Методическая статья

Человеческая периферическая кровь Нейтрофилов Изоляция для допроса Паркинсона Связанные LRRK2 Киназы Путь путем оценки Rab10 фосфорилирования

DOI:

10.3791/58956

⸱

21 марта 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1MRC Protein Phosphorylation and Ubiquitylation Unit, School of Life Sciences, University of Dundee, 2The Michael J. Fox Foundation for Parkinson's Research, 3Department of Medical and Molecular Genetics, Indiana University School of Medicine, 4Morton and Gloria Shulman Movement Disorders Centre and the Edmond J. Safra Program in Parkinson's Disease, Toronto Western Hospital, University of Toronto, 5Division of Cell Signalling and Immunology, School of Life Sciences, University of Dundee, 6Division of Molecular and Clinical Medicine, School of Medicine, Ninewells Hospital and Medical School, University of Dundee

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мутации в леуцине богатые повторить киназы 2 гена (LRRK2) вызывают наследственное заболевание Паркинсона. Мы разработали простой и надежный метод оценки lRRK2 контролируемого фосфорилирования Rab10 в нейтрофилов периферической крови человека. Это может помочь определить людей с повышенной активностью пути киназы LRRK2.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Лейцин богатый повторить киназу 2 (LRRK2) является наиболее часто мутировавшим геном в наследственной болезни Паркинсона (PD) и все патогенные мутации LRRK2 привести к гиперактивации его функции киназы. Здесь мы описываем простой и надежный анализ для количественной оценки lRRK2 киназы пути деятельности в нейтрофилов периферической крови человека путем измерения LRRK2 контролируемых фосфорилирования одного из своих физиологических субстратов, Rab10 на threonine 73. Описанный анализ иммуноблоттинга требует полностью селективного и фосфоспецифического антитела, которое распознает эпитопные фосфоры Rab10, такие как моноклональные антитела кролича MJFF-pRab10. Он использует нейтрофилы периферической крови человека, потому что периферическая кровь легко доступна и нейтрофилы являются обильным и однородным компонентом. Важно отметить, что нейтрофилы выражают относительно высокий уровень как LRRK2, так и Rab10. Потенциальным недостатком нейтрофилов является их высокая внутренняя активность протеазы серин, что требует использования очень мощных ингибиторов протеазы, таких как органофосфор нейротоксин diisopropylfluophosphate (DIFP) как часть буфера лизиса. Тем не менее, нейтрофилы являются ценным ресурсом для исследования активности пути киназы LRRK2 в vivo и должны быть рассмотрены для включения в коллекции PD биопозиторий.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Попытки замедлить или остановить болезнь Паркинсона (PD) до сих пор не увенчались успехом. Открытие гиперактивации мутаций в лейцине богатых повторить киназу 2 (LRRK2), которые вызывают и / или увеличить риск для PD привело к развитию ингибиторов киназы LRRK21,2,3. Они уже вступили клинических испытаний4. Точная функция LRRK2 неясна, но основным прогрессом стало выявление подмножества белков Rab GTPase, включая Rab10, как первые добросовестные физиологические субстраты киназы LRRK25,6,7. Ключевыми проблемами в эпоху болезнеязычной терапии являются биохимические маркеры статуса активации активации LRRK2 и целевое участие ингибиторов киназы LRRK2.

До сих пор основным фармакокинетическим маркером для ингибиторов LRRK2 in vivo был кластер составно фосфорилированных остатков серина LRRK2, в частности, serine 935, которые становятся дефосфорилированными в ответ на различные ингибиторы LRRK28,9. Тем не менее, серин 935 фосфорилирования не коррелирует с внутренней клеточной активности киназы LRRK2, потому что это непосредственно не фосфорилируется LRRK2 и до сих пор фосфорилируется в киназе неактивных LRRK210. Активность киназы LRRK2 хорошо коррелирует с аутофосфорилированием серина 1292, но в практическом плане это не подходит для эндогенной активности киназы LRRK2 путем иммуноблотного анализа экстрактов цельных клеток из-за отсутствия надежных и фосфоспецифических антител для этого сайта10,11.

