Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Анализ сворачивание белков, транспорта и деградации в живых клетках, радиоактивных пульс Чейз

10.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58952

⸱

12 февраля 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cellular Protein Chemistry, Utrecht University, 2Program in Cellular and Molecular Medicine, Boston Children's Hospital

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы описываем протокол для общего импульса Чейз метод, который позволяет кинетический анализ складывания, транспорта и деградации белков в живых клеток.

Аннотация

Маркировки радиоактивных пульс Чейз является мощным инструментом для изучения конформационного созревания, транспорт до их функциональной сотовой местоположения и деградации белков-мишеней в живых клетках. С помощью коротких (пульс) radiolabeling раз (< 30 мин) и контролировались Чейз раз, можно пометить только небольшая часть общего белка бассейн и следовать его складывание. В сочетании с nonreducing/уменьшение электрофореза геля SDS-полиакриламид (SDS-PAGE) и иммунопреципитации с (конформация) антитела, складывающиеся процессы могут рассматриваться подробно. Эта система использовалась для анализа складывания белков с огромные различия в свойствах растворимые белки, единого и многоходовой трансмембранные белки, сильно N и O гликозилированного белки, и белков с и без обширных дисульфида склеивание. Пульс Чейз методы являются основой кинетических исследований в целый ряд дополнительных функций, включая co - Посттрансляционная модификации, олигомеризация и полимеризации, по существу позволяет анализ белка от рождения до смерти. Пульс Чейз исследования на сворачивание белков дополняют другие биохимические и биофизические методы для изучения белков в пробирке , обеспечивая увеличение временного разрешения и физиологической информации. Методы, как описано в этом документе приспособлены легко учиться, складывающиеся почти любой белок, который может быть выражен в системах млекопитающих и насекомых клеток.

Введение

Складные даже сравнительно простые белки включает в себя множество различных складной ферменты, молекулярные сопровождающих и ковалентный модификации1. Полное восстановление этих процессов в vitro практически невозможно, учитывая огромное количество различных компонентов. Весьма желательно, таким образом, для изучения белков складывания в естественных условиях, в живых клетках. Радиоактивных пульс Чейз методики доказывают мощный инструмент для изучения синтеза, свертка, транспорта и деградации белков в их естественной среде.

Метаболические маркировки белков во время короткого импульса с 35S-меченых метионина/цистеина, затем Чейз в отсутствие радиоактивных метку, позволяет отслеживания населения вновь синтезируемых белков в широкой клеточного окружения. Затем целевых белков может быть изолированным через иммунопреципитации и проанализированы через SDS-PAGE или других методов. Для многих белков их путешествие через ячейку характеризуется изменениями, которые видны на геля SDS-PAGE. Например перевозки гликозилированного белков от эндоплазменный ретикулум (ER) в комплекс Гольджи часто сопровождается изменения N-связаны гликанов или добавлением гликаны, связанный с O2,3. Эти изменения вызывают значительное увеличение в очевидной молекулярной массы, которую можно увидеть изменения подвижности в SDS-PAGE. Созревания также может быть отмечен протеолитического расщепления, например сигнал пептид спайности или удаления pro пептиды, что привело к изменениям в очевидной молекулярной массы, которая может легко следовать на гель SDS-PAGE4. Радиоактивность имеет значительные преимущества перед сопоставимых методов, таких как циклогексимида погони, где предотвратить синтез новых белков, как длительного лечения токсичны для клеток и не исключает большинство старых, устойчивого состояния белков из анализ, как некоторые белки имеют периоды полураспада дней. Сравнение белков под оба nonreducing и уменьшение условий позволяет анализ формирования дисульфидными облигаций, важный шаг в сложенном многих выделительные протеины4,5,6, 7.

Здесь мы описываем общий метод для анализа сворачивание белков и транспорта в нетронутым клеток, используя подход радиоактивных пульс Чейз. Хотя мы стремились представить этот метод как как можно более подробно протокол имеет почти безграничным потенциалом для адаптации и позволит оптимизации для изучения специфических белков каждого читателя.

Предоставляются две альтернативные пульс Чейз протоколов, один для адэрентных клеток (шаг 1.1 протокола, представленные здесь) и один для подвески клеток (шаг 1.2 протокола, представленные здесь). Условия здесь являются достаточными для визуализации белок с средне высокий выражение уровня. Если читатель работает с слабо выраженной белки или различных рентгенологическое условий, таких как несколько immunoprecipitations, необходимо увеличить размер блюдо или мобильный телефон надлежащим образом.

