Method Article

Количественная оценка гетерогенных распределение синаптических белков в мозг мыши, с помощью иммунофлюоресценции

DOI:

10.3791/58940

⸱

January 29th, 2019

 ,  , 
1Institute of Anatomy and Embryology, University Medical Center Göttingen

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем количественный подход к определению распределение синаптических белков относительно белка маркер, с помощью окрашивания иммунофлюоресценции, confocal микроскопии и анализа на основе компьютера.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Наличие, отсутствие или уровня конкретных синаптических белков может сильно влияние синаптической передачи. В дополнение к разъяснению функцию белка, жизненно важно также определить его распространения. Здесь мы описываем протокол, используя иммунофлюоресценции, конфокальная микроскопия и компьютерного анализа для определения распределения синаптических белков двигателем (также называется TPRGL или SVAP30). Мы сравниваем распределение Mover, синаптических пузырьков synaptophysin белка, таким образом определяя распределение движенца в количественном выражении по отношению к обилие синаптических пузырьков. В частности этот метод может быть реализован потенциально для сравнения распределения белков, с использованием различных антител или Микроскопы или через различные исследования. Наш метод обходит присущих изменчивости immunofluorescent stainings, уступая соотношение, вместо того, чтобы абсолютное флуоресценции уровнях. Кроме того, мы описываем метод позволяет исследователю проанализировать распределение белка на разных уровнях: от весь мозг срезы мозга районы для различных субрегионов в области один мозг, например различные слои гиппокампа или сенсорными коре. Мувер является белок позвоночных животных конкретных, связанный с синаптических пузырьков. С помощью этого метода мы показываем, что двигателем гетерогенно распределяется между областях мозга, с высоким уровнем в вентральной pallidum, межжелудочковой перегородки ядер и миндалины, а также в пределах одного мозга областях, таких как различные слои гиппокампа.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Связь между нейронами происходит на специализированных сайтах контакта, называется синапсы. Синапсы содержат множество различных белков, которые оркестровать синаптической передачи. Некоторые из этих белков показывают гетерогенных распределение всей нервной системы и не присутствуют в каждом синапсе1. Одним из примеров такого белок является Munc13, который участвует в процессе грунтования синаптических пузырьков. Существуют разные изоформы Munc13, которые распространяются гетерогенно во всем мозг2, и наличие или отсутствие конкретных изоформ могут влиять на краткосрочные синаптической пластичности и синаптических пузырьков динамики3, 4 , 5. Таким образом, он имеет жизненно важное значение, чтобы иметь возможность определить наличие различных синаптических белков различных областях мозга.

Методы выбора для квантификации синаптических белков - пока -, масс-спектрометрия и западной blotting, вместо иммуногистохимия6,,78,9. В некоторых случаях несколько методов используются для дополнения друг друга, чтобы оценить количество и локализации специфических белков (то есть, Вильгельм и др. 10). метод, мы опишем здесь позволяет для локализации и количественной оценки протеинов интереса без необходимости использования любого биохимического метода, просто используя immunofluorescent stainings. Еще одним преимуществом здесь является количественная оценка может быть сделано над районами гораздо меньше, и, таким образом, более конкретные, чем достичь другими методами. Однако надо принимать во внимание, что белок надежные ссылки необходимы для оценки распределения протеина интереса.