Мы разработали надежный и простой анализ для количественной оценки LRRK2 киназы пути деятельности в человеческих периферических клеток крови, что меры LRRK2 контролируемых фосфорилирования своего физиологического целевого белка Rab10 на threonine 7311. Периферическая кровь легко доступна с помощью шпинесекции, которая является низким риском и быстрой процедурой, которая вызывает минимальный дискомфорт. Мы фокусируемся на нейтрофилах периферической крови человека, потому что они составляют обильные (37-80% всех белых кровяных клеток) и однородную популяцию клеток, которая выражает относительно высокий уровень lRRK2 и Rab1011. Кроме того, периферийные нейтрофилы крови могут быть изолированы быстро и эффективно, используя иммуномагнитный негативный подход. Для обеспечения того, чтобы последующее наблюдаемое фосфорилирование Rab10 опосредовано LRRK2, каждая партия нейтрофилов инкубируется с или без мощного и селективного ингибитора киназы LRRK2 (мы используем и рекомендуем MLi-2)2,12. Затем следует клеточный лизис в буфере, содержащем ингибитор протеазы diisopropyl фторфосфат (DIFP), который необходим для подавления внутренней активности протеазы серина, которая, как известно, с высоким содержанием нейтрофилов13. Для окончательного анализа по количественному иммуноблоттингу, мы рекомендуем использовать моноклональное антитело кролика MJFF-pRab10, которое специально обнаруживает Rab10 Thr73-фосфоэпитоп и не перекрестно реагирует с другими фосфорилированными белками Rab14. Избирательность и специфика этого антитела была подтверждена в моделях переэкспрессии различных белков Rab и A549 Rab10 нокаут омичи клеточной линии14. Таким образом, мы измеряем разницу в фосфорилировании Rab10 в нейтрофильных лизатах, которые лечились с мощным и селективным ингибитором киназы LRRK22. Кроме того, образцы могут быть проанализированы с помощью других методов, таких как количественная масс-спектрометрия.

В заключение, LRRK2 контролируемых Rab10 фосфорилирования является превосходным маркером LRRK2 киназы деятельности LRRK2 фосфорилирования на serine 935 и человека периферической крови нейтрофилов являются ценным ресурсом для ИССЛЕДОВАНИЯ PD в LRRK2. Наш протокол обеспечивает надежный и простой анализ для допроса LRRK2 пути деятельности в периферической крови нейтрофилов и позволяет биохимического стратификации лиц с повышенной активностью LRRK2 киназы15. Важно отметить, что такие люди могут извлечь выгоду из будущего лечения ингибитора киназы LRRK2.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Согласно местному регулированию Великобритании, все манипуляции и пайпетирование человеческой крови проводятся в кабинете биологической безопасности категории 2. Все процедуры проводились в соответствии с местным советом по рассмотрению этики, и все участники дали информированное согласие.

1. Подготовка

  1. Подготовьте 0,1 мл edTA Stock Solution 1, содержащего 100 мМ EDTA в фосфатно-буферном сольне (PBS).
  2. Подготовьте 60 мл EDTA Stock Solution 2, содержащего 1 мМ EDTA в PBS.
  3. Подготовка лисис буфера, содержащего 50 мМ Tris-HCl (pH 7.5), 1% (v/v) Тритон X-100, 1 мМ EGTA, 1 мМ Na3VO4, 50 mM NaF, 10 мМ -глицерофосфат, 5 мМ пирофосфат натрия, 0,27 М сахароза, 0,1% (v/v) - меркаптоэтанол, 1x ингибитор ный диптестовый коктейль, 1 мкг/мЛ микроцизтин-LR и 0,5 мМ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Авторы обычно используют продукт без ЭДТА, но ЭДТА-содержащий препарат ингибитор протеазы также должен работать. Буфер лизиса можно сделать заранее без q-mercaptoethanol, ингибиторы протеазы, microcystin-LR, и DIFP, и храниться при 4 градусах Цельсия до использования. Убедитесь, что ингибиторы протеазы, микроцистин-LR и DIFP добавляются только непосредственно перед использованием.
    ВНИМАНИЕ: DIFP является токсичным и должны быть обработаны с осторожностью в дым капот после местной оценки риска для здоровья и безопасности. DIFP можно добавить в буфер лисиса и использовать немедленно. Кроме того, полный буфер лисиса, содержащий все другие компоненты, включая DIFP, может быть алицитирован и храниться при -80 градусов по Цельсию для последующего использования в течение не менее 4 недель.

