Методическая статья

Модель инъекций щекдля одновременные измерения боли и поведения, связанных с зудом

12.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58943

⸱

27 сентября 2019 г.

 ,  , 
1Thermal Biology Group, Exploratory Research Center on Life and Living Systems (ExCELLS), 2Division of Cell Signaling, National Institute for Physiological Sciences, 3Department of Physiological Sciences, Graduate University for Advanced Studies (SOKENDAI), 4Research Laboratory, Ikedamohando Co., Ltd., 5Department of Molecular Biomedical Sciences, College of Veterinary Medicine, North Carolina State University, 6Institute for Environmental and Gender-Specific Medicine, Juntendo University

В этой статье

Краткое содержание

Как правило, модель инъекции шеи мыши используется для оценки поведения нуля, вызванного pruritogen. Однако модель предоставляет информацию только о зуд, а не боль. Здесь, модель инъекции щеки введена в мышах, которые могут быть использованы для одновременного измерения боли и зуда, связанных с поведением.

Аннотация

Зуд был определен как "неприятное кожное ощущение, которое провоцирует желание поцарапать" Ротман в 1941 году. В моделях мыши, царапины приступы, как правило, учитываются для оценки зуд индуцированных pruritogens. Тем не менее, предыдущие доклады показали, что алгетические вещества также вызывают царапин поведения в модели инъекции шеи мыши, которая является наиболее распространенным тестом, используемым для царапин поведения. Этот вывод затрудняет изучение зуда у мышей.  В отличие от капсаицина, общего алгогена, снижение царапин поведения в некоторых экспериментов инъекции шеи. Таким образом, влияние боли на царапины поведения остается неясным. Таким образом, необходимо разработать метод для одновременного расследования зуд и ощущение боли с помощью поведенческих тестов. Здесь вводится модель инъекций щек, которая может быть использована для одновременного измерения поведения, связанного с болью и зудом. В этой модели, pruritogens вызывают царапин поведения в то время как алгетические вещества вызывают вытирая поведения. Используя эту модель, лисофосфатидная кислота (LPA), зуд посредника, найденного в холестатических пациентов с зудом, показано, что исключительно вызывают зуд, но не боль. Однако, в моделях мыши, LPA было сообщено, что будет и pruritogen и algogen. Исследование влияния LPA в модели инъекций щеки мыши показало, что LPA только индуцированные царапины, но не вытирая поведения. Это указывает на то, что LPA действует как pruritogen аналогично у мышей и людей, и демонстрирует полезность модели инъекции щеки для исследования зуда.

Введение

Зуд был первоначально характеризуется как ощущение, которое вызывает царапин поведения для удаления вредных материалов с поверхности кожи. Тем не менее, зуд был в центре внимания терапии для неприятных ощущений, вызванных многими заболеваниями, такими как атопический дерматит, нейрогенные поражения, и холестаз1. В этих случаях зуд является серьезным неприятным ощущением, похожим на боль. Таким образом, зуд представляет собой важную цель исследования. Царапины поведение является основным показателем зуд в экспериментах на животных, и царапин поведение может быть вызвано у мышей путем введения pruritogens в кожу на шее2,3. Тем не менее, предыдущее исследование показало, что капсаицин, алгоген, также вызывает царапин поведения в модели инъекции шеи4, что затрудняет дискриминацию зуд от боли в этой модели.  В отличие от этого, было установлено, что капсаицин снижение царапин поведения в модели инъекции шеи, что свидетельствует о том, что влияние боли на царапин поведения является сложным и зависит от экспериментальных условий.  Таким образом, одновременные измерения боли и зуд связанных поведения позволит точный анализ pruritogens и алгогенов. Стивен Г. Симада и Роберт Х. LaMotte удалось в одновременных измерений боли и зуд связанных поведения путем изменения места инъекции от шеи до щеки4. В модели инъекции щеки, капсаицин индуцированных вытирая, но не царапин поведения, в то время как гистамин, pruritogen, только индуцированных царапин поведения. Таким образом, эта модель позволяет независимую оценку зуда и боли, что делает инъекцию щек полезной моделью для исследования зуда. При попытке определить, является ли испытательное вещество pruritogen и/или алгогеном, эта модель предоставляет больше информации, чем модель инъекции шеи. В этой статье описывается практический метод для выполнения инъекций щек и подсчета приступов царапин или вытирания, и показывает полезность этого метода для оценки царапин поведения, вызванного лисофосфатидной кислоты (LPA).

