Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

В Vitro анализов для оценки миграции, вторжения и распространения увековечен человека первого триместра трофобласта клеточных линий

10K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58942

⸱

5 марта 2019 г.

 ,  ,  , 
1Department of Obstetrics, Gynecology and Reproductive Sciences, Yale School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем весьма доступный протокол для оценки клеточного движения в клетках человека трофобласта, используя три в пробирке анализов: скретч assay, transwell вторжения пробирного и распространения assay клетки.

Аннотация

Движение клеток является критическое свойство трофобласты во время развития плаценты и ранней беременности. Беременности расстройств, таких как ограничение преэклампсии и внутриутробного роста, которые связаны с неадекватной трофобласта вторжения материнской сосудистую свидетельствует значение надлежащего трофобласта миграции и вторжения. К сожалению, наше понимание механизмов по которой плацента развивается от миграции трофобласты ограничен. В пробирке анализ миграции клеток через скретч assay является полезным инструментом в выявлении факторов, которые регулируют трофобласта мигрирующих потенциала. Однако этот assay только не определяет клеточные изменения, которые могут привести к миграции измененных клеток. Этот протокол описывает три различных в пробирке анализов, которые используются коллективно оценить движение клеток трофобласта: скретч assay, пробирного вторжения и распространения assay. Протоколы, описанные здесь, также могут быть изменены для использования в других клеточных линий для количественного определения клеточного движения в ответ на раздражители. Эти методы позволяют следователям для выявления отдельных факторов, которые способствуют движению клеток и обеспечить тщательное изучение возможных механизмов, лежащих в основе явного изменения в ячейке миграции.

Введение

Плацентарный развития представляет собой решающий шаг в создании беременности, влияющие на здоровье матери и плода. Однако механистический основы, в которой происходит этот процесс полностью не поняты. Клетки миграция является важным биологическим процессом, который способствует создание и функции через плаценту во время беременности. После имплантации бластоцисты трофоэктодерму дифференцирует ворсинчатых трофобласты, которые покрывают поверхность хорионического ворсинки и участвуют в газ и обмен питательных веществ, и extravillous трофобласты (EVTs), которые мигрируют из от Вилли и вторгнуться материнской decidua и сосудистую1. Миграция EVTs имеет важное значение для реконструкции материнской спиральных артерий и создания uteroplacental циркуляции для поддержки роста плода2. Неадекватные трофобласта вторжения во время беременности приводит к плацентарных аномалии развития и может способствовать осложнений беременности, таких как преэклампсия, гестационного гипертензии, ограничение внутриутробного роста и преждевременных родов3, 4. Таким образом понимание факторов, которые влияют на трофобласта моторики имеет важное значение для определения путей, необходимых для нормального плацентации.

Трофобласта миграции контролируется сложной сети сигнальных молекул, включая факторы роста, цитокины, гормоны и ангиогенных факторов5. Из-за ограничений исследования плаценты в естественных условиях в пробирке анализов используя увековечен человека трофобласта клеток линии имели решающее значение для выявления факторов, способствующих подвижности трофобласта. Царапин и вторжения анализы широко использовались для количественной оценки роли отдельных молекул на трофобласта клеток миграции6,,78. Однако хотя и является полезным в тандеме, чтобы исследовать, как изменения в миграции может быть вызвано изменениями в ячейке инвазивность, эти два анализов не учитывают дополнительные механизмы, которые могут способствовать изменены показатели миграции клеток. Например сокращение скорости пролиферации клеток может привести к меньшее количество ячеек для миграции.

Здесь мы описываем количественные методы в пробирке для оценки миграции трофобласта, используя нуля, пролиферация клеток и клеток вторжения анализов. В скретч assay создан единый рану в монослое клеток, и миграции клеток, чтобы заполнить разрыв измеряется автоматизированных, покадровой изображений размер раны и плотность клеток в рану. Распространения assay клетки основывается на расчете соотношение клеток в каждый момент времени по сравнению с известным начальное количество клеток. В assay вторжения клетки клетки посеян на вершине камеру Вставка культуры внеклеточная матрица покрытием клеток (например, Transwell), и подсчитывается количество ячеек, которые вторгаются через внеклеточного матрикса в ответ на химио приманки.