2. Нейтрофил изоляция от цельной крови

  1. Соберите 10 мл крови в трубку для сбора крови. Аккуратно перемешайте, перевернув трубки 7'8x.
  2. Перенесите 10 мл крови в коническую трубку 50 мл.
  3. Добавьте в кровь 100 л EDTA Stock Solution 1. Смешайте осторожно.
  4. Добавьте 500 кЛ изоляционных коктейлей (50 л/мл) из комплекта изоляции нейтрофилов(Таблица материалов)к всему образцу крови.
  5. Vortex магнитные бусы из нейтрофилов изоляции комплект для 30 s перед использованием для того, чтобы resuspend очень тонкие магнитные бусы.
  6. Добавьте 500 л магнитных бусинок в образец крови и аккуратно перемешайте, несколько раз инвертируя трубку.
  7. Инкубировать при комнатной температуре (RT) в течение 5 мин.
  8. Заполните трубку до 50 мл с EDTA Stock Solution 2. Смешайте очень мягко pipetting вверх и вниз 2-3x.
  9. Поместите трубку в магнит и снимите крышку, чтобы избежать последующего возбуждения трубки.
  10. Инкубировать в течение 10 минут на RT.
  11. Тщательно pipette обогащенной подвески клетки, которая содержит нейтрофилов в новую 50 мл конической трубки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не прикасайтесь к стороне трубки, которая находится в контакте с магнитом и избежать сбора и возмущения красных кровяных телец в нижней части трубки. Оставьте примерно 10 мл суспензии красных кровяных телец позади в нижней части трубки.
  12. Vortex магнитные бусы для 30 s перед использованием и добавить 0,5 мл магнитных бусин в трубку, содержащую обогащенных нейтрофилов. Смешайте осторожно, инвертируя трубку.
  13. Инкубировать на RT в течение 5 мин.
  14. Поместите трубку в магнит и снимите крышку, чтобы избежать последующего возбуждения.
  15. Инкубировать на RT в течение 5 мин.
  16. Тщательно pipette обогащенной подвески клетки, которая содержит нейтрофилов в новую 50 мл конической трубки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не прикасайтесь к стороне трубки, которая находится в контакте с магнитом. Оставьте около 5 мл подвески в нижней части трубки.
  17. Для обеспечения полного удаления магнитных бусин из клеточной смеси поместите трубку, содержащую обогащенные клетки, в магнит.
  18. Инкубировать в течение 10 минут на RT.
  19. Тщательно pipette обогащенной подвески клетки, которая в настоящее время содержит чистые нейтрофилы в новую 50 мл конической трубки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не прикасайтесь к стороне трубки, которая находится в контакте с магнитом. Оставьте около 5 мл подвески в нижней части трубки.
  20. Смешайте изолированные ячейки с 1 мМ EDTA Stock Solution 2 до конечного объема около 41 мл. Пипетка вверх и вниз, чтобы смешать.
  21. Разделите раствор поровну на две трубки примерно по 20 мл в каждой трубке.
  22. Центрифуга обе трубы на 335 х г в течение 5 мин.
  23. Во время этой центрифугации вынимайте запас ингибитора МЛИ-2 (концентрация 200 мкм/1000х) из морозильной камеры -80 градусов по Цельсию и оставляйте на РТ для последующего использования.
  24. Сразу после шага центрифугации и без агитации труб, слить супернатант, не нарушая нейтрофил гранулы. Resuspend каждой клетки гранулы в 10 мл клеточной культуры средств массовой информации (Таблица материалов) на RT, мягко pipetting клеток вверх и вниз 4x.