Для подвески пульс Чейз Чейз проб, взятых в каждый момент времени все взяты из одной трубки клеток. Мыть шаги после импульса опущены; Вместо этого дальнейшее включение 35S предотвращается путем разбавления с высоким избыток немеченого метионина и цистеина.

Представлены протоколы используют радиоактивные 35S-меченых цистеина и метионина следовать клеточных процессов, сворачивание белков. Используя соответствующие защитные меры для сведения к минимуму любого воздействия оператора и окружающей среды, радиоактивного излучения и выполняться в назначенной лаборатории следует выполнять все операции с радиоактивными реагентов. Как пульс Чейз маркировки техника относительно неэффективными порой короткого импульса (< 15 мин), меньше, чем 1% от начальной суммы радиоактивности включена в вновь синтезируемых белков. После обогащения целевого белка через иммунопреципитация образец для SDS-PAGE содержит меньше чем 0,05% от суммы начального радиоактивности.

Хотя 35S метионина и цистеина, маркировки смеси стабилизируется, некоторые разложения, уступая летучих радиоактивных соединений, будет происходить. Чтобы защитить исследователь и аппарата, следует принять некоторые меры предосторожности. Исследователь всегда должен подчиняться правилам безопасности местных излучения и может носить уголь кормящих маски, кроме лаборатории пальто и перчатки (двойной). Складе флаконов с 35S метионина и цистеина всегда должен быть открыт в вытяжной шкаф или под местной стремление точки. Пятна загрязнения известных лабораторных центрифуг, пипетки, водяные бани, инкубаторы и шейкеры. С помощью пипетки советы с угольный фильтр, положительный печать microcentrifuge трубки (см. Таблицу материалы), аквариум угольные губки в воды ванны, угольный фильтр документах склеены в пульс Чейз блюда, уменьшается загрязнение этих областей Древесный уголь гвардия в системы аспирации и размещение блюда, содержащие уголь зерна в инкубаторы и хранения контейнеров.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все радиоактивные реагентов и процедуры были обработаны в соответствии с местными Утрехтского университета излучения правил и положений.