Царапинам assay — простой и эффективный инструмент, который может использоваться для определения различных условий окружающей среды влияют на миграцию клеток. Распространение и вторжения анализов впоследствии может использоваться для определения вклада инвазивность общего изменения в ячейке миграции и пролиферации клеток. В совокупности эти анализы обеспечивают надежные измерения биологических процессов, которые могут способствовать подвижности клеток. Две линии клеток трофобласта увековечен первого триместра были использованы в описанных анализов, Swan.71 (Sw.71) и HTR-8/SVneo9,10. Однако эти анализы также могут быть оптимизированы для использования в других типах клеток для выявления ключевых модуляторы миграции клеток и вторжения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка клетки

  1. Поддержания клеток в колбах T-75 в средствах массовой информации стандартного роста при 37 ° C, 5% CO2и 95% влажности.
    Примечание: Клетки, используемые в этих экспериментов были увековечен Swan.71 (Sw.71) и HTR-8/SVneo9,10линий клеток трофобласта первого триместра. Sw.71 клетки были сохранены в среде DMEM/F-12 с 10% тепло инактивированная плода бычьим сывороточным (ФБС), пируват натрия 1,0 мм, 10 мм HEPES, 0.10 мм MEM несущественные аминокислот, 100 единиц/мл пенициллин и 100 мкг/мл стрептомицина. HTR-8/SVneo клетки были сохранены в RPMI 1640 с 5% тепло инактивированная FBS.
  2. Позволяют клеткам репликацию до тех пор, пока они достигают 90-100% слияния. С помощью стерильных культуры ткани капот потока, аспирационная СМИ из фляги и мыть ячейки с 10 мл стерильной 1 x фосфат амортизированное saline (PBS).
  3. Аспирационная PBS и добавьте 5 мл 1 x (0,05%) трипсин ЭДТА в колбу, убедившись, что клетки покрыты трипсина. Место колбу в инкубаторе лаборатории, поддерживается при 37 ° C, 5% CO2и 95% влажности, до тех пор, пока все ячейки отделены от нижней части колбы (приблизительно 5-10 мин).
  4. Добавьте 10 мл подогретым питательных сред в колбу для деактивации трипсина ЭДТА.

2. поцарапать Assay

  1. Следующий шаг 1.4, семя соответствующее количество клеток в 24-ну пластины для достижения 100% слияния в 48 ч.
    Примечание: Это можно выполнить с нуля пробу с целым рядом различных пластины макетов. Максимальное количество скважин разрешено инструментом рану чайник это 96-луночных формат.
  2. На следующий день (день до нуля пробирного), измените СМИ фенол красный свободные СМИ, дополнено в случае необходимости, включая тепло инактивированная, уголь декстран раздели FBS.
    Примечание: Другие исследования рекомендовали использование средств с низкой концентрацией FBS (например, 1%) чтобы свести к минимуму пролиферации клеток, которые могут использоваться в качестве альтернативы в этом протокол11.
  3. В день нуля assay предварительной обработки клеток для 30 мин путем добавления желаемого обращения к средствам массовой информации в каждой скважине. Изложил экспериментов использовались транспортного средства (ПБС) и 100 Нм дексаметазон, разводят в 1 x PBS.
  4. Для создания единообразных раны, место стерильные 10 мкл наконечники на контактах средства чайник рану. Ниже советы в первую строку скважин и двигаться пластину вдоль трека рану чайник до тех пор, пока наконечники достичь другой стороне хорошо.
    1. Переместите пластины обратно в исходное положение, позволяя наконечники непрерывно прикоснуться к нижней части пластины для обеспечения постоянной рану через Диаметр скважины. Снять и заменить стерильные 10 мкл наконечники и опустите советы в следующей строке скважин.
  5. Повторите шаг 2.4 до тех пор, пока все скважины поцарапаны.
    Примечание: Если не доступен инструмент чайник рану, раны могут создаваться вручную соскабливания центр скважин с кончиком пипетки 10 мкл.
  6. Тщательно аспирационная СМИ и осторожно промыть клетки дважды с ПБС. После окончательного мыть добавьте дополнениями фенол красный бесплатно, раздели или низкий FBS СМИ с желаемой лечения или транспортного средства (как указано на шаге 2.3).
    Примечание: HTR-8/SVneo клетки должны быть вымыты с дополнениями фенол красный СМИ, как мытье с ПБС вызовет клетки для отсоединения.
  7. Место пластину 24-а, содержащий почесал скважин в тепловизор автоматических, промежуток времени (см. Таблицу материалы) размещается в лаборатории инкубатора, поддерживается при 37 ° C, 5% CO2и 95% влажности. Изображение скважин на регулярной основе при необходимости разрешить клетки для завершения заживление ран (например, каждые 2 ч за 72 ч).
  8. Рассчитать рану плотности и ширины, программного обеспечения, связанные с тепловизор автоматических, промежуток времени (см. Таблицу материалы). Чтобы вычислить процентное изменение в рану размер относительно размера отправной рану, задайте ширину рану в момент времени 0 равен 100%. Разделите размер раны в каждом последующем timepoint рана размером в момент времени 0 и умножить на 100, чтобы получить процент (рис. 1).