3. Ингибитор ингибитора киназы LRRK2 для лечения чистых нейтрофилов

  1. Этикетка одна трубка "DMSO" и другая трубка "MLi-2".
  2. К "DMSO" помечены трубки, добавить 10 зл ИЛ DMSO и аккуратно перемешать, пайпеттинг вверх и вниз 2x с 10 мл пипетки. К "MLi-2" помечены трубки, добавить 10 зл и л из 200 ММ МЛи-2 бульонный раствор (окончательная концентрация 200 нм) и аккуратно перемешать, трубавверхи вверх и вниз 2x с 10 мл пипетки.
  3. Инкубировать образцы в течение 30 минут на RT. Смешайте осторожно инверсии каждые 10 минут во время инкубации.
  4. В инкубационный период удалите 0,5 M DIFP из морозильной камеры -80 градусов и поместите в капот дыма на льду. Удалить 1 мг/мЛ микроцизтин-LR бульонраствора из морозильной камеры -80 градусов и оставить на РТ оттаивать. Возьмите аликот (0,25 мл) из буфера лисиса из морозильной камеры, дайте ему разморозить на RT, а затем поместите его на лед для последующего использования.
  5. Подготовьте 1 мл среды клеточной культуры, содержащей 1 зл ИДСО, и назовите этот буфер повторной блокировки DMSO. Подготовьте 1 мл медиа-носителя RPMI, содержащего 1 кЛ из 200 ММ МЛи-2, и назовите этот буфер повторной подвески MLi-2.
  6. После 30 мин инкубационного периода, центрифуга обе трубы на 335 х г в течение 5 минут.
  7. Тщательно отбросьте супернатант в каждой трубке, не нарушая нейтрофил гранулы.
  8. Для DMSO помечены образца осторожно resuspend гранулы в 1 мл буфера перезагрузки DMSO и для MLi-2 помечены трубки, resuspend гранулы в 1 мл буфера resuspension MLi-2.
  9. Перенесите перекрываемые клеточные гранулы на соответствующие центрифугировые трубки с пометками "DMSO" и "MLi-2" и центрифугу обе трубы на 335 х г в течение 3 мин.
  10. Во время шага центрифугации подготовьте буфер лиза. В дымовый капот тщательно добавляйте 0,25 л раствора DIFP 0,5 М, а также 0,25 л 1 мг/мл микроцистина-LR в буфер излизы 0,25 мл. Смешайте и оставьте на льду до использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте DIFP в буфер лисиса в пределах 15 минут клеточного лиза, потому что DIFP относительно нестабилен в водной растворе.
  11. Сразу после центрифугации тщательно и полностью удалите весь супернатант пипеткой, не нарушая нейтрофильные гранулы, и помещайте трубки на лед.
  12. Немедленно добавьте 100 юаней буфера lysis содержа DIFP и microcystine-LR к каждой пробке. Используя пипетку 100-200 л, resuspend клеточные гранулы труба вверх и вниз около 5-10x.
  13. Вылеждь клетки на льду в течение 10 минут.
  14. Центрифуги трубки на 20000 х г в течение 15 минут при 4 кв КС, чтобы удалить мусор клеток.
  15. Перенесите супернационты «ДМСО» и «МЛи-2», содержащие нейтрофильные лизаты, в новые центрифугиваемые трубки. Отбросьте гранулы мусора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: лизаты нейтрофилов теперь готовы к использованию или могут быть заморожены в жидком азоте и храниться при -80 градусов по Цельсию для будущего анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Наш анализ позволяет проводить допрос активации PD-ассоциированной киназы LRRK2 в нейтрофилах периферической крови человека с фосфорилированием LRRK2 в качестве считывания. Нейтрофилы являются однородной и обильной периферической популяции белых кровяных клеток, которая выражает высокий уровень как LRRK2 и Rab10 белков (Рисунок 1). Единственная другая популяция клеток среди оставшихся периферических моноядерных клеток крови (ПБМК) с большим количеством копий обоих белков являются моноцитами,...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Принудительные клинические, генетические и биохимические данные указывают на важную роль для LRRK2 и, в частности, его функции киназы при болезни Паркинсона7. LRRK2 ингибиторы киназы были разработаны и вступают клинических испытаний2,,4,12. Таким образом, существует необходимость в использовании LRRK2 в качестве биомаркера для целевого взаимодействия, а также терпеливого расслоения. Наш протокол описывает...