Количественная оценка гетерогенных распределение синаптических белков в мозг мыши, с помощью иммунофлюоресценции

Связь между нейронами происходит на специализированных сайтах контакта, называется синапсы. Синапсы содержат множество различных белков, которые оркестровать синаптической передачи. Некоторые из этих белков показывают гетерогенных распределение всей нервной системы и не присутствуют в каждом синапсе¹. Одним из примеров такого белок является Munc13, который участвует в процессе грунтования синаптических пузырьков. Существуют разные изоформы Munc13, которые распространяются гетерогенно во всем мозг², и наличие или отсутствие конкретных изоформ могут влиять на краткосрочные синаптической пластичности и синаптических пузырьков динамики^{3, 4 , 5}. Таким образом, он имеет жизненно важное значение, чтобы иметь возможность определить наличие различных синаптических белков различных областях мозга.

Методы выбора для квантификации синаптических белков - пока -, масс-спектрометрия и западной blotting, вместо иммуногистохимия^6,,78,9. В некоторых случаях несколько методов используются для дополнения друг друга, чтобы оценить количество и локализации специфических белков (то есть, Вильгельм и др. ¹⁰). метод, мы опишем здесь позволяет для локализации и количественной оценки протеинов интереса без необходимости использования любого биохимического метода, просто используя immunofluorescent stainings. Еще одним преимуществом здесь является количественная оценка может быть сделано над районами гораздо меньше, и, таким образом, более конкретные, чем достичь другими методами. Однако надо принимать во внимание, что белок надежные ссылки необходимы для оценки распределения протеина интереса.

Флуоресцентный окрашивание по иммуногистохимия позволяет нам регулярно выявить Локализация белков различных областях мозга, а также в рамках различных нейрональных отсеков. Для идентификации различных отсеках, используются конкретные маркеры. Как правило антитела против синапсины и synaptophysin¹¹ может использоваться для обозначения синаптических пузырьков, в то время как антитела против Фагот ярлык активную зону пресинаптической терминал¹². Везикулярный транспортер, например глютамат Везикулярный транспортер (vGluT) или Везикулярный транспортер ГАМК (vGAT), используются для обозначения возбуждающим¹³ и тормозящий¹⁴ Пресинаптический терминалы, соответственно. На стороне постсинаптических антитела против белков Гомер может использоваться для Марк постсинаптических терминалы и антител против постсинаптических плотность белка 95 (PSD95)^15,,1617 или gephyrin^{18 , 19 , 20} может маркировать возбуждающим или тормозной постсинаптический терминалы, соответственно. С помощью антител против протеина интереса и маркеры например, описанным выше, можно определить локализацию таких белков. Многие исследования на сегодняшний день это сделали в качественным образом²¹. Однако достоверно определить дифференцированного распределения конкретных синаптических белков, нужно не только определить свое присутствие или отсутствие, но также его относительной концентрации. Неоднородности размеров и плотности синапсы делает его важным установить соотношение между синаптических маркер и протеина интереса. В противном случае СИНАПС богатые регионы, как-пирамидальной слои гиппокампа и молекулярный слой мозжечка покажет высокой плотности синаптических белков, только благодаря более высокой плотности синапсов но не сильное присутствие этого белка в каждый синапс (например, Wallrafen и Dresbach-¹). С другой стороны белки в нейрональных Сома (например, TGN38²²) обычно покажет сильное присутствие в гиппокампе пирамидальной клетке слоя или слоя клеток гиппокампа или мозжечковая гранул из-за высокой концентрации нейрональных клеток органов в этих областях. Таким образом эта неоднородность распределения структур, в этом случае синапсов, может привести к ложной оценки распределения протеина интереса сам. Кроме того существует внутренняя изменчивость в пятнать интенсивностей различных образцов в stainings иммуногистохимии. Протокол, описанные здесь принимает это во внимание и избегает такого предубеждения, а также другие предостережения, которые возникают от иммуногистохимических методов.