Флуоресцентный окрашивание по иммуногистохимия позволяет нам регулярно выявить Локализация белков различных областях мозга, а также в рамках различных нейрональных отсеков. Для идентификации различных отсеках, используются конкретные маркеры. Как правило антитела против синапсины и synaptophysin11 может использоваться для обозначения синаптических пузырьков, в то время как антитела против Фагот ярлык активную зону пресинаптической терминал12. Везикулярный транспортер, например глютамат Везикулярный транспортер (vGluT) или Везикулярный транспортер ГАМК (vGAT), используются для обозначения возбуждающим13 и тормозящий14 Пресинаптический терминалы, соответственно. На стороне постсинаптических антитела против белков Гомер может использоваться для Марк постсинаптических терминалы и антител против постсинаптических плотность белка 95 (PSD95)15,,1617 или gephyrin18 , 19 , 20 может маркировать возбуждающим или тормозной постсинаптический терминалы, соответственно. С помощью антител против протеина интереса и маркеры например, описанным выше, можно определить локализацию таких белков. Многие исследования на сегодняшний день это сделали в качественным образом21. Однако достоверно определить дифференцированного распределения конкретных синаптических белков, нужно не только определить свое присутствие или отсутствие, но также его относительной концентрации. Неоднородности размеров и плотности синапсы делает его важным установить соотношение между синаптических маркер и протеина интереса. В противном случае СИНАПС богатые регионы, как-пирамидальной слои гиппокампа и молекулярный слой мозжечка покажет высокой плотности синаптических белков, только благодаря более высокой плотности синапсов но не сильное присутствие этого белка в каждый синапс (например, Wallrafen и Dresbach-1). С другой стороны белки в нейрональных Сома (например, TGN3822) обычно покажет сильное присутствие в гиппокампе пирамидальной клетке слоя или слоя клеток гиппокампа или мозжечковая гранул из-за высокой концентрации нейрональных клеток органов в этих областях. Таким образом эта неоднородность распределения структур, в этом случае синапсов, может привести к ложной оценки распределения протеина интереса сам. Кроме того существует внутренняя изменчивость в пятнать интенсивностей различных образцов в stainings иммуногистохимии. Протокол, описанные здесь принимает это во внимание и избегает такого предубеждения, а также другие предостережения, которые возникают от иммуногистохимических методов.

В наши последние исследования, мы использовали этот метод для описания дифференциального выражение движителя (также называемый TPRGL23 или24SVAP30) через 16 различных мозга области1. Мувер является позвоночных конкретных синаптических белок, который можно найти в ассоциации для синаптических пузырьков и влияет нейромедиатора релиз25,,2627. Мы связаны Mover выражение обилие синаптических пузырьков, путем пятнать для synaptophysin как маркер ссылки синаптических пузырьков. Мы нашли высокие уровни движителя особенно в межпредсердной перегородки ядер и брюшной pallidum, миндалины. В гиппокампе мы нашли гетерогенных распределение Mover, с высоким уровнем в слои, связанные с внутри гиппокампа вычисления и низкий уровень в слои ввода и вывода.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол не предусматривает эксперименты на живых животных. Эксперименты с euthanizing животных для получения образцов мозга были утверждены властями местной защиты животных (Tierschutzkommission der этот Гёттинген) под номером официального утверждения T 10/30.

Примечание: Для этого протокола, были использованы 3 взрослых самцов мышей C57BL/6.

1. Пробоподготовка

  1. Подготовьте фиксатором и 0,1 М фосфатного буфера (PB; см. таблицу 1).
  2. Исправить животное, transcardial перфузии, как описано в Гейдж и др. 28. сначала промыть крови с 0,9% раствор NaCl, затем perfuse с 30 мл параформальдегида 4% (PFA).
  3. Откройте черепа с ножницами и тщательно изолировать с помощью ложки с тупыми краями, чтобы избежать повреждения ткани мозга.
  4. Заполнить 50 мл трубки реакции с фиксатором и постфиксная мозга в 4% PFA при 4 ° C на ночь.
  5. Снимите фиксатор и мыть мозга в 50 мл 0,1 М PB на шейкер для 30 мин.
  6. После мытья, Инкубируйте мозга в 50 мл трубки реакции в 30% сахарозы в 0,1 М PB для 48 ч или до тех пор, пока он тонет в трубе при 4 ° C для криозащиты.
  7. Trim cryoprotected мозга с острым лезвием, поместите его в cryomold и вставлять его с оптимального раскроя температуры (OCT) соединения. Избегайте пузырей. Ориент мозга и заморозить cryomold в морозилке-80 ° С.
  8. Смонтируйте замороженные ткани для разрезания. Сбалансировать ткани до температуры cryomicrotome для по крайней мере 15 минут перед секционирование.
  9. Раздел мозга в 25 мкм толщиной корональные срезы. Нажмите OCT тщательно с крюком стекла без касатьться ткани мозга. Сбор 3 прилегающих фрагментов в скважину в 24 хорошо пластины и хранить их в 0,1 М PB на 4 ° C до окрашивания.
    Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь до двух недель. Время хранения может вмешиваться с качеством ткани и таким образом повлиять на результат эксперимента.