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим здоровых добровольцев, которые любезно сдали кровь для настоящего исследования. Мы благодарим Фонд Майкла Джей Фокса по исследованию Паркинсона (MJFF) и руководство исследования Fox BioNet (FBN) за их поддержку и вклад в составление письменного протокола и видео. Мы благодарим профессора Александра Цимфрича из Венского университета в Австрии за тестирование нашего протокола и сотрудничество. Мы ценим вклад Пола Дэвиса в проект (генеральный менеджер MRC PPU). Мы также признаем отличную техническую поддержку MRC Protein Фосфорилирование и Ubiquitylation Unit (PPU), а именно химический синтез (Наталья Шпиро для синтеза MLi-2), MRC PPU реагентов и услуг иочистки антител групп (координируется Хилари Маклаухлан и Джеймс Хэсти). Мы благодарим Mhairi Towler и Фрейзера Мердока из Vivomotion за их помощь в создании видео и анимации. Мы благодарим Стива Соаве из 81 фильма за помощь в окончательной доработке. Эстер Саммлер поддерживается шотландским старшим клиническим академическим стипендией и получила финансирование от Великобритании Паркинсона (K-1706).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1 мл Наконечники для пипетокSarstedt70.762или эквивалент
1,5 мл МикропробиркиSarstedt72.690.001или эквивалент
10 мл Наконечники для пипеток Сарштедт86.1254.025 или эквивалент
10 μ L Наконечники для пипетокSarstedt70.113или эквивалентные
15 мл соколиной трубки Cellstar188 271или эквивалент
200 μ L Наконечники для пипетокSarstedt70.760.002или эквивалент
25 мл Наконечники для пипеток Sarstedt86.1685.001или эквивалентная
соколиная трубка 50 мл Cellstar227 261или аналог
BD Vacutainer Hemogard Крышка пластиковая трубка K2-EDTABD BD 367525или аналогичная
центрифуга Beckman Coulter Allegra X-15RBeckmanили аналогичная центрифуга с вращателем плавательного ведра для пробирок сокола объемом 15 мл и 50 мл на скорости 1000-1200 х г
Категория 2 шкаф биологической безопасности.
cOmplete (без ЭДТА) коктейль ингибиторов протеазыRoche11836170001
DIFP (Диизопропилфторфосфат) SigmaD0879Готовьте 0,5М стоковый раствор в изопропаноле с использованием специальных мер предосторожности 
Диметилсульфоксид Sigma6250
Сухой лед или жидкий азот
Дульбекко с фосфатно-солевым буфером ThermoFisher14190094или эквивалентный
магнит Easy 50 EasySep Стволовая клетка18002для хранения 1 x 50 мл конической пробирки
EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit Стволовая клетка19666содержит растворы под названием « Изоляционный коктейль» и « Магнитные шарики RapidSpheres
EGTASigmaE3889
Eppendorf центрифуга 5417REppendorf
Этанол, в пульверизаторе
Этилендиаминтетрауксусная кислота SigmaE6758
Изопропанол льда
(безводный сорт) Сигма278475
лизисный буфер (50 мМ Tris-HCl pH 7,5, 1% (v/v) Triton X-100, 1 мМ EGTA, 1 мМ Na3VO4, 50 мМ NaF, 10 мМ β-глицерофосфат, 5 мМ пирофосфата натрия, 0,27 М сахарозы, 0,1% (v/v) β-меркаптоэтанол, 1x cOmplete (без ЭДТА) коктейль ингибиторов протеазы (Roche), 1 мкм; г/мл Микроцистин-LR, 0,5 мМ диизопропилфторфосфата (ДИФП). альтернативно замороженный буфер для лизиса в аликвотах без Microcystin-LR, DIFP доступен из реагентов MRC-PPU (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/)
Ингибитор Merck LRRK2 II (MLi-2)Merck438194-10MGили эквивалент (мощный и селективный ингибитор LRRK2)
Microcystin-LREnzo Life SciencesALX-350-012-M0011 мг/мл в запасе в ДМСО и хранить при -80 oC.
Na3VO4Aldrich450243
NaFSigmaS7920
Odyssey CLx сканирование Вестерн Блотс система визуализацииOdyssey
Перманентный маркер Средства
индивидуальной защиты
RPMI 1640 Medium ThermoFisher21875034или эквивалент
пирофосфатанатрия SigmaS22
сахарозыSigmaS0389
&бета;-глицерофосфатSigma50020
&бета;-меркаптоэтанолSigmaM3148
<сильный>Рекомендуемые антитела для вестерн-блоттинга
Антитело против RAB10 (фосфо T73) [MJF-R21]abcamab230261
Анти-&альфа;-тубулинCell Signaling Technologies5174использовано при разведении 1:2000 Козье
антимышиное IRDye 680LTLI-COR926-68020использовано при разведении 1:10 000
Козье антимышиное IRDye 800CWLI-COR926-32210использовано при разведении 1:10 000
Козий антикроличий IRDye 800CWLI-COR926-32211используется в разведении 1:10 000
MJFF-total Rab10 антитело мышиполученное nanoTools (nanotools.de)не применимо*использовано при 2 μ г/мл конечной концентрации; * Антитело MJFF-total Rab10, полученное nanoTools (www.nanotools.de) [11], будет коммерциализировано Фондом Майкла Джей Фокса в 2018
Мышиное антитело против LRRK2 C-terminusIncorporated  75-253используется в 1 μ г/мл конечная концентрация
pS935-LRRK2MRC PPU Реагенты и услугиUDD2используются при 1 мкм; г/мл конечной концентрации
, году