В наши последние исследования, мы использовали этот метод для описания дифференциального выражение движителя (также называемый TPRGL²³ или²⁴SVAP30) через 16 различных мозга области¹. Мувер является позвоночных конкретных синаптических белок, который можно найти в ассоциации для синаптических пузырьков и влияет нейромедиатора релиз^25,,2627. Мы связаны Mover выражение обилие синаптических пузырьков, путем пятнать для synaptophysin как маркер ссылки синаптических пузырьков. Мы нашли высокие уровни движителя особенно в межпредсердной перегородки ядер и брюшной pallidum, миндалины. В гиппокампе мы нашли гетерогенных распределение Mover, с высоким уровнем в слои, связанные с внутри гиппокампа вычисления и низкий уровень в слои ввода и вывода.

Этот протокол не предусматривает эксперименты на живых животных. Эксперименты с euthanizing животных для получения образцов мозга были утверждены властями местной защиты животных (Tierschutzkommission der этот Гёттинген) под номером официального утверждения T 10/30.

Примечание: Для этого протокола, были использованы 3 взрослых самцов мышей C57BL/6.

1. Пробоподготовка

1. Подготовьте фиксатором и 0,1 М фосфатного буфера (PB; см. таблицу 1).
2. Исправить животное, transcardial перфузии, как описано в Гейдж и др. ²⁸. сначала промыть крови с 0,9% раствор NaCl, затем perfuse с 30 мл параформальдегида 4% (PFA).
3. Откройте черепа с ножницами и тщательно изолировать с помощью ложки с тупыми краями, чтобы избежать повреждения ткани мозга.
4. Заполнить 50 мл трубки реакции с фиксатором и постфиксная мозга в 4% PFA при 4 ° C на ночь.
5. Снимите фиксатор и мыть мозга в 50 мл 0,1 М PB на шейкер для 30 мин.
6. После мытья, Инкубируйте мозга в 50 мл трубки реакции в 30% сахарозы в 0,1 М PB для 48 ч или до тех пор, пока он тонет в трубе при 4 ° C для криозащиты.
7. Trim cryoprotected мозга с острым лезвием, поместите его в cryomold и вставлять его с оптимального раскроя температуры (OCT) соединения. Избегайте пузырей. Ориент мозга и заморозить cryomold в морозилке-80 ° С.
8. Смонтируйте замороженные ткани для разрезания. Сбалансировать ткани до температуры cryomicrotome для по крайней мере 15 минут перед секционирование.
9. Раздел мозга в 25 мкм толщиной корональные срезы. Нажмите OCT тщательно с крюком стекла без касатьться ткани мозга. Сбор 3 прилегающих фрагментов в скважину в 24 хорошо пластины и хранить их в 0,1 М PB на 4 ° C до окрашивания.
   Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь до двух недель. Время хранения может вмешиваться с качеством ткани и таким образом повлиять на результат эксперимента.