1. Пульс Чейз

  1. Чейз импульса для адэрентных клеток
    Примечание: Приведенные объемы основаны на 60 мм ячейку культуры блюда. Для 35 мм или 100 мм блюда умножьте томов на 1/2 или 2, соответственно. Этот протокол использует время импульса 10 мин и Чейз времен 0, 15, 30, 60, 120 и 240 мин. Они могут варьироваться в зависимости от специфических белков, изучается (обсуждается ниже).
    1. Семя адэрентных клеток (например, ГЭС 293, HeLa, Чо) в шести блюд культуры клеток 60 мм, так что они будут subconfluent (80% - 90%), в день пульс Чейз. Используйте по крайней мере одно блюдо в момент времени и/или состояния.
    2. При необходимости, transfect клетки с коммерчески доступных трансфекции реагентов в соответствии с инструкциями производителя; или, как вирус передают8 клетки 1 день до пульс Чейз экспериментировать с соответствующей конструкции для выражения.
    3. Мыть посуду с 2 мл буфера мытья (Хэнк сбалансированного солевого раствора [HBSS]), добавить 2 мл среды голода (нормальной культуры среднего хватает метионина и цистеина и плода бычьим сывороточным [FBS], таких как минимум основных средних [мкм] без метионина и цистеина но с 10 мм HEPES, рН 7,4) и блюда в увлажненные инкубатора 37 ° C с 5% CO2 за 15 мин.
    4. Блюда можно передать стойки в ванну воду подогретую 37 ° C тем, что они находятся в контакте с водой, но не плавают. Запустите таймер.
    5. В 40 s, аспирационная среднего голода, составить 600 мкл раствора импульса (голодания СМИ + 55 мм Μки/35 блюдо этикетка, см. Примечание предшествующих шаг 1.1.1) в пипетку и добавить его нежно центр блюдо на точно 1 мин повторить этот шаг с интервалом 1 мин t Он оставшиеся блюда. Начните с длинной Чейз образец, чтобы сэкономить время во время эксперимента.
      Примечание: При обработке радиоактивных материалов, крайне важно соблюдать надлежащие меры предосторожности и местные правила и правила для предотвращения случайного воздействия и/или загрязнения.
    6. В Ровно 11 мин для всех следующих блюд, за исключением 0 мин Чейз образца, добавить 2 мл Чейз среды непосредственно в блюдо, аспирационная его и снова, добавить 2 мл Чейз среды. Повторите этот шаг с интервалом 1 мин оставшиеся блюда. Передать все блюда инкубатора 37 ° C.
    7. В ровно 16 мин, добавить 2 мл среды Чейз (нормальной культуры среднего + 10 мм HEPES [рН 7,4], хвоща 5 мм и 5 мм метионина) непосредственно на 0 мин образец блюдо на вершине импульса среднего остановить маркировки; Аспирационная немедленно, передавать блюдо охлаждением алюминиевой пластине затем добавить 2 мл ледяной стоп буфера (HBSS + 20 мм N- ethylmaleimide [NEM]).
      Примечание: Это образец Чейз 0 мин. Для этого образца перейти непосредственно к шагу 1.1.9.
    8. Перевести каждое блюдо Чейз обратно на водяной бане 2 мин перед каждой Чейз время (например, 24 мин для Чейз 15 мин) и, в то время точное Чейз (например, 26 мин для 15 мин Чейз), аспирационная Чейз СМИ (или перенести его на пробки microcentrifuge, если после pr otein секреции) и передать охлаждением алюминиевой пластине блюдо. Добавьте 2 мл ледяной стоп буфера.
    9. Инкубируйте все блюда на льду в буфере стоп для ≥5 мин; затем аспирационная универсальное решение и мыть его с 2 мл раствора ледяной стоп. Аспирационная мыть и лизируют блюда с 600 мкл буфера lysis (фосфат амортизированное saline [PBS] + nondenaturing моющее средство [см. Таблицу материалы] ингибиторы протеазы + 20 мм NEM). Используйте скребок ячейки, чтобы количественно лизированы блюда.
    10. Передать lysate пробки microcentrifuge 1,5 мл и центрифуги для 10 мин на 15000-20000 x g и 4 ° C до Пелле ядер.
  2. Чейз импульса для подвески клетки
    Примечание: Для обеспечения эффективности маркировки, клетки должны пульсирующий в концентрации 3 х 106 -5 х 106 клеток/мл, и Чейз тома должен быть 4 x объем импульса. В следующем примере мы пульсирующий 5 х 106 клеток в объеме 1 мл в течение 10 мин, чтобы принести пять погони время точки (0, 15, 30, 60 и 120 мин) 1 мл, содержащие 1 х 106 клеток на момент времени. Все решения являются так же, как и в разделе 1.1.
    1. Культура подвеска клетки (например, 3T3, Jurkat), согласно опубликованному ранее протокол9 , так что есть достаточное количество клеток во время эксперимента, по крайней мере 1 x 106 клеток / время точки или условие.
    2. При необходимости, transfect клетки с коммерчески доступных трансфекции реагентов в соответствии с инструкциями производителя, или вирусно передают8 клетки 1 день до пульс Чейз экспериментировать с соответствующей конструкции для выражения.
    3. Пелле 5 х 106 клеток / условие в 50 мл трубки 5 мин на 250 x g при комнатной температуре, мыть их 1 x с 5 мл голода СМИ, Пелле их снова и Ресуспензируйте их в 1 мл голода средств массовой информации.
    4. Передача клетки в ванну воды 37 ° C и инкубировать их на 10-25 мин агитировать трубы каждые 10-15 мин, чтобы не допустить урегулирования в нижней части клетки.
    5. Запустите таймер. На точно 1 мин добавить 275 Μки (55 Μки/1 x 106 клеток) неразбавленной лейбла непосредственно в пробирку, содержащую клетки и взболтать.
      Примечание: При обработке радиоактивных материалов, крайне важно соблюдать надлежащие меры предосторожности и местные правила и правила для предотвращения случайного воздействия и/или загрязнения.
    6. В Ровно 11 мин прекратить маркировки путем добавления 4 мл Чейз средств массовой информации. Смешать образца и немедленно передать 1 мл 15 мл на льду, содержащий 9 мл раствора ледяной стоп.
      Примечание: Это образец Чейз 0 мин.
    7. Повторите эти шаги для каждой точки раз подряд. После того, как собраны все моменты времени, Пелле клетки для 5 мин на 250 x g при 4 ° C. Аспирационная среднего (или передать его на новой трубки 15 мл, если после секрецию белка). Вымыть клетки с 5 мл раствора стоп и Пелле клетки для 5 мин на 250 x g при 4 ° C.
    8. Аспирационная универсальное решение, полностью Лизируйте клетки с 300 мкл буфера lysis ледяной и проинкубируйте 20 мин на льду обеспечить полный лизис. Передать lysate пробки microcentrifuge 1,5 мл и центрифуги для 10 мин на 15000-20000 x g при 4 ° C до Пелле ядер.

