Методическая статья

Использование Microarrays для допроса микроenvironmentale влияние на клеточные фенотипы при раке

DOI:

10.3791/58957

⸱

21 мая 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Knight Cancer Institute, Oregon Health and Science University, 2Quantitative Imaging Systems LLC

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цель метода, представленного здесь, состоит в том, чтобы показать, как микроокружение microarrays (MEMA) могут быть изготовлены и использованы для допроса воздействия тысяч простых комбинаторных микросред на фенотип культивированных клеток.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Понимание влияния микроокружения на фенотип клеток является сложной проблемой из-за сложной смеси как растворимых факторов роста, так и матричных белков в микроокружении in vivo. Кроме того, легкодоступные реагенты для моделирования микросред в пробирке обычно используют сложные смеси белков, которые не полностью определены и страдают от пакетной к пакетной изменчивости. Платформа микроокружения microarray (MEMA) позволяет оценить тысячи простых комбинаций белков микросреды для их воздействия на клеточные фенотипы в одном анализе. MEMAs готовятся в колодцах, что позволяет добавление отдельных лигандов отделять скважины, содержащие массивные внеклеточные матричные белки (ECM). Сочетание растворимого лиганда с каждым печатным ECM образует уникальное сочетание. Типичный анализ MEMA содержит более 2500 уникальных комбинаторных микросред, что клетки подвергаются в одном анализе. В качестве тестового случая, линия клеток рака молочной железы MCF7 была покрыта на платформе MEMA. Анализ этого анализа выявил факторы, которые как усиливают и препятствуют росту и распространению этих клеток. Платформа MEMA является очень гибкой и может быть расширена для использования с другими биологическими вопросами, помимо исследований рака.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Культирование раковых клеток линий на пластике в двумерных (2D) монослой остается одним из основных рабочих лошадок для исследователей рака. Тем не менее, микросреда все больше признается за его способность влиять на клеточные фенотипы. При раке, микроокружение опухоли, как известно, влияет на несколько клеточного поведения, в том числе рост, выживание, вторжение, и ответ на терапию1,2. Традиционные монослойные клеточные культуры, как правило, не имеют влияния микроэкологии, что привело к разработке более сложных трехмерных (3D) анализов для выращивания клеток, в ключая коммерчески доступные очищенные экстракты мембраны подвала. Тем не менее, эти очищенные матрицы, как правило, сложны в использовании и страдают от технических проблем, таких как вариабельность пакетов3 и сложные композиции3. В результате, это может быть трудно назначить функцию конкретных белков, которые могут влиять на клеточные фенотипы3.

Для устранения этих ограничений мы разработали технологию микроокружения microarray (MEMA), которая сводит микроокружение к простым сочетаниям внеклеточной матрицы (ECM) и растворимых белков фактора роста4,5 . Платформа MEMA позволяет выявлять доминирующие микроэкологические факторы, влияющие на поведение клеток. Используя формат массива, тысячи комбинаций факторов микросреды могут быть рассмотрены в одном эксперименте. MEMA описал здесь допрашивает 2500 различных уникальных условий микросреды. Белки ECM, напечатанные в хорошо пластины образуют рост колодки, на которых клетки могут быть культивированы. Растворимые лиганды добавляются в отдельные скважины, создавая уникальные комбинаторные микросреды (ECM и ligand) на каждом различном месте, к которому подвергаются клетки. Клетки культивируются в течение нескольких дней, затем фиксируются, окрашиваются и образуются для оценки клеточных фенотипов в результате воздействия этих специфических комбинаций микросреды. Поскольку микросреда представляет собой простые комбинации, легко определить белки, которые управляют основными фенотипическими изменениями в клетках. MEMAs были успешно использованы для выявления факторов, которые влияют на несколько клеточных фенотипов, в том числе те, которые управляют решениями судьбы клеток и ответ на терапию4,5,6,7. Эти ответы могут быть проверены в простых 2D-экспериментов, а затем могут быть оценены в условиях, которые более полно резюмировать сложность микросреды опухоли. Платформа MEMA хорошо адаптируется к различным типам клеток и конечным точкам, при условии, что имеются хорошие фенотипические биомаркеры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Обзор всего процесса MEMA, включая расчетное время, изложен на диаграмме потока, показанной на рисунке 1. В этом протоколе подробно описано изготовление MEMA в 8-колодцах. Протокол может быть адаптирован для