2. иммунофлуоресценции

1. Подготовка решений включая блокирующий буфер, буфер антитела, мытье буфер 1 и Отмывающий буфер 2 (см. таблицу 1).
2. Промывайте ломтики с PB для удаления избыточных OCT.
   1. Удаление решения с пластиковая Пипетка без сосание в срезах головного мозга. 250 мкл свежие PB с 1000 мкл пипетки.
      Предупреждение: Фрагменты, не следует высохнуть, так что удалить и добавить жидкости от скважины.
3. Удаление PB с Пластиковые пипетки и 250 мкл блокировки буфера в колодец с 1000 мкл пипетки. Инкубируйте 3 ч при комнатной температуре (RT) на шейкер.
4. Во время инкубации разбавляют первичных антител в буфере антитела в пробирке реакция. Использовать буфер для 250 мкл антител на хорошо и добавить соответствующее количество антител (см. таблицу 2), закупорить непосредственно в раствор с помощью пипетки 2 мкл. Mix решение, мягко закупорить вверх и вниз несколько раз. Вихрь вскоре после этого, для обеспечения надлежащего перемешивания.
   Примечание: Для определения фона флуоресценции, stainings также должны выполняться без добавления основного антитела. Для этого Инкубируйте среза в раствор антител без первичного антитела согласно протоколу.
5. После инкубации время Удалите блокирующий буфер с Пластиковые пипетки и 250 мкл антител раствора, содержащего первичных антител в колодец. Инкубируйте ломтики с основное антитело на ночь при 4 ° C на шейкер.
6. Следующий день, вымойте ломтики отмывающим буфером 1 3 x 10 мин на RT на шейкер.
   1. Удаление среды с Пластиковые пипетки и 300 мкл отмывающего буфера 1 за хорошо. Инкубируйте на RT для 10 минут повторите 3 раза.
7. Во время стирки шаги развести Флюорофор сочетании вторичные антитела в буфере антитела в пробирке реакция. Использовать буфер для 250 мкл антител на хорошо и добавить соответствующее количество антител (см. таблицу 2), закупорить непосредственно в раствор с помощью пипетки 2 мкл. Mix решение, мягко закупорить вверх и вниз несколько раз. Вихрь вскоре после этого, для обеспечения надлежащего перемешивания.
   Предупреждение: Ведь светочувствительные, антитела все шаги от этой точки зрения должны быть выполнены в темноте.
8. После стирки шаги, удалить буфер с пластиковых дозаторов для стирки и 250 мкл раствор антител, содержащие вторичные антитела в колодец. Инкубируйте ломтики с вторичное антитело 90 мин на RT в темноте.
9. Вымойте ломтики отмывающим буфером 2 3 x 10 мин на RT.
10. Во время стирки шаги разбавляют 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) в 0,1 М PB в концентрации 1: 2000.
11. Отмывающий буфер 2 с пластиковая Пипетка Удалить и 250 мкл раствора DAPI на хорошо. Инкубируйте 5 мин на RT на шейкер.
12. Удаление решения DAPI с Пластиковые пипетки и 500 мкл 0,1 М PB в колодец с 1000 мкл пипетки.
13. Смонтируйте ломтики на скольжениях микроскопа.
    1. Место микроскопа под стереоскоп. С тонкой кистью добавьте три отдельные капли 0,1 М PB на слайд. Поместите один срез на каплю на слайд микроскопа.
    2. Используйте тонкой кистью для выравнивания и ориентировать ломтики на микроскопа.
    3. Когда все фрагменты расположены правильно, удалите избыток PB салфеткой и тщательно высушите слайд.
       Предостережение: Избегайте сушки срезы мозга полностью.
    4. 80 мкл встраивания среднего на слайд. Осторожно опустите coverslip на слайд, тем самым встраивание срезы мозга.
    5. Оставьте слайды для просушки в вытяжной шкаф для 1-2 ч (покрыть их, чтобы избежать воздействия света) и хранить их в коробке слайд микроскопа при 4 ° C.
       Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь.

3. томография

1. После внедрения среды полностью закаленные, место микроскопа под конфокального микроскопа.
   Примечание: В сочетании с программным обеспечением деконволюция микроскопия помощью эпифлуоресцентного должна принести аналогичные качества изображения.
2. Настройте параметры лазера путем увеличения или уменьшения интенсивности лазера для каждого канала, так что несколько пикселей переэкспонированных для обеспечения максимального распределения серого значений.
3. Приобрести виртуальные тканей весь мозг фрагмента для различных каналов.
   1. В программе обработки изображений (см. Таблицу материалы), выберите параметр плитки и вручную определить срез мозга с Установки плитки региона.
   2. Распространять опорных точек во всем регионе плитки и отрегулировать фокус на различных опорных точек, нажав Проверить плитка регионов/позиций...
   3. Настройки в Режиме приобретения желаемого резолюции и файла размер результирующего изображения и начать сканирование.
4. Когда проверка завершается, используйте функцию колющие для обработки виртуального ткани. Экспортируйте в формате .tif с функцией Экспорта изображения.

4. компьютер-анализ

1. Загрузить все отдельные каналы для одного изображения в Фиджи²⁹ , нажав файл | Открытые.
2. С помощью инструмента Freehand выделения разграничить одного полушария в DAPI-канале. Создание маски выделения, нажав Edit | Выбор | Создание маски.
3. Определить интенсивность средняя флуоресценции для одного канала (Mover и synaptophysin), нажав анализ | Мера.
   Примечание: Не забудьте выбрать различные каналы для определения значений интенсивности среднее флуоресценции для каждого канала.
4. Скопируйте интенсивность средняя флуоресценции для отдельные каналы в электронную таблицу.
5. Определите интенсивность средняя флуоресценции один каналов в области, представляющей интерес для разграничения области также инструментом Freehand выделение . Атлас мозга мыши используйте как Справка.
6. Повторите шаги 4.1-4.5 для всех полушариях и во всех областях, представляющих интерес.
   Примечание: Определить значения для каждого полушария отдельно для того, чтобы позже сравнить значения в области, представляющей интерес, в Западном полушарии (см. шаг 5.2).