2. иммунопреципитации

  1. Объединить антитела (см. обсуждение) и 50 мкл иммунопреципитации бусины (например, белок А-Sepharose) (подвеска [v/v] 10% в буфера lysis + 0,25% альбумина bovine сыворотки [BSA]) в microcentrifuge трубки и инкубировать их в 4 ° C ~ 30 мин в шейкере.
  2. Пелле бусы за 1 мин на 12000 x g при комнатной температуре и удалить супернатант. Добавить 200 мкл lysate смесь антител шарик и Инкубируйте на 4 ° C в шейкере за 1 ч или головка над если иммунопреципитации требует > 1 час.
  3. Пелле бусы за 1 мин на 12000 x g при комнатной температуре. Аспирационная супернатант и добавьте 1 mL мыть буфера иммунопреципитации. Поместите образец в шейкере при комнатной температуре в течение 5 мин.
  4. Пелле бисер, как описано в шаге 2.3 и повторите мыть 1 x. Затем аспирационная супернатант и Ресуспензируйте бисер в 20 мкл буфера TE, pH 6.8 (10 мм трис-HCl, ЭДТА 1 мм). Вихрь образца.
  5. 20 мкл 2 x буфер образца без восстанавливающего агента, вихревые, тепло его за 5 мин при 95 ° C и вихрь снова.
    Примечание: если только Подготовка сокращение образцов, 2 мкл 500 мм DTT следует добавить в этот момент. Затем перейдите к шагу 2.7.
  6. Пелле бисер, как описано в шаге 2.3. Перенесите 19 мкл nonreduced супернатант свежие microcentrifuge трубка, содержащая 1 мкл 500 мм DTT, центрифуга образца и вихрь его перед нагревом для 5 мин при 95 ° C снова.
  7. Спин вниз образца за 1 мин на 12000 x g; Это сокращение образца. Остудить до комнатной температуры и 1.1 мкл 1 М NEM как уменьшение, так и nonreduced образца. Вортекс и спин вниз образцы.