3. вторжение Assay

  1. Следующий шаг 1.4, семя соответствующее количество клеток в 6-ну пластины, чтобы позволить клеток достичь 90% слияния в 48 ч. сохранить клетки в лаборатории инкубатора 37 ° C, 5% CO2и 95% влажности.
  2. Следующий день, измените СМИ фенол красный свободные СМИ, дополнено в случае необходимости, включая тепло инактивированная, уголь декстран раздели FBS.
    Примечание: Клетки можно предварительно обработанных в это время в зависимости от экспериментальный дизайн.
  3. В это время, место флакон 10 мг/мл внеклеточного матрикса (см. Таблицу материалы) на льду и пусть он оттаивания в холодильнике всю ночь.
  4. Следующий день, предварительно прохладно вторжения пробирного поставляет, поместив 24-ну пластины, культуры клеток вставки, microcentrifuge трубы и наконечники в холодильнике (4 ° C) для по крайней мере за 2 ч до работы с внеклеточного матрикса.
  5. Использование охлажденной поставок в культуре ткани капот, разбавленной 10 мг/мл внеклеточная матрица 1:1 с фенол красный бесплатно, сыворотка СМИ до конечной концентрации 5 мг/мл.
    Примечание: Всегда держите фондовых и разбавленных внеклеточная матрица на льду. Отношение внеклеточная матрица для средств массовой информации может быть скорректирована на основании свойств клеточной линии, используемые в assay.
  6. С помощью охлажденные поставок в культуре ткани капот, добавьте 100 мкл разбавленного внеклеточной матрицы для вставки (см. Таблицу материалы), которые были помещены в пластину 24-Ну. Убедитесь, что матрица является уровень без каких-либо пузыри. Место пластину 24-Ну, содержащих матрицы покрытием вставок в инкубаторе при 37 ° C разрешить матрицы, чтобы затвердеть.
  7. Подготовка клетки для вторжения assay, вымыть клетки с 1 мл раствора 1 x PBS, аспирационная PBS и 500 мкл 1 x трипсина ЭДТА в каждой скважине. Место пластину 6-Ну в инкубаторе лаборатории, поддерживается при 37 ° C, 5% CO2и 95% влажности, до тех пор, пока все клетки отделен от нижней части пластины.
  8. После того, как клетки отдельный, добавьте 500 мкл фенол красный бесплатно, сыворотка СМИ в каждой скважине trypsinized клеток.
  9. Передать 1000 мкл отдельные клетки пробки microcentrifuge и спином вниз на 5 мин на 400 x g при 4 ° C.
  10. Аспирационная СМИ и Ресуспензируйте клетки в фенол красный бесплатно, сыворотка СМИ (объем зависит от концентрации клеток). Подсчет ячеек с помощью автоматизированных клеток противостоять (см. Таблицу материалы) и отрегулировать громкость суспензию клеток для конечной концентрации 5 x 105 клеток / мл.
    Примечание: Горяева и микроскоп может также использоваться для подсчета клеток.
  11. Добавьте 600 мкл полный рост средств массовой информации к скважинам 24-ну пластина, которая будет использоваться для assay вторжения.
    Примечание: В полный рост среднего в скважине (Нижняя палата) могут быть добавлены дополнительные chemoattractants или лечения. Изложил эксперименты добавил транспортное средство (ПБС) или 100 Нм дексаметазон, разводят в 1 x PBS в нижнюю палату.
  12. Место, предварительно покрытых вставьте в каждую лунку, содержащий полный рост среднего, который будет использоваться для assay вторжения. Затем добавьте 200 мкл клеток на вершине каждой предварительно покрытых ячейка вставки (верхняя палата) в общей сложности 1 х 105 клеток.
    Примечание: Как отрицательный контроль за этот assay равным объемом фенол красный-, сыворотка бесплатно видео (без клетки) могут быть добавлены в верхней палате.
  13. Место 24-ну пластины в инкубаторе лаборатории, поддерживается на 37 ° C, 5% CO2и 95% влажности за 24 ч.
    Примечание: Инкубационный период 24 h был оптимизирован для клеток трофобласта увековечен первого триместра, и могут потребоваться дополнительные тесты для определения требуемых инкубационный период в других клеточных линий.
  14. После ночи инкубации всасывания оставшихся средств массовой информации от верхней и нижней палаты не нарушая внеклеточного матрикса. Затем тщательно удалите внеклеточного матрикса и не вторглись клетки из верхней части вставки с помощью ватного тампона, свабирование скважин как столько раз, сколько необходимо для удаления внеклеточного матрикса.
  15. Мыть каждый вставить 3 x с ПБС, добавление PBS в верхней и нижней палат скважины. Аспирационная PBS после каждой стирки.
  16. Исправить клеток, придает вставок, помещая вставок в ледяной метанола 100% за 30 мин при 4 ° C. Мыть вставляет 3 x 1 x PBS и удалить PBS после окончательного мыть. Пятно клеток, придает вставок на 10 мин с 0,2% Фиолетовый Кристалл в 20% этанола.
  17. Промойте 3 x деионизированной водой и аспирационная деионизированной воды после окончательной стирки.
  18. Просушите вставки для 1 ч при комнатной температуре. С помощью щипцов и лезвие бритвы, тщательно вырезать дно мембраны вставки и смонтировать на слайде стекла с нижней стороной вверх. Позволяют монтаж СМИ высохнуть при комнатной температуре.
  19. Получите по крайней мере 4 уникальных изображений вторглись клеток на сэмпл с использованием световой микроскоп с целью 20 x. Подсчитать общее число клеток в каждом изображении и нормализует количество клеток для контроля образцов и печать данных (Рисунок 2).