Протокол

Все процедуры, связанные с уходом и использованием животных, были одобрены институциональным Комитетом по уходу за животными и использованию Национального института естественных наук (16A074) и проведены в соответствии с руководящими принципами Национального института Физиологические науки.

ПРИМЕЧАНИЕ: Первоначальный протокол был сообщен Стивенг Г. Симада и Роберт Х. LaMotte4, и в настоящем докладе описывается эти методы с несколькими изменениями, в том числе добавление экрана, чтобы предотвратить животных видеть друг друга, отсутствие зеркало, количество мышей на запись, напряжение мыши, размер клетки и время записи.

1. Модель инъекций щеки

  1. Подготовка эксперимента
    1. Клетке
      1. Установите четыре клетки под камерой, как показано на рисунке 1. Установите экран, чтобы мышей не видели друг друга. Положите в каждой мыши в каждой клетке и установить акриловую крышку, чтобы предотвратить побег мышей. Обратите внимание, что записи должны выполняться в среде, в которой контролируется температура, влажность и звук.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Поведение также может быть записано без крышки, если клетка достаточно высока.
    2. Игла и шприц
      1. Используйте 29 G или 30 G иглу, прикрепленную к шприцу 0,5 мл для инъекции испытательных веществ. Если раствор испытательного вещества очень вязкий, требуется более крупные иглы. Однако, обратите внимание, что большие иглы создают дополнительные физические побочные эффекты.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать иглу, соединенную со шприцем с полиэтиленовой трубкой.
    3. Видеокамера
      1. Используйте видеокамеру, имеющая достаточно большие частоты кадров (30-60 кадров/с) с относительно высоким разрешением для измерения царапинных приступов и вытирания поведения.
    4. Программное обеспечение для видеоанализа
      1. Используйте программное обеспечение для редактирования видео для воспроизведения и анализа видео. Обратите внимание, что для точного анализа необходимы режим перемочения и режим воспроизведения кадров по кадру.

figure-protocol-1
Рисунок 1: Видеокамера и установка клетки. Четыре акриловые клетки с акриловыми крышками, для предотвращения побега мышей, и экран для предотвращения заразного зуда используются. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

  1. Инъекция и запись
    1. За день до начала эксперимента побрить мех на щеке мыши с помощью ножниц для волос(фильм 1). Перед бритьем не сдерживайте мышей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: CD-1 или C57BL/6 мышей в основном использовались в этой модели4,5. В этой статье, мужчины 6-12 недельный C57BL/6N мышей были использованы. Обратите внимание, что чувствительность к химическим веществам может быть различными между различными штаммами мыши3,6,7.
    2. Через день после бритья, переместить мышь в клетку записи в течение 1 ч, чтобы акклиматизировать его к условиям записи. Если используется местное приложение, примените его в этот период акклиматизации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом отчете, 10 кЛ 2% (w/v) димедрол гидрохлорид соли в солевой местно й 30 минут до записи.
    3. Установите видеокамеру над клеткой и начните видеозапись перед инъекцией тестового вещества. Введите раствор 10 л испытательного вещества в бритую щеку в условиях бодрствования(Фильм 2). После инъекции верните мышь в клетку записи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом отчете в качестве испытательных веществ использовалось 50 мкг/10 г г/10 г г гг/10 капсаицин или транспортное средство (7% tween 80 в сольнике).
    4. Закройте крышку клетки и продолжайте видеозапись в течение 30 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Общее время записи будет зависеть от экспериментальных условий.
  2. Поведенческий анализ
    1. Подсчитайте царапины поединки и вытирая поведения, соответственно. Мыши поднимают заднюю ногу к щеке и царапают несколько раз в течение одной или нескольких секунд, а затем опустить ногу. Эта серия действий засчитывается как один бой нуля. Царапины в других областях не следует считать. Мыши используют один передний конечности для вытирания и обе стороны для ухода. Эти действия следует различать. Только поведение, связанное с вытирая, засчитывается как поведение, связанное с болью.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждое действие показано на рисунке 2, фильм 3, фильм 4, и фильм 5.

figure-protocol-2
Рисунок 2: Типичная активность мыши во время записи. Панели A-C являются иллюстрациями, представляющими вытирая поведение с правом переднюю ногу (A), царапин поведение с правой задней ноги (B) и уход поведение с обеих передних конечностей (C). Мыши поднимают заднюю ногу к щеке и царапают несколько раз в течение одной или нескольких секунд, а затем опустить ногу. Эта серия действий засчитывается как один бой нуля. Царапины в других областях не следует считать. Мыши используют один передний конечности для вытирания и обе стороны для ухода. Эти действия следует различать. Только поведение, связанное с вытирая, засчитывается как поведение, связанное с болью. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