2. иммунофлуоресценции

  1. Подготовка решений включая блокирующий буфер, буфер антитела, мытье буфер 1 и Отмывающий буфер 2 (см. таблицу 1).
  2. Промывайте ломтики с PB для удаления избыточных OCT.
    1. Удаление решения с пластиковая Пипетка без сосание в срезах головного мозга. 250 мкл свежие PB с 1000 мкл пипетки.
      Предупреждение: Фрагменты, не следует высохнуть, так что удалить и добавить жидкости от скважины.
  3. Удаление PB с Пластиковые пипетки и 250 мкл блокировки буфера в колодец с 1000 мкл пипетки. Инкубируйте 3 ч при комнатной температуре (RT) на шейкер.
  4. Во время инкубации разбавляют первичных антител в буфере антитела в пробирке реакция. Использовать буфер для 250 мкл антител на хорошо и добавить соответствующее количество антител (см. таблицу 2), закупорить непосредственно в раствор с помощью пипетки 2 мкл. Mix решение, мягко закупорить вверх и вниз несколько раз. Вихрь вскоре после этого, для обеспечения надлежащего перемешивания.
    Примечание: Для определения фона флуоресценции, stainings также должны выполняться без добавления основного антитела. Для этого Инкубируйте среза в раствор антител без первичного антитела согласно протоколу.
  5. После инкубации время Удалите блокирующий буфер с Пластиковые пипетки и 250 мкл антител раствора, содержащего первичных антител в колодец. Инкубируйте ломтики с основное антитело на ночь при 4 ° C на шейкер.
  6. Следующий день, вымойте ломтики отмывающим буфером 1 3 x 10 мин на RT на шейкер.
    1. Удаление среды с Пластиковые пипетки и 300 мкл отмывающего буфера 1 за хорошо. Инкубируйте на RT для 10 минут повторите 3 раза.
  7. Во время стирки шаги развести Флюорофор сочетании вторичные антитела в буфере антитела в пробирке реакция. Использовать буфер для 250 мкл антител на хорошо и добавить соответствующее количество антител (см. таблицу 2), закупорить непосредственно в раствор с помощью пипетки 2 мкл. Mix решение, мягко закупорить вверх и вниз несколько раз. Вихрь вскоре после этого, для обеспечения надлежащего перемешивания.
    Предупреждение: Ведь светочувствительные, антитела все шаги от этой точки зрения должны быть выполнены в темноте.
  8. После стирки шаги, удалить буфер с пластиковых дозаторов для стирки и 250 мкл раствор антител, содержащие вторичные антитела в колодец. Инкубируйте ломтики с вторичное антитело 90 мин на RT в темноте.
  9. Вымойте ломтики отмывающим буфером 2 3 x 10 мин на RT.
  10. Во время стирки шаги разбавляют 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) в 0,1 М PB в концентрации 1: 2000.
  11. Отмывающий буфер 2 с пластиковая Пипетка Удалить и 250 мкл раствора DAPI на хорошо. Инкубируйте 5 мин на RT на шейкер.
  12. Удаление решения DAPI с Пластиковые пипетки и 500 мкл 0,1 М PB в колодец с 1000 мкл пипетки.
  13. Смонтируйте ломтики на скольжениях микроскопа.
    1. Место микроскопа под стереоскоп. С тонкой кистью добавьте три отдельные капли 0,1 М PB на слайд. Поместите один срез на каплю на слайд микроскопа.
    2. Используйте тонкой кистью для выравнивания и ориентировать ломтики на микроскопа.
    3. Когда все фрагменты расположены правильно, удалите избыток PB салфеткой и тщательно высушите слайд.
      Предостережение: Избегайте сушки срезы мозга полностью.
    4. 80 мкл встраивания среднего на слайд. Осторожно опустите coverslip на слайд, тем самым встраивание срезы мозга.
    5. Оставьте слайды для просушки в вытяжной шкаф для 1-2 ч (покрыть их, чтобы избежать воздействия света) и хранить их в коробке слайд микроскопа при 4 ° C.
      Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь.