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Paisan-Ruiz, C., et al. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease. Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).
  2. Fell, M. J., et al. MLi-2, a Potent, Selective, and Centrally Active Compound for Exploring the Therapeutic Potential and Safety of LRRK2 Kinase Inhibition. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355 (3), 397-409 (2015).
  3. Zimprich, A., et al. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).
  4. Sardi, S. P., Cedarbaum, J. M., Brundin, P. Targeted Therapies for Parkinson's Disease: From Genetics to the Clinic. Journal of Movement Disorders. 33 (5), 684-696 (2018).
  5. Steger, M., et al. Phosphoproteomics reveals that Parkinson's disease kinase LRRK2 regulates a subset of Rab GTPases. Elife. 5, (2016).
  6. Ito, G., et al. Phos-tag analysis of Rab10 phosphorylation by LRRK2: a powerful assay for assessing kinase function and inhibitors. Biochemical Journal. 473 (17), 2671-2685 (2016).
  7. Alessi, D. R., SammLer, E. LRRK2 kinase in Parkinson's disease. Science. 360 (6384), 36-37 (2018).
  8. Yue, M., et al. Progressive dopaminergic alterations and mitochondrial abnormalities in LRRK2 G2019S knock-in mice. Neurobiology of Disease. 78, 172-195 (2015).
  9. Doggett, E. A., Zhao, J., Mork, C. N., Hu, D., Nichols, R. J. Phosphorylation of LRRK2 serines 955 and 973 is disrupted by Parkinson's disease mutations and LRRK2 pharmacological inhibition. Journal of Neurochemistry. 120 (1), 37-45 (2012).
  10. Sheng, Z., et al. Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations. Science Translational Medicine. 4 (164), (2012).
  11. Fan, Y., et al. Interrogating Parkinson's disease LRRK2 kinase pathway activity by assessing Rab10 phosphorylation in human neutrophils. Biochemical Journal. 475 (1), 23-44 (2018).
  12. Scott, J. D., et al. Discovery of a 3-(4-Pyrimidinyl) Indazole (MLi-2), an Orally Available and Selective Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Inhibitor that Reduces Brain Kinase Activity. Journal of Medicinal Chemistry. 60 (7), 2983-2992 (2017).
  13. Pham, C. T. Neutrophil serine proteases: specific regulators of inflammation. Nature Reviews Immunology. 6 (7), 541-550 (2006).
  14. Lis, P., et al. Development of phospho-specific Rab protein antibodies to monitor in vivo activity of the LRRK2 Parkinson's disease kinase. Biochemical Journal. 475 (1), 1-22 (2018).
  15. Mir, R., et al. The Parkinson's disease VPS35[D620N] mutation enhances LRRK2-mediated Rab protein phosphorylation in mouse and human. Biochemical Journal. 475 (11), 1861-1883 (2018).
  16. Rieckmann, J. C., et al. Social network architecture of human immune cells unveiled by quantitative proteomics. Nature Immunology. 18 (5), 583-593 (2017).
  17. Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
  18. Bain, B., Dean, A., Broom, G. The estimation of the lymphocyte percentage by the Coulter Counter Model S Plus III. Clinical & Laboratory Haematology. 6 (3), 273-285 (1984).
  19. Tomazella, G. G., et al. Proteomic analysis of total cellular proteins of human neutrophils. Proteome Science. 7, 32(2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

DIFPMLi 2Rab10 Thr73

Похожие статьи