2. Модель инъекций шеи

  1. Инъекция и запись
    1. За день до начала эксперимента побрить мех на затылке мыши с помощью ножниц для волос после приблизительно 5% изофлуранового вдыхания в течение 2-3 мин.
    2. Через день после бритья, переместить мышь в клетку записи в течение 1 ч, чтобы акклиматизировать его к условиям записи.
    3. Установите видеокамеру над клеткой(рисунок 1), и начать видеозапись до инъекции тестового вещества. Введите раствор 10 л испытательного вещества в бритую шею в бодрствующих условиях. После инъекции верните мышь в клетку записи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этой статье в качестве испытательных веществ использовалось 50 мкг/10 г г/10 г г/10 л или 40 мкг/10 капсаицинов или транспортное средство (7% tween 80 в солине).
    4. Закройте крышку клетки и продолжайте видеозапись в течение 30 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Общее время записи будет зависеть от экспериментальных условий.
  2. Поведенческий анализ
    1. Подсчитайте поведение боя царапины. Мыши поднимают заднюю ногу к шее и царапают несколько раз в течение одной или нескольких секунд, а затем опустить ногу. Эта серия действий засчитывается как один бой нуля. Царапины в других областях не следует считать.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Действие царапин аналогично тому, что в модели инъекций щеки, за исключением того, что расположение царапин смещается на шею.

Результаты

В модели инъекции шеи, гистамин индуцированных сильных царапин поведения(Рисунок 3). Транспортное средство (7% tween 80 в солин) также индуцированных царапин поведения. Предыдущий доклад показал, что моющее средство индуцированных зуд от производства гистамина из кератиноцитов8. Tween 80 может вызвать зуд с помощью аналогичных механизмов, в то время как капсаицин снижение транспортного средства индуцированных царапин поведения, в отличие от предыдущего доклада4. Вполне возможно, что различия штамма мыши может объяснить эти различные результаты. Эти результаты показывают, что влияние боли на царапин ы поведения является сложным. Таким образом, одновременное измерение боли и зуд связанных поведения может позволить точный анализ pruritogens и алгогенов. В модели инъекции щеки, капсаицин не вызывают царапин поведения и только индуцированных вытирая поведения, которые, как полагают, связаны с болью9,10,11 (Рисунок 4). Капсаицин инъекции также увеличение ухода поведения (данные не показаны). После инъекции в щеку, гистамин в основном индуцированных царапин поведения со слабым поведением вытирая. Применение антигистаминного реагента, димедрола, ингибируется царапины. Этот результат показывает, что гистамин индуцированных царапин поведения вызваны действием гистамина на рецепторы гистамина. Вот, например, показаны эффекты LPA в модели инъекций щеки(рисунок 5). LPA является зуд посредника, найденные в холестатических пациентов с зудом. Тем не менее, в моделях мыши, LPA было сообщено как pruritogen и algogen12,13,14,15. Таким образом, эффекты LPA были исследованы в модели инъекции щеки и результаты показали, что LPA индуцированных царапин, но не вытирая поведения. Это указывает на то, что LPA является pruritogen, но не альгоген, у мышей похож на его последствия у людей.

figure-results-1
Рисунок 3: Эффекты гистамина и капсаицина в модели инъекций шеи. (A) Царапины поведения, вызванные инъекцией транспортного средства (7% tween 80 в солин, открытый квадрат), гистамин (50 мкг/10 л на сайт, заполненные круги) или капсаицин ( 10 мкг/10 л на участок, открытый треугольник; 40 мкг/10 юртей на участок, заполненный треугольник) в шею, оценивались каждые 5 минут в общей сложности 30 мин. ( B) Количественный анализ царапин поведения в течение 30 мин периода в панели A. Коррекции. Данные отображаются в виде среднего ЗНАЧЕНИЯ (n No 6-8). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 4: Эффекты pruritogen и алгогена в модели инъекций щеки. Вытирая() и царапины (B) поведения, вызванные инъекцией транспортного средства (7% tween 80 в сольник, открытый квадрат), гистамин (50 мкг /10 л на участок, заполненные круги) или капсаицин (40 мкг/10 л на сайте, заполненный треугольник) в правую щеку мышей были оценили каждые 5 минут в общей сложности 30 минут. Группа, показанная в качестве открытых кругов, была обработана 10 мл 2% (w/v) димедроловой гидрохлоридной соли (DHHCL) percutaneously 30 мин до инъекции гистамина (50 мкг/10 л на участок). DHHCl растворяется в сольнике. Количественный анализ вытирания (C) и царапин (D) поведения в течение 30 мин период в панелях A и B; n 8 животных на группу. П Злт; 0,05,П йlt; 0,01 по ANOVA следуют Bonferroni коррекции. Данные отображаются как среднее количество SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 5: LPA вызывает царапины, но не вытирая поведения в модели инъекции щеки. Царапины (A) и вытирая (B) поведения, вызванные инъекцией транспортного средства (солен, открытые квадраты) или LPA (100 нмоль /10 л на участок, заполненные круги) в правую щеку мышей были оценены каждые 5 минут в общей сложности 30 мин. Количественный анализ царапин (C) и вытирая (D) поведения в течение 30 мин период в панелях И B; n 17 для транспортного средства и n 20 для LPA. П Злт; 0,05,П йlt; 0,01 тест Уэлча. Данные отображаются как средние - SEM. Эта цифра была изменена из Kittaka и др.5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-4
Фильм 1: Фильм, демонстрирующий, как побрить щеку мыши. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Право нажмите, чтобы скачать.)