3. томография

  1. После внедрения среды полностью закаленные, место микроскопа под конфокального микроскопа.
    Примечание: В сочетании с программным обеспечением деконволюция микроскопия помощью эпифлуоресцентного должна принести аналогичные качества изображения.
  2. Настройте параметры лазера путем увеличения или уменьшения интенсивности лазера для каждого канала, так что несколько пикселей переэкспонированных для обеспечения максимального распределения серого значений.
  3. Приобрести виртуальные тканей весь мозг фрагмента для различных каналов.
    1. В программе обработки изображений (см. Таблицу материалы), выберите параметр плитки и вручную определить срез мозга с Установки плитки региона.
    2. Распространять опорных точек во всем регионе плитки и отрегулировать фокус на различных опорных точек, нажав Проверить плитка регионов/позиций...
    3. Настройки в Режиме приобретения желаемого резолюции и файла размер результирующего изображения и начать сканирование.
  4. Когда проверка завершается, используйте функцию колющие для обработки виртуального ткани. Экспортируйте в формате .tif с функцией Экспорта изображения.

4. компьютер-анализ

  1. Загрузить все отдельные каналы для одного изображения в Фиджи29 , нажав файл | Открытые.
  2. С помощью инструмента Freehand выделения разграничить одного полушария в DAPI-канале. Создание маски выделения, нажав Edit | Выбор | Создание маски.
  3. Определить интенсивность средняя флуоресценции для одного канала (Mover и synaptophysin), нажав анализ | Мера.
    Примечание: Не забудьте выбрать различные каналы для определения значений интенсивности среднее флуоресценции для каждого канала.
  4. Скопируйте интенсивность средняя флуоресценции для отдельные каналы в электронную таблицу.
  5. Определите интенсивность средняя флуоресценции один каналов в области, представляющей интерес для разграничения области также инструментом Freehand выделение . Атлас мозга мыши используйте как Справка.
  6. Повторите шаги 4.1-4.5 для всех полушариях и во всех областях, представляющих интерес.
    Примечание: Определить значения для каждого полушария отдельно для того, чтобы позже сравнить значения в области, представляющей интерес, в Западном полушарии (см. шаг 5.2).