4. распространение Assay

  1. Следующий шаг 1.4, граф trypsinized клеток из колбы, используя счетчик автоматизированных клеток и семян в 6-ну пластины на плотности тарелок5 2 x 10 ячеек на колодец в стандартных роста средств массовой информации.
  2. Место клетки в лаборатории инкубатора, поддерживается на 37 ° C, 5% CO2и 95% влажности за 4 ч или до тех пор, пока клетки присоединились.
  3. Изменения СМИ фенол-красный свободные СМИ, дополнено в случае необходимости, включая тепло инактивированная, уголь декстран раздели FBS и добавьте нужное лечение. Изложил эксперименты добавил транспортное средство (ПБС) или 100 Нм дексаметазон, разводят в 1 x PBS. Поместите пластины для 6-Ну в лаборатории инкубатора, поддерживается при 37 ° C, 5% CO2и 95% влажности.
  4. Извлеките носитель и заменить на новые средства массовой информации и лечение каждые 48 ч.
  5. После 24, 48 или 72 ч лечения вымыть клетки с 1 мл раствора 1 x PBS и 500 мкл трипсина ЭДТА в каждой скважине. Место 6-ну пластины в инкубаторе, пока клетки отделены от плиты.
  6. После того, как клетки отдельный от плиты, 500 мкл дополнениями фенол красный свободных средств массовой информации для деактивации трипсина.
  7. 5 мкл trypsinized клеток до 5 мкл Трипановый синий в отдельные трубки и смешивать, закупорить.
  8. Подсчитать ячейки от каждой скважины в двух экземплярах, с использованием автоматизированных ячейки счетчика.
  9. Среднее количество ячеек на скважине на каждом этапе и сюжет как функцию времени (рис. 3).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Увековечен человека первого триместра трофобласта клеточных линий Sw.71 и HTR-8/SVneo были использованы в этих экспериментов для определения роли глюкокортикоидов в миграции клеток трофобласта12. Глюкокортикоидов были использованы в этих экспериментах, как они недавно было показано, изменить функции трофобласта, хотя альтернативные методы лечения могут быть используется12. Обе линии клетки обрабатывали транспортное средство (ПБС) или 100 Нм ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Эта процедура основывается на использовании миграции и вторжения анализов включить скорость пролиферации клеток как потенциальный вклад измеренных различия в движение клеток трофобласта. Вместе, эти в пробирке тестов используются простые и эффективные методы, которые могут использоваться для идентификации сотовой пути, которые регулируют миграцию трофобласта. Как описано выше, клетки трофобласта может рассматриваться с гормонов, цитокины, факторы роста или других молекул, чтобы определить их воздействие на движение трофо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Авторы благодарят д-р Хиль Mor за предоставление Sw.71 клеток. Это исследование было поддержано Маккерн Альберт ученый награда с.в.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,4% Трипановый синий красительThermo Fisher Scientific15250-061
0,5% Трипсин-ЭДТАLife Technologies15400-054
1,0 М HEPESAmericanBioAB06021-00100
10 мМ MEM заменимые аминокислотыLife Technologies11140-050
100 мМ пируват натрияLife Technologies11360-070
24-луночные пластинчатые трансвеллерные вставкиCorning3422Содержат поликарбонатные фильтры с 8 мкм; m размер пор
Древесный уголь декстран-полосатый FBSGemini Bio-Products100-119
Countess II Автоматизированный счетчик клетокThermo Fisher ScientificAMQAX1000
кристалл фиолетовыйSigma AldrichC0775
Cytoseal 60Thermo Fisher Scientific8310-4
Дексаметазон (Декс; 1, 4-прегнадиен-9&альфа;-фтор-16&альфа;-метил-11&бета;, 17, 21-триол-3, 20-дион; ≥ 98% TLC)СтероидыP0500-000
DMEM/ветчина s F12Life Technologies11330-032
Фетальная бычья сывороткаSigma AldrichF2442
IncuCyte 24-луночные пластины ImageLock PlatesEssen BioScience4365При использовании системы визуализации IncuCyte Zoom засейте клетки на пластины IncuCyte ImageLock. Эти пластины имеют реперные знаки в нижней части пластины, которые используются в качестве эталона для повторной визуализации в постоянном поле зрения.
Программное обеспечение IncuCyteEssen BioScience2010A Rev2
IncuCyte ZOOM системаEssen BioScienceN/AScratch были сняты и проанализированы с использованием предустановленных « Царапина на ране» на системе IncuCyte ZOOM. Также можно использовать другие покадровые микроскопы.
Матригель Мембранный МатриксБектон Дикинсон356231Фактор роста сниженный, фенол-красный свободный
МикрослайдыVWR International, LLC48311-7003
Микроскоп Защитное стекло FisherScientific12-545-E
Olympus IX71 инвертированный микроскопOlympusIX71
Пенициллин (10 000 единиц/мл)/стрептомицин (10 000 &; g/mL)Life Technologies151-40-122
Фенол-красный DMEM/Ham's F12Life Technologies11039-021
Полуавтоматический инструмент для создания ранEssen BioScienceN/A