3. SDS-PAGE

  1. Во-первых определите соответствующие SDS-PAGE разрешая гель процент для протеина интереса. Например, gp120 ВИЧ-1, когда deglycosylated, работает на ~ 60 кДа и анализируется в 7,5% гель.
  2. Подготовьте разрешая гель смесь без TEMED согласно инструкциям производителя (x % акриламида, 375 мм трис-HCl [рН 8,8,] 0,1% SDS [w/v] и 0,05% Аммония пероксодисульфат [APS] [w/v]) и Дега под вакуумом для > 15 мин. В то время как смесь гель дегазации, тщательно очистите стеклянные пластины гелем с 70% этанола и безворсовой ткани и поместите их в аппарат литья.
  3. Добавьте TEMED разрешая гель смесь (в конечной концентрации 0,005% [v/v]), тщательно перемешать и Пипетка между пластинами стекла, оставляя ~1.5 см пространства для штабелируя гель. Тщательно overlay гель с дейонизированной H2O или изопропанолом и оставьте его для полимеризации.
  4. Как только разрешая Гель полимеризуется, подготовить укладки смеси гель (4% акриламида, 125 мм трис-HCl [pH 6.8], 0.1% SDS [w/v] и 0,025% APS [w/v]).
  5. Промойте в верхней части разрешая гель с дейонизированной H2O и затем удалите все воды.
    Примечание: Используйте фильтр бумага для удаления последние капли.
  6. Добавьте TEMED укладки смеси гель (0,005% [v/v]), перемешать и наложение разрешая гель с штабелируя гель и вставить гребень 15-хорошо. После штабелируя гель полимеризуется, передача его в работающей камере и заполнить верхней и нижней палат с запуском буфера (25 мм трис-HCl, 192 мм глицин [рН 8.3] и 0,1% SDS [w/v]).
  7. Загрузите 10 мкл образца за Лейн в пробирках 15-Лейн. Избежание загрузки образцов в первый и последний Лейн на геле и загрузить nonreducing буфер образца в все пустые полосы для предотвращения улыбаясь полос. Запустите гели при постоянном 25 мА/гель, до тех пор, пока краска фронт находится в нижней части геля.
  8. Удаление гели из стеклянных пластин, пятно гели с белком окрашивание раствора (уксусной кислоты 10% и 30% метанола в H2O + 0,25% блестящий синий R250 [w/v]) за 5 мин с перемешиванием и затем, Отмойте 30 мин с минигелей решение (окрашивание решение без блестящий синий R250).
  9. Организовать гели лицом вниз на пластиковые wrap и, затем, место бумажной хроматографии 0,4 мм поверх них. Поместите гель сэндвич хроматографии бумаги стороной вниз на гель фен. Следуя инструкциям изготовителя сухие гели втечение 2 ч при температуре 80 ° C.
  10. Передать кассету сушеные гели и обложи их с авторадиографии фильм или люминофора экрана. Если с помощью авторадиографии фильм, этот шаг должен выполняться в темной комнате.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Складные и секрецию gp120 ВИЧ-1 от Чейз адэрентных пульс показан на рисунке 2. Nonreducing гель (клетки NR на рисунке) показывает окислительного складывания gp120. Сразу же после импульса маркировки gp120 5 мин (0 мин Чейз) появляется как диффузные группа выше в гель, и по ходу погони, Группа переносит вниз гель через даже более рассеянным складывания интермедиаты (ИТ), до тех пор, пока он накапливается в полосе туго (NT) что представляет собой изначально сло...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Пульс Чейз методы имели важнейшее значение для понимания ученых белка, складывающиеся в нетронутым клеток. В то время как мы пытались обеспечить метод, который как можно больше общих, этот подход имеет потенциал для почти безграничные варианты для изучения различных процессов, которые происходят во время складывания, транспорта и жизнь белков внутри клетки.

При выполнении импульса Чейз, используя адэрентных клеток в блюдах, важно рассматривать каждое блюдо, то же самое как можно больше, как от...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Авторы поблагодарить всех членов Braakman лаборатории, прошлое и настоящее время, за их плодотворные дискуссии и помочь в разработке методов, представленных в этой статье. Этот проект получил финансирование от Европейского Совета исследований под Европейского союза седьмой рамочной программы (FP7/2007-2013) N ° 235649 и Нидерланды организации научных исследований (NWO) под эхо программа N ° 711.012.008.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,5 мл безопасные пробирки для микроцентрифугиSarstedt72.706.400
Уксусная кислотаSigmaA6283ледяная уксусная кислота
BAS Накопительный люминофорный экран 20x25 смGE Life Sciences28956475
Бромфенол СинийSigmaB8026Молекулярная биология класса
Carestream Biomax MR пленкиKodakZ350370-50EA
Среды для клеточных культурРазличныеН/ДНормальные среды для клеточных культур для конкретных используемых клеточных линий
Среды для клеточных культур, без метионина/цистеинаРазличныеН/АТа же формула среды, что и обычные питательные среды, например, DMEM/MEM/RPMI, без метионина и цистеина
Угольная фильтровальная бумагаВатман1872047
Угольные наконечники для пипетокМолекулярные биопрепараты5069B
Угольный вакуумный гардВатман67221001
Coomassie Brilliant Blue R250Sigma112,553для электрофореза
ЦистеинSigmaC7352Класс молекулярной биологии, Make 500 mM stock, хранить при -20 
Дитиотреитол (DTT)Sigma10197777001класс молекулярной биологии
EasyTag Express35S Смесь для маркировки белкаPerkin ElmerNEG772014MCДругие партии этикеток доступны в зависимости от использования
EDTASigmaE1644Класс молекулярной биологии
Оборудование для сушки геляРазличныен/д
ГлицеринSigmaG5516Молекулярная биология класс
3 класс хроматографическая бумагаGE Life Sciences3003-917
Сбалансированный раствор соли Хэнка (HBSS)Gibco24020117
Kimwipes деликатные салфеткидля задач VWR21905-026
MESSigma M3671Метанол молекулярной биологии марки
SigmaMX0490 
МетионинSigmaM5308Класс молекулярной биологии, Сделать запас 250 мМ, хранить при -20
Оборудование для литья/хода MinigelРазличныеN/A
NaClSigmaS7653Молекулярная биология класса
N-этилмалеимидSigmaE3876Класс молекулярной биологии, Сделать 1М бульон в 100% этаноле, хранить при -20
PBSSigmaP5368Молекулярная биология класса
Белок-А Сефароза быстротекущие бусиныGE здравоохранение17-5280-04
Додецилсульфат натрия (SDS)SigmaL3771Молекулярная биология класса
Triton X-100SigmaT8787Молекулярная биология класс
Trizma base (Tris)SigmaT6066Молекулярная биология класса
Typhoon IP Биомолекулярный имиджерAmersham29187194
штатив для пробирок 20 мм для водяной баниNalgene5970-0320PK

