являются биологические характеристики, которые могут быть измерены и оценены для обозначения нормальных и патологических процессов, а также фармакологических ответов на терапевтическое вмешательство3. Биомаркеры могут быть обнаружены в опухолевой ткани и клетк....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из университета штата Мичиган.
1. поколение Neurospheres опухоли мозга, производных от модели мыши
- Перед процедурой рассечение, подготовить нервных стволовых клеток СМИ (средства массовой информации НСК: DMEM/F12 с 1 x B27 дополнение, дополнение 1 x N2, 1 x normocin и 1 x антибиотик/противогрибковое дополнена человеческого рекомбинантного EGF и basic ФБП в концентрации 20 нг/мл каждый). Залейте 1,5 мл 300 мкл НСК СМИ и зарезервировать для позже.
- Выберите мышь с большой опухоли.
Примечание: Размер опухоли может кон....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Для мониторинга развития опухоли и оценить, если опухоль достигла размера, необходимого для создания NS, мы проанализировали люминесценции, испускаемых опухоли с помощью биолюминесценции. Это позволяет исследование эффективности трансдукции детенышей и прогрессии опухоли, сигнал люминесценции Люцифераза (рис. 1A и 1B). Когда размер опухоли достигает сигнал 1 x 107 фотоны/s/см2/sr (рис. 1
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этой статье мы подробно универсальным и воспроизводимый метод, чтобы выполнить иммуногистохимия на парафин врезанных глиомы NS, которые поддерживают характерным 3D структура клеток опухоли, растущие в мозг в situ. Этот метод имеет следующие преимущества по сравнению с использованием клеток покрытием на стеклянных или пластиковых поверхностей: i) сохранение 3D структуры НС; II) избегая стресса диссоциации клеток перед анализ экспрессии белков; III) закалки любых эндогенных Флюорофор выражения из генетически опу.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Эта работа была поддержана национальных институтов из здравоохранения/Национальный институт от неврологических расстройств и инсульта (NIH/NINDS) гранты R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 до M.G.C.; NIH/NINDS предоставляет R01-NS076991, R01-NS082311 и R01-NS096756 P.R.L.; NIH/NINDS R01-EB022563; 1UO1CA224160; Кафедра нейрохирургии; Счастливые сердца Лии M.G.C. и P.R.L.; и РНК биомедицины Грант F046166 в M.G.C. F.M.M. поддерживается путем F31 NIH/NINDS-F31NS103500. Ю.П. была поддержана Фулбрайта-аргентинский Министерства спорта и образования стипендий.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Покрытое лезвие микротома HP35 | Thermo Scientific | 3150734 | |
| Microtome RM 2135 | Leica | MR2135 | |
| Раствор формалина, нейтральный буферный, 10% | Sigma-aldrich | HT501128-4L | |
| Кролик поликлональный анти-ATRX, | Santa Cruz Biotechnology | sc-15408 | IHC, разведение 1:250 |
| Кролик поликлональный анти-Ki-67 | Abcam | Ab15580 | IHC, 1:1000 разведение |
| Кролик поликлональный анти-OLIG2 | Millipore | AB9610 | IHC, 1:500 разведение |
| Козий поликлональный анти-кроличий биотин-конъюгированный | Dako | E0432 | IHC, 1:1000 разведение |
| Vectastain Elite ABC HRP kit | Vector Laboratories Inc | PK-6100 | |
| BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT | Biocare medical | BDB2004 л/цена до 12/18 | |
| N-2 Добавка | ThermoFisher | 17502048 | |
| N-27 Добавка | ThermoFisher | A3582801 | |
| Accutase® Раствор для отслоения клеток | Biolegend | 423201 | |
| AGAROSE LE | GoldBio | A-201-1000 | |
| Genesee Sc. Corporation | Olympus 15 мл | 21-103 | |
| Genesee Sc. Corporation | TC-75 обработанная колба | 25-209 | |
| Genesee Sc. Corporation | TC-25 обработанная колба | 25-207 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330-057 | NS media |
| HBSS Gibco | TM | 14175-103 | сбалансированный солевой раствор |
| C57BL/6 | Taconic | B6-f | C57BL/6 мышь |
Ссылки
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropatholica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Hochberg, F. H., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