5. Данные обработки

  1. В случае, если фон флуоресценции высокой (см. обсуждение), вычитание фона могут быть необходимы. Для этого, определить интенсивность средняя флуоресценции для фрагмента, обрабатываются без первичного антитела против белков ссылка (здесь: synaptophysin) и вычесть это значение из всех значений, полученных для мозга и полушарий.
  2. Когда были определены среднее флуоресценции интенсивности для отдельные каналы для каждого полушария и каждая область интересов (см. таблицу 3), рассчитать коэффициент движенца к synaptophysin путем деления значения для движенца значение для synaptophysin ( желтый цвет в таблице 3). Выполните это действие для каждого полушария и каждая область интересов отдельно.
  3. Разделите коэффициент для одной области интереса соотношение, полученные для соответствующего полушария (оранжевый в таблице 3) для определения коэффициента области, представляющие интерес для нашего полушария.
  4. Чтобы определить относительное изобилие Mover, перевод соотношение, полученные в 5.2 в процентах путем определения ее отклонение от 1 (красная в таблице 3). Поэтому коэффициент 1,25 даст относительное изобилие Mover 25% выше среднего, и отношение 0,75 даст относительное изобилие Mover 25% ниже среднего.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представитель окрашивания моделей различных маркеров можно увидеть на рисунке 1. Шаблон варьируется в зависимости от распределения белка. Примеры из пяти уровней rostro хвостового приводятся в колонках (A)-(E). Представитель DAPI пятнать показано в первой строке: DAPI придерживается ДНК клетки и таким образом окрашенных ядер. Это приводит к пунктата шаблон. Регионы с высоким клетки плотностью ярче, чем в регионах с низкой сот...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Метод здесь представлены направлена на количественной оценки распределения протеин интереса по отношению к обилие белка маркера с известным распределения. Иммунофлюоресценции пятнать может показать высокая изменчивость окраски интенсивности между различными секторами. Количественная оценка подход, описанный здесь обходит эту проблему, определяя отношение протеин интереса в среднем по всему полушарию. Таким образом различные интенсивности окрашивания через срезы отменяются и позволяют для количественного описания.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Ирмгард Weiss за отличную техническую помощь. Авторы признают поддержка Гермес Pofantis и Andoniya Петкова. Авторы также поблагодарить Европейский институт неврологии для использования LSM800 и технической помощи, особенно д-р Нильс Halbsgut. Эта работа финансировалась медицинский центр Гёттингенский университет. ЗАО признает поддержка центром наноразмерных микроскопии и молекулярной физиологии мозга (CNMPB).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,5 мл реакционные пробиркиEppendorf30120094
50 мл реакционные пробиркиGreiner Bio-One227261
мультилунки 24 лункиFisher Scientific                                                                                                                                                                                              087721H
Дозатор пластиковый (одноразовый)Sarstedt861,176
Дозатор 1000 млRainin 
пипетка 2 млEppendorf3123000012
Vortex Genius 3 Предметные
MenzelFisher Scientific                                                                                                                                                                                  10144633CF
СтереоскопLeica
LSM800Конфокальный микроскопZeiss
замораживающий микротомLeica
PBS (10X)Roche                                                                                                                                                                           
ПФАСигма                                                                                                                                                                                      P6148-1KG
NaClBioFroxx1394KG001
сахарозаneoFroxx1104KG001
салфетка TekSakura 4583OCT
Na2HPO4BioFroxx5155KG001
NaH2PO4Merck1,063,460,500
нормальная козья сывороткаMerck MilliporeS26-100ML
нормальная ослиная сывороткаMerckS30-100ML
Triton X-100Merck1,086,031,000
кролик анти-MoverSynaptic SystemsRRID: AB_10804285
морская свинка анти-синаптофизинсинаптические системыRRID: AB_1210382
ослиный анти-кролик AF647Jackson ImmunoResearchRRID: AB_2492288
козий анти-мышиный AF488Jackson ImmunoResearchRRID: AB_2337438
Mowiol4-88Calbiochem                                                                                                                                                                                                   
ZEN2 blue программное обеспечениеZeissпрограммное обеспечение для микроскопии
FIJIImageJПрограммное обеспечение
для анализа Microsoft ExcelMicrosoft
17014382 стекла микроскопа IKA 3340001 11666789001475904