Ссылки

  1. Ellgaard, L., McCaul, N., Chatsisvili, A., Braakman, I. Co- and Post-Translational Protein Folding in the ER. Traffic. 17 (6), 615-638 (2016).
  2. Pisoni, G. B., Molinari, M. Five Questions (with their Answers) on ER-Associated Degradation. Traffic. 17 (4), 341-350 (2016).
  3. Lamriben, L., Graham, J. B., Adams, B. M., Hebert, D. N. N-Glycan-based ER Molecular Chaperone and Protein Quality Control System: The Calnexin Binding Cycle. Traffic. 17 (4), 308-326 (2016).
  4. Snapp, E. L., et al. Structure and topology around the cleavage site regulate post-translational cleavage of the HIV-1 gp160 signal peptide. Elife. 6, 26067(2017).
  5. Braakman, I., Hoover-Litty, H., Wagner, K. R., Helenius, A. Folding of influenza hemagglutinin in the endoplasmic reticulum. Journal of Cell Biology. 114 (3), 401-411 (1991).
  6. Jansens, A., van Duijn, E., Braakman, I. Coordinated nonvectorial folding in a newly synthesized multidomain protein. Science. 298 (5602), 2401-2403 (2002).
  7. Land, A., Braakman, I. Folding of the human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein in the endoplasmic reticulum. Biochimie. 83 (8), 783-790 (2001).
  8. Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function. Journal of Visualized Experiments. (117), e54698(2016).
  9. Das, A. T., Land, A., Braakman, I., Klaver, B., Berkhout, B. HIV-1 evolves into a nonsyncytium-inducing virus upon prolonged culture in vitro. Virology. 263 (1), 55-69 (1999).
  10. Chen, W., Helenius, J., Braakman, I., Helenius, A. Cotranslational folding and calnexin binding during glycoprotein synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (14), 6229-6233 (1995).
  11. Daniels, R., Kurowski, B., Johnson, A. E., Hebert, D. N. N-linked glycans direct the cotranslational folding pathway of influenza hemagglutinin. Molecular Cell. 11 (1), 79-90 (2003).
  12. Ferreira, L. R., Norris, K., Smith, T., Hebert, C., Sauk, J. J. Association of Hsp47, Grp78, and Grp94 with procollagen supports the successive or coupled action of molecular chaperones. Journal of Cellular Biochemistry. 56 (4), 518-526 (1994).
  13. Hoelen, H., et al. The primary folding defect and rescue of DeltaF508 CFTR emerge during translation of the mutant domain. PLoS One. 5 (11), 15458(2010).
  14. Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. Folding of CFTR is predominantly cotranslational. Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).
  15. Hagiwara, M., Ling, J., Koenig, P. A., Ploegh, H. L. Posttranscriptional Regulation of Glycoprotein Quality Control in the Endoplasmic Reticulum Is Controlled by the E2 Ub-Conjugating Enzyme UBC6e. Molecular Cell. 63 (5), 753-767 (2016).
  16. Copeland, C. S., Doms, R. W., Bolzau, E. M., Webster, R. G., Helenius, A. Assembly of influenza hemagglutinin trimers and its role in intracellular transport. Journal of Cell Biology. 103 (4), 1179-1191 (1986).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Анализ сворачивание белков, транспорта и деградации в живых клетках, радиоактивных пульс Чейз
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.