5. Данные обработки

1. В случае, если фон флуоресценции высокой (см. обсуждение), вычитание фона могут быть необходимы. Для этого, определить интенсивность средняя флуоресценции для фрагмента, обрабатываются без первичного антитела против белков ссылка (здесь: synaptophysin) и вычесть это значение из всех значений, полученных для мозга и полушарий.
2. Когда были определены среднее флуоресценции интенсивности для отдельные каналы для каждого полушария и каждая область интересов (см. таблицу 3), рассчитать коэффициент движенца к synaptophysin путем деления значения для движенца значение для synaptophysin ( желтый цвет в таблице 3). Выполните это действие для каждого полушария и каждая область интересов отдельно.
3. Разделите коэффициент для одной области интереса соотношение, полученные для соответствующего полушария (оранжевый в таблице 3) для определения коэффициента области, представляющие интерес для нашего полушария.
4. Чтобы определить относительное изобилие Mover, перевод соотношение, полученные в 5.2 в процентах путем определения ее отклонение от 1 (красная в таблице 3). Поэтому коэффициент 1,25 даст относительное изобилие Mover 25% выше среднего, и отношение 0,75 даст относительное изобилие Mover 25% ниже среднего.

Представитель окрашивания моделей различных маркеров можно увидеть на рисунке 1. Шаблон варьируется в зависимости от распределения белка. Примеры из пяти уровней rostro хвостового приводятся в колонках (A)-(E). Представитель DAPI пятнать показано в первой строке: DAPI придерживается ДНК клетки и таким образом окрашенных ядер. Это приводит к пунктата шаблон. Регионы с высоким клетки плотностью ярче, чем в регионах с низкой сотовый плотности. Пример для гетерогенно распределенное белки можно увидеть во втором ряду. Движенец пятнать показывает дифференцированного распределения по всему мозгу, с яркими очагах и dimmer областях. В третьей строке показан пример для synaptophysin более равномерно распределенных ссылок маркера. Наложение двух белков (в четвертой строке) показывает дифференцированного распределения движителя (красный) по сравнению с synaptophysin белка маркера (зеленый).

Рисунок 2 показывает количественной оценки, описанные в шаге 4 протокола. Приведены значения интенсивности среднее флуоресценции для различных каналов через полушарий (Mover, Рисунок 2A; synaptophysin, Рисунок 2B) и во всех областях, представляющих интерес (Mover, Рисунок 2C; synaptophysin, Рисунок 2D). Чтобы определить изобилие Mover относительно числа синаптических пузырьков, соотношение берется Mover флуоресценции значений значениям synaptophysin флуоресценции. Эти показатели в областях, представляющих интерес показаны на рисунке 2Eи уже указывать гетерогенные распределения Mover, районы с высокой и низкой Mover уровнях относительно синаптических пузырьков. Дополнительно компенсировать присущие технических изменчивости, соотношение в одной области интереса (Рисунок 2E) по сравнению с показателем в полушарии (не показан) и переведен на определенный процент. Это относительное Mover изобилия (Рисунок 2F) дает меру сколько движителя присутствует в одной области родства интерес в среднем.

Как упоминалось выше, одним из основных преимуществ этой методики является возможность определить обилием протеина интереса через очень небольших площадях, даже субрегионов и слои областей, представляющих интерес. Одним из примеров этого приложения показан на рисунке 3, где относительное изобилие двигателем был определен для различных слоев в рубриках гиппокампа. Количественная оценка в разных слоях, показано на рисунке 3D, Рисунок 3Fи Рисунок 3H соответствует слои, показано на рис. 3C, Рисунок 3Eи Рисунок 3G, с соответствующими цветами. В гиппокампе гетерогенно распространяется Mover, с высоким уровнем двигателем относительно синаптических пузырьков в слои, связанные с внутри гиппокампа вычисления (например, превращение слоя зубчатой извилине [ГД], слой radiatum, Lucidum oriens Cornu Ammonis 3 [CA3] и слой radiatum и oriens Cornu Ammonis 1 [СА1]) и низкого уровня в слои ввода и вывода (внутренние и внешние молекулярный слой ГД, пирамидальной клетке слои CA3 и СА1 и в слое stratum lacunosum-moleculare о СА1).