figure-results-5
Фильм 2: Фильм, демонстрирующий инъекцию в щеку мыши. (Право нажмите, чтобы скачать.)

figure-results-6
Фильм 3: Фильм, демонстрирующий типичное поведение, вытирающее. Этот фильм показан со скоростью 25%. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Право нажмите, чтобы скачать.)

figure-results-7
Фильм 4: Фильм типичного поведения царапин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Право нажмите, чтобы скачать.)

figure-results-8
Фильм 5: Фильм типичного поведения ухода. Этот фильм показан со скоростью 25%. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Право нажмите, чтобы скачать.)

Обсуждение

В этой статье вводится модель инъекций щек и показана полезная для анализа поведения, связанного с болью и зудом.

Предыдущий доклад показал, что альгетические вещества вызывают царапин поведения в мыши шеи инъекции модели4. В отличие от капсаицина снижение нуля поведения в других экспериментах инъекции шеи(Рисунок 3). Таким образом, влияние боли на царапин поведение остается неясным. Таким образом, необходимо разработать метод для одновременного расследования боли и зуда через поведенческие тесты. С помощью модели инъекции щеки, влияние вещества на боль и зуд может быть оценена.

Ранее сообщалось, что внутриклеточная LPA непосредственно активирует TRPV1 и TRPA1 как механизм LPA-индуцированного зуда5. Соответственно, LPA-индуцированный зуд может быть гистамином независимым. Предыдущее исследование также показало, что модель инъекции щек может быть использована для оценки гистамина-независимого зуда16. Таким образом, эта модель может быть использована как для гистамина-зависимых и -независимый зуд.

Одним из важнейших шагов в этом эксперименте является инъекция. Поскольку это острый поведенческий тест, анестезия не может быть использована в шаге инъекции, как это может повлиять на такое поведение. Таким образом, мышь должна быть надежно проведена для того, чтобы выполнить точную инъекцию. Когда удержание животного не является безопасным, особенно при инъекциях сильных алгогенов, мыши могут бороться, что приводит к неточной объем инъекции и глубины, а затем трудности в интерпретации результатов. При обращении с мышью, потяните кожу на затылке между большим и указательным пальцами, чтобы ингибировать движение мыши.

Другим важным шагом является поведенческий анализ. Потому что царапины очень быстро, видео необходимо внимательно следить. Кроме того, вытирая может быть трудно отличить от ухода. Поэтому в ходе первого эксперимента рекомендуется использовать положительные химические вещества, такие как капсаицин. Условия записи и воспроизведения также могут повлиять на подсчет обоих моделей поведения. Если трудно четко наблюдать за поведением, зеркала могут быть использованы вокруг клеток для повышения угла обзора4.