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wallrafen, R., Dresbach, T. The Presynaptic Protein Mover Is Differentially Expressed Across Brain Areas and Synapse Types. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 58(2018).
  2. Augustin, I., Betz, A., Herrmann, C., Jo, T., Brose, N. Differential expression of two novel Munc13 proteins in rat brain. Biochemical Journal. 337, 363-371 (1999).
  3. Rosenmund, C., et al. Differential Control of Vesicle Priming and Short-Term Plasticity by Munc13 Isoforms. Neuron. 33, 411-424 (2002).
  4. Breustedt, J., et al. Munc13-2 differentially affects hippocampal synaptic transmission and plasticity. Cerebral cortex. 20, 1109-1120 (2010).
  5. Chen, Z., Cooper, B., Kalla, S., Varoqueaux, F., Young, S. M. The Munc13 Proteins Differentially Regulate Readily Releasable Pool Dynamics and Calcium-Dependent Recovery at a Central Synapse. The Journal of Neuroscience. 33, 8336-8351 (2013).
  6. Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A Defined Methodology for Reliable Quantification of Western Blot Data. Mol Biotechnol. , (2013).
  7. Charette, S. J., Lambert, H., Nadeau, P. J., Landry, J. Protein quantification by chemiluminescent Western blotting Elimination of the antibody factor by dilution series and calibration curve. Journal of Immunological Methods. 353, 148-150 (2010).
  8. Heidebrecht, F., Heidebrecht, A., Schulz, I., Behrens, S., Bader, A. Improved semiquantitative Western blot technique with increased quantification range. Journal of Immunological Methods. 345, 40-48 (2009).
  9. Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry. Laboratory Investigation. 97, 329-334 (2017).
  10. Wilhelm, B. G., et al. Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins. Science. 344, 1023-1028 (2014).
  11. Navone, F., et al. Protein p38: An integral membrane protein specific for small vesicles of neurons and neuroendocrine cells. Journal of Cell Biology. 103, 2511-2527 (1986).
  12. Gundelfinger, E. D., Reissner, C., Garner, C. C. Role of Bassoon and Piccolo in Assembly and Molecular Organization of the Active Zone. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 7, (2016).
  13. Ziegler, D. R., Cullinan, W. E., Herman, J. P. Distribution of vesicular glutamate transporter mRNA in rat hypothalamus. Journal of Comparative Neurology. 448, 217-229 (2002).
  14. Chaudhry, F. A., et al. The vesicular GABA transporter, VGAT, localizes to synaptic vesicles in sets of glycinergic as well as GABAergic neurons. Journal of Neuroscience. 18, 9733-9750 (1998).
  15. Aoki, C., et al. Electron Microscopic Immunocytochemical SAP-97 at Postsynaptic, Presynaptic, and Nonsynaptic Sites of Adult and Neonatal Rat Visual Cortex. Synapse. 257, 239-257 (2001).
  16. Valtschanoff, J. G., et al. Expression of NR2 Receptor Subunit in Rat Somatic Sensory Cortex : Synaptic Distribution and Colocalization With NR1 and PSD-95. Journal of Comparative Neurology. 611, 599-611 (1999).
  17. Hunt, A., Schenker, L. J., Kennedy, B. PSD-95 Is Associated with the Postsynaptic Density and Not with the Presynaptic Membrane at Forebrain Synapses. Journal of Neuroscience. 76, 1380-1388 (1996).
  18. Luscher, B., Fuchs, T., Kilpatrick, C. L. GABA A Receptor Trafficking-Mediated Plasticity of Inhibitory Synapses. Neuron. 70, 385-409 (2011).
  19. Kirby, M. Understanding the molecular diversity of GABAergic synapses. 5, 1-12 (2011).
  20. Harris, K. M., Weinberg, R. J., Verrall, A. W. Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 1-30 (2012).
  21. Heise, C., et al. Selective Localization of Shanks to VGLUT1-Positive Excitatory Synapses in the Mouse Hippocampus. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, (2016).
  22. Peters, P. J., Yuan, L. C., Biology, C., Branch, M. Localization of TGN38 to the trans-Golgi network: involvement of a cytoplasmic tyrosine-containing sequence. Journal of Cell Biology. 120, 1123-1135 (1993).
  23. Antonini, D., et al. Tprg, a gene predominantly expressed in skin, is a direct target of the transcription factor p63. Journal of Investigative Dermatology. 128, 1676-1685 (2008).
  24. Burre, J., et al. Synaptic vesicle proteins under conditions of rest and activation: Analysis by 2-D difference gel electrophoresis. Electrophoresis. 27, 3488-3496 (2006).
  25. Kremer, T., et al. Mover is a novel vertebrate-specific presynaptic protein with differential distribution at subsets of CNS synapses. FEBS Letters. 581, 4727-4733 (2007).
  26. Ahmed, S., et al. Mover Is a Homomeric Phospho-Protein Present on Synaptic Vesicles. PLoS ONE. 8, (2013).
  27. Körber, C., et al. Modulation of Presynaptic Release Probability by the Vertebrate-Specific Protein Mover. Neuron. 87, 521-533 (2015).
  28. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. , 1-9 (2012).
  29. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, (2012).
  30. Schneider Gasser, E. M., et al. Immunofluorescence in brain sections: simultaneous detection of presynaptic and postsynaptic proteins in identified neurons. Nature Protocols. 1, 1887-1897 (2006).
  31. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , ACADEMIC PRESS. (2001).
  32. Sun, Y., Ip, P., Chakrabartty, A. Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy. Journal of Visualized Experiments. , 1-6 (2017).
  33. Poole, A. R., Dingle, J. T., Mallia, A. K. The localization of retinol-binding protein in rat liver by immunofluorescence microscopy. Journal of Cell Science. 394, 379-394 (1975).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Synaptic Protein DistributionImmunofluorescence ProtocolConfocal MicroscopyComputer Based AnalysisMover ProteinSynaptophysin ComparisonBrain Slice AnalysisFluorescence Intensity RatioHeterogeneous DistributionHippocampal Layers

Related Articles