Рисунок 1 : Представитель иммунофлюоресценции изображения DAPI (первая линия), тягач (вторая строка), synaptophysin (третья строка) и их наложение (четвертой строке, двигателем в красный, synaptophysin зеленым цветом) на уровне 5 rostro хвостового (A-E). Области интереса, закрашены серым в верхнем ряду панелей. M1, первичной моторной коры; МОК, острова Calleja; АКК, передней поясной коры; СНС, межжелудочковой перегородки ядер; VPa, вентральной pallidum; НУА, прилежащем ядре; CP, хвостатого Путамен; S1, первичной соматосенсорной коры; HC, гиппокампа; Ам, миндалина; Мга, медиальной habenula; Паг, periaqueductal серый; SN, substantia nigra; VTA, вентральной вентральная область; ДОК, молекулярный слой мозжечка; КЗС, зернистый слой мозжечка. Шкалы бар = 500 мкм. Этот рисунок был изменен с Wallrafen и Dresbach1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2 : Количественная оценка Mover распределения по 5 уровней rostro хвостового. Означают интенсивности флуоресценции двигателем (A) и synaptophysin сигнал (B) на различных уровнях. Означают интенсивности флуоресценции двигателем (C) и synaptophysin сигнал (D) в 16 регионах вручную разграничены мозга. (E) коэффициенты Mover и synaptophysin в 16 мозга областях, представляющих интерес. (F) количественная оценка относительного изобилия Mover, сравнивая Mover/synaptophysin соотношение в соответствующем регионе отношение соответствующего полушария. M1, первичной моторной коры; МОК, острова Calleja; АКК, передней поясной коры; СНС, межжелудочковой перегородки ядер; VPa, вентральной pallidum; НУА, прилежащем ядре; CP, хвостатого Путамен; S1, первичной соматосенсорной коры; HC, гиппокампа; Ам, миндалина; Мга, медиальной habenula; Паг, periaqueductal серый; SN, substantia nigra; VTA, вентральной вентральная область; ДОК, молекулярный слой мозжечка. Черные точки представляют собой точки данных. Бары показывают среднее ± Среднеквадратичная ошибка среднего значения (SEM). Этот рисунок был изменен с Wallrafen и Dresbach1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3 : Движенец распределение в гиппокампе мыши. Иммунофлюоресценции stainings корональные срезы мыши гиппокампа. Обзор гиппокампа, показаны гетерогенных Mover выражения (A) и соответствующие Synaptophysin окрашивание (B). Тремя регионами интереса (ГД, рис. 3C; CA3, Рисунок 3E; СА1, Рисунок 3G) определены с белыми пунктирными линиями. (D,F,H) Количественная оценка, сравнивая отношение в соответствующих слоях отношение соответствующего полушария. Цвета гистограммы соответствуют соответствующих затенение в панели, C, Eи G. Движенец выражение высоких уровней, связанных с интра гиппокампа вычисления (т.е., «превращение» слой ГД, radiatum пласта, lucidum и oriens CA3, и слой radiatum и oriens СА1) и температура в основные ввода и вывода слоев ( внутренний и внешний молекулярный слой ГД, пирамидальной клетке слои CA3 и СА1 и слое stratum lacunosum-moleculare о СА1). OML, наружный молекулярный слой; IML, внутренний молекулярный слой; Ост, зернистый слой; ПМЛ, превращение слоя/хилус; ТАК, пласт oriens; Шпион, pyramidale слой; SLu, stratum lucidum; SR, radiatum слой; ОДС, в слое stratum lacunosum-moleculare. Шкалы бар = 500 мкм. черные точки представляют данных точек. Столбцы показывают среднее ± SEM. Этот рисунок был изменен с Wallrafen и Dresbach1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Таблица 1: Решения, используемые в настоящем Протоколе.

Таблица 2: Антитела, используемые в настоящем Протоколе.

Таблица 3: Пример обработки данных.

Авторы не имеют ничего сообщать.