Следует отметить, что модель инъекции щек может показать снижение количественной точности для испытанных химических веществ, чем в модели инъекции шеи. Как показано на рисунке 3 и рисунке 4, такое же количество гистамина индуцированных более царапин поведения в шее модели, чем в щеку модели, и показал меньшие изменения в модели инъекции шеи. После того, как испытанное вещество было показано, что pruritogen с низким альгесическим эффектом с моделью инъекции щеки, модель инъекции шеи рекомендуется для дополнительного количественного анализа. Даже с этими ограничениями, модель инъекции щеки полезна для точной оценки испытательных веществ, особенно в области исследования зуда.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы признательны докторам Стивену Г. Шимаде и Роберту Х. Ламотту (Школа медицины йельского университета, Коннектикут), методы которых (справка 4) этот метод был адаптирован. Мы также благодарим г-на Кентаро Мияхара за создание иллюстраций для мыши. Это исследование было поддержано Грант-в-помощь для научных исследований от Министерства образования, культуры, спорта, науки и техники в Японии (No 15H02501 и 15H05928 в М.Т., и No 16K21691 в HK) и Ухара Мемориальный фонд (х.К.). Мы высоко ценим внедрение метода инъекций щек профессором Ламоттом в йельском университете.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
КапсаицинSigmaM2028
Дифенгидрама гидрохлоридWako044-19772
ГистаминSigmaH7125
iMovieЯблочная
лизофосфатидоновая кислотаAvanti Полярные липиды325465-93-8
MyjectorTerumoss-05M2913
Tween-80SigmaP4780
ВидеокамераPanasonicVX985M

Ссылки

  1. Ikoma, A., Steinhoff, M., Stander, S., Yosipovitch, G., Schmelz, M. The neurobiology of itch. Nature Reviews Neuroscience. 7 (7), 535-547 (2006).
  2. Kuraishi, Y., Nagasawa, T., Hayashi, K., Satoh, M. Scratching behavior induced by pruritogenic but not algesiogenic agents in mice. European Journal of Pharmacology. 275 (3), 229-233 (1995).
  3. Kuraishi, Y., Yamaguchi, T., Miyamoto, T. Itch-scratch responses induced by opioids through central mu opioid receptors in mice. Journal of Biomedical Science. 7 (3), 248-252 (2000).
  4. Shimada, S. G., LaMotte, R. H. Behavioral differentiation between itch and pain in mouse. Pain. 139 (3), 681-687 (2008).
  5. Kittaka, H., Uchida, K., Fukuta, N., Tominaga, M. Lysophosphatidic acid-induced itch is mediated by signalling of LPA5 receptor, phospholipase D and TRPA1/TRPV1. The Journal of Physiology. 595 (8), 2681-2698 (2017).
  6. Maekawa, T., Nojima, H., Kuraishi, Y. Itch-associated responses of afferent nerve innervating the murine skin: different effects of histamine and serotonin in ICR and ddY mice. The Japanese Journal of Pharmacology. 84 (4), 462-466 (2000).
  7. Inagaki, N., et al. Scratching behavior in various strains of mice. Skin Pharmacology and Applied Skin Physiology. 14 (2), 87-96 (2001).
  8. Inami, Y., et al. Topical surfactant-induced pruritus: involvement of histamine released from epidermal keratinocytes. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 344 (2), 459-466 (2012).
  9. Vos, B. P., Hans, G., Adriaensen, H. Behavioral assessment of facial pain in rats: face grooming patterns after painful and non-painful sensory disturbances in the territory of the rat's infraorbital nerve. Pain. 76 (1-2), 173-178 (1998).
  10. Yeo, J. F., Ong, W. Y., Ling, S. F., Farooqui, A. A. Intracerebroventricular injection of phospholipases A2 inhibitors modulates allodynia after facial carrageenan injection in mice. Pain. 112 (1-2), 148-155 (2004).
  11. Yeo, J. F., Ling, S. F., Tang, N., Ong, W. Y. Antinociceptive effect of CNS peroxynitrite scavenger in a mouse model of orofacial pain. Experimental Brain Research. 184 (3), 435-438 (2008).
  12. Hashimoto, T., Ohata, H., Momose, K. Itch-scratch responses induced by lysophosphatidic acid in mice. Pharmacology. 72 (1), 51-56 (2004).
  13. Kremer, A. E., et al. Lysophosphatidic acid is a potential mediator of cholestatic pruritus. Gastroenterology. 139 (3), 1008-1018 (2010).
  14. Alemi, F., et al. The TGR5 receptor mediates bile acid-induced itch and analgesia. Journal of Clinical Investigation. 123 (4), 1513-1530 (2013).
  15. Nieto-Posadas, A., et al. Lysophosphatidic acid directly activates TRPV1 through a C-terminal binding site. Nature Chemical Biology. 8 (1), 78-85 (2011).
  16. Akiyama, T., Carstens, M. I., Carstens, E. Differential itch- and pain-related behavioral responses and µ-opoid modulation in mice. Acta Dermato-Venereologica. 90 (6), 575-581 (2010).

Перепечатки и разрешения

Теги

LPA
Модель инъекций щекдля одновременные измерения боли и поведения, связанных с зудом
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.