Количественная оценка гетерогенных распределение синаптических белков в мозг мыши, с помощью иммунофлюоресценции

Summary

Здесь мы описываем количественный подход к определению распределение синаптических белков относительно белка маркер, с помощью окрашивания иммунофлюоресценции, confocal микроскопии и анализа на основе компьютера.

Abstract

Наличие, отсутствие или уровня конкретных синаптических белков может сильно влияние синаптической передачи. В дополнение к разъяснению функцию белка, жизненно важно также определить его распространения. Здесь мы описываем протокол, используя иммунофлюоресценции, конфокальная микроскопия и компьютерного анализа для определения распределения синаптических белков двигателем (также называется TPRGL или SVAP30). Мы сравниваем распределение Mover, синаптических пузырьков synaptophysin белка, таким образом определяя распределение движенца в количественном выражении по отношению к обилие синаптических пузырьков. В частности этот метод может быть реализован потенциально для сравнения распределения белков, с использованием различных антител или Микроскопы или через различные исследования. Наш метод обходит присущих изменчивости immunofluorescent stainings, уступая соотношение, вместо того, чтобы абсолютное флуоресценции уровнях. Кроме того, мы описываем метод позволяет исследователю проанализировать распределение белка на разных уровнях: от весь мозг срезы мозга районы для различных субрегионов в области один мозг, например различные слои гиппокампа или сенсорными коре. Мувер является белок позвоночных животных конкретных, связанный с синаптических пузырьков. С помощью этого метода мы показываем, что двигателем гетерогенно распределяется между областях мозга, с высоким уровнем в вентральной pallidum, межжелудочковой перегородки ядер и миндалины, а также в пределах одного мозга областях, таких как различные слои гиппокампа.

Introduction

Связь между нейронами происходит на специализированных сайтах контакта, называется синапсы. Синапсы содержат множество различных белков, которые оркестровать синаптической передачи. Некоторые из этих белков показывают гетерогенных распределение всей нервной системы и не присутствуют в каждом синапсе¹. Одним из примеров такого белок является Munc13, который участвует в процессе грунтования синаптических пузырьков. Существуют разные изоформы Munc13, которые распространяются гетерогенно во всем мозг², и наличие или отсутствие конкретных изоформ могут влиять на краткосрочные синаптической пластичности и синаптических пузырьк....

Protocol

Этот протокол не предусматривает эксперименты на живых животных. Эксперименты с euthanizing животных для получения образцов мозга были утверждены властями местной защиты животных (Tierschutzkommission der этот Гёттинген) под номером официального утверждения T 10/30.

Примечание: Для этого протокола, были использованы 3 взрослых самцов мышей C57BL/6.

1. Пробоподготовка

1. Подготовьте фиксатором и 0,1 М фосфатного буфера (PB; см. таблицу 1).
2. Исправить животное, transcardial перфузии, как описано в Гейдж и др. ²⁸. сначала промыть крови с 0,9% раствор ....

Results

Представитель окрашивания моделей различных маркеров можно увидеть на рисунке 1. Шаблон варьируется в зависимости от распределения белка. Примеры из пяти уровней rostro хвостового приводятся в колонках (A)-(E). Представитель DAPI пятнать показано в первой строке: DAPI придерживается ДНК клетки и таким образом окрашенных ядер. Это приводит к пунктата шаблон. Регионы с высоким клетки плотностью ярче, чем в регионах с низкой сот.......

Discussion

Метод здесь представлены направлена на количественной оценки распределения протеин интереса по отношению к обилие белка маркера с известным распределения. Иммунофлюоресценции пятнать может показать высокая изменчивость окраски интенсивности между различными секторами. Количественная оценка подход, описанный здесь обходит эту проблему, определяя отношение протеин интереса в среднем по всему полушарию. Таким образом различные интенсивности окрашивания через срезы отменяются и позволяют для количественного описания.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,5 мл реакционные пробирки	Eppendorf	30120094
50 мл реакционные пробирки	Greiner Bio-One	227261
мультилунки 24 лунки	Fisher Scientific	087721H
Дозатор пластиковый (одноразовый)	Sarstedt	861,176
Дозатор 1000 мл	Rainin
пипетка 2 мл	Eppendorf	3123000012
Vortex Genius 3	Предметные
Menzel	Fisher Scientific	10144633CF
Стереоскоп	Leica
LSM800	Конфокальный микроскоп	Zeiss
замораживающий микротом	Leica
PBS (10X)	Roche
ПФА	Сигма	P6148-1KG
NaCl	BioFroxx	1394KG001
сахароза	neoFroxx	1104KG001
салфетка Tek	Sakura	4583	OCT
Na2HPO4	BioFroxx	5155KG001
NaH2PO4	Merck	1,063,460,500
нормальная козья сыворотка	Merck Millipore	S26-100ML
нормальная ослиная сыворотка	Merck	S30-100ML
Triton X-100	Merck	1,086,031,000
кролик анти-Mover	Synaptic Systems	RRID: AB_10804285
морская свинка анти-синаптофизин	синаптические системы	RRID: AB_1210382
ослиный анти-кролик AF647	Jackson ImmunoResearch	RRID: AB_2492288
козий анти-мышиный AF488	Jackson ImmunoResearch	RRID: AB_2337438
Mowiol4-88	Calbiochem
ZEN2 blue программное обеспечение	Zeiss		программное обеспечение для микроскопии
FIJI	ImageJ		Программное обеспечение
для анализа Microsoft Excel	Microsoft