Ссылки

  1. Ji, L., et al. Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Molecular Aspects of Medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).
  2. Caniggia, I., Winter, J., Lye, S., Post, M. Oxygen and placental development during the first trimester: implications for the pathophysiology of pre-eclampsia. Placenta. 21, S25-S30 (2000).
  3. Norwitz, E. R. Defective implantation and placentation: laying the blueprint for pregnancy complications. Reproductive Biomedicine Online. 13 (4), 591-599 (2006).
  4. Ness, R. B., Sibai, B. M. Shared and disparate components of the pathophysiologies of fetal growth restriction and preeclampsia. American Journal of Obstetrics & Gynecology. 195 (1), 40-49 (2006).
  5. Knöfler, M. Critical growth factors and signalling pathways controlling human trophoblast invasion. The International Journal of Developmental Biology. 54 (2-3), 269-280 (2010).
  6. Huber, A. V., Saleh, L., Bauer, S., Husslein, P., Knöfler, M. TNFα-Mediated Induction of PAI-1 Restricts Invasion of HTR-8/SVneo Trophoblast Cells. Placenta. 27 (2), 127-136 (2006).
  7. Nadeem, L., et al. Nodal Signals through Activin Receptor-Like Kinase 7 to Inhibit Trophoblast Migration and Invasion. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1177-1189 (2011).
  8. Onogi, A., et al. Hypoxia inhibits invasion of extravillous trophoblast cells through reduction of matrix metalloproteinase (MMP)-2 activation in the early first trimester of human pregnancy. Placenta. 32 (9), 665-670 (2011).
  9. Straszewski-Chavez, S. L., et al. The isolation and characterization of a novel telomerase immortalized first trimester trophoblast cell line, Swan 71. Placenta. 30 (11), 939-948 (2009).
  10. Graham, C. H., et al. Establishment and characterization of first trimester human trophoblast cells with extended lifespan. Experimental Cell Research. 206 (2), 204-211 (1993).
  11. Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
  12. Kisanga, E. P., Tang, Z., Guller, S., Whirledge, S. Glucocorticoid signaling regulates cell invasion and migration in the human first-trimester trophoblast cell line Sw. 71. American Journal of Reproductive Immunology. , e12974(2018).
  13. Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (8), 2496-2500 (1986).
  14. Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. Measurement of cell death in mammalian cells. Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 12, Unit 12 18 (2004).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

scratch
В Vitro анализов для оценки миграции, вторжения и распространения увековечен человека первого триместра трофобласта клеточных линий
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.