Здесь мы описываем протокол для общего импульса Чейз метод, который позволяет кинетический анализ складывания, транспорта и деградации белков в живых клеток.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Анализ сворачивание белков, транспорта и деградации в живых клетках, радиоактивных пульс Чейз
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Маркировки радиоактивных пульс Чейз является мощным инструментом для изучения конформационного созревания, транспорт до их функциональной сотовой местоположения и деградации белков-мишеней в живых клетках. С помощью коротких (пульс) radiolabeling раз (< 30 мин) и контролировались Чейз раз, можно пометить только небольшая часть общего белка бассейн и следовать его складывание. В сочетании с nonreducing/уменьшение электрофореза геля SDS-полиакриламид (SDS-PAGE) и иммунопреципитации с (конформация) антитела, складывающиеся процессы могут рассматриваться подробно. Эта система использовалась для анализа складывания белков с огромные различия в свойствах растворимые белки, единого и многоходовой трансмембранные белки, сильно N и O гликозилированного белки, и белков с и без обширных дисульфида склеивание. Пульс Чейз методы являются основой кинетических исследований в целый ряд дополнительных функций, включая co - Посттрансляционная модификации, олигомеризация и полимеризации, по существу позволяет анализ белка от рождения до смерти. Пульс Чейз исследования на сворачивание белков дополняют другие биохимические и биофизические методы для изучения белков в пробирке , обеспечивая увеличение временного разрешения и физиологической информации. Методы, как описано в этом документе приспособлены легко учиться, складывающиеся почти любой белок, который может быть выражен в системах млекопитающих и насекомых клеток.
Введение
Складные даже сравнительно простые белки включает в себя множество различных складной ферменты, молекулярные сопровождающих и ковалентный модификации1. Полное восстановление этих процессов в vitro практически невозможно, учитывая огромное количество различных компонентов. Весьма желательно, таким образом, для изучения белков складывания в естественных условиях, в живых клетках. Радиоактивных пульс Чейз методики доказывают мощный инструмент для изучения синтеза, свертка, транспорта и деградации белков в их естественной среде.
Метаболические маркировки белков во время короткого импульса с 35
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все радиоактивные реагентов и процедуры были обработаны в соответствии с местными Утрехтского университета излучения правил и положений.
1. Пульс Чейз
-
Чейз импульса для адэрентных клеток
Примечание: Приведенные объемы основаны на 60 мм ячейку культуры блюда. Для 35 мм или 100 мм блюда умножьте томов на 1/2 или 2, соответственно. Этот протокол использует время импульса 10 мин и Чейз времен 0, 15, 30, 60, 120 и 240 мин. Они могут варьироваться в зависимости от специфических белков, изучается (обсуждается ниже).- Семя адэрентных клеток (например, ГЭС 293, HeLa, Чо) в шести блюд культуры клеток 60 ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Складные и секрецию gp120 ВИЧ-1 от Чейз адэрентных пульс показан на рисунке 2. Nonreducing гель (клетки NR на рисунке) показывает окислительного складывания gp120. Сразу же после импульса маркировки gp120 5 мин (0 мин Чейз) появляется как диффузные группа выше в гель, и по ходу погони, Группа переносит вниз гель через даже более рассеянным складывания интермедиаты (ИТ), до тех пор, пока он накапливается в полосе туго (NT) что представляет собой изначально сло.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Пульс Чейз методы имели важнейшее значение для понимания ученых белка, складывающиеся в нетронутым клеток. В то время как мы пытались обеспечить метод, который как можно больше общих, этот подход имеет потенциал для почти безграничные варианты для изучения различных процессов, которые происходят во время складывания, транспорта и жизнь белков внутри клетки.
При выполнении импульса Чейз, используя адэрентных клеток в блюдах, важно рассматривать каждое блюдо, то же самое как можно больше, как от.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Авторы поблагодарить всех членов Braakman лаборатории, прошлое и настоящее время, за их плодотворные дискуссии и помочь в разработке методов, представленных в этой статье. Этот проект получил финансирование от Европейского Совета исследований под Европейского союза седьмой рамочной программы (FP7/2007-2013) N ° 235649 и Нидерланды организации научных исследований (NWO) под эхо программа N ° 711.012.008.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1,5 мл безопасные пробирки для микроцентрифуги | Sarstedt | 72.706.400 | |
| Уксусная кислота | Sigma | A6283 | ледяная уксусная кислота |
| BAS Накопительный люминофорный экран 20x25 см | GE Life Sciences | 28956475 | |
| Бромфенол Синий | Sigma | B8026 | Молекулярная биология класса |
| Carestream Biomax MR пленки | Kodak | Z350370-50EA | |
| Среды для клеточных культур | Различные | Н/Д | Нормальные среды для клеточных культур для конкретных используемых клеточных линий |
| Среды для клеточных культур, без метионина/цистеина | Различные | Н/А | Та же формула среды, что и обычные питательные среды, например, DMEM/MEM/RPMI, без метионина и цистеина |
| Угольная фильтровальная бумага | Ватман | 1872047 | |
| Угольные наконечники для пипеток | Молекулярные биопрепараты | 5069B | |
| Угольный вакуумный гард | Ватман | 67221001 | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | Sigma | 112,553 | для электрофореза |
| Цистеин | Sigma | C7352 | Класс молекулярной биологии, Make 500 mM stock, хранить при -20 |
| Дитиотреитол (DTT) | Sigma | 10197777001 | класс молекулярной биологии |
| EasyTag Express35S Смесь для маркировки белка | Perkin Elmer | NEG772014MC | Другие партии этикеток доступны в зависимости от использования |
| EDTA | Sigma | E1644 | Класс молекулярной биологии |
| Оборудование для сушки геля | Различные | н/д | |
| Глицерин | Sigma | G5516 | Молекулярная биология класс |
| 3 класс хроматографическая бумага | GE Life Sciences | 3003-917 | |
| Сбалансированный раствор соли Хэнка (HBSS) | Gibco | 24020117 | |
| Kimwipes деликатные салфетки | для задач VWR | 21905-026 | |
| MES | Sigma | M3671 | Метанол молекулярной биологии марки |
| Sigma | MX0490 | ||
| Метионин | Sigma | M5308 | Класс молекулярной биологии, Сделать запас 250 мМ, хранить при -20 |
| Оборудование для литья/хода Minigel | Различные | N/A | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Молекулярная биология класса |
| N-этилмалеимид | Sigma | E3876 | Класс молекулярной биологии, Сделать 1М бульон в 100% этаноле, хранить при -20 |
| PBS | Sigma | P5368 | Молекулярная биология класса |
| Белок-А Сефароза быстротекущие бусины | GE здравоохранение | 17-5280-04 | |
| Додецилсульфат натрия (SDS) | Sigma | L3771 | Молекулярная биология класса |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Молекулярная биология класс |
| Trizma base (Tris) | Sigma | T6066 | Молекулярная биология класса |
| Typhoon IP Биомолекулярный имиджер | Amersham | 29187194 | |
| штатив для пробирок 20 мм для водяной бани | Nalgene | 5970-0320PK |
Ссылки
- Ellgaard, L., McCaul, N., Chatsisvili, A., Braakman, I. Co- and Post-Translational Protein Folding in the ER. Traffic. 17 (6), 615-638 (2016).
- Pisoni, G. B., Molinari, M. Five Questions (with their Answers) on ER-Associated Degradation. Traffic. 17 (4), 341-350 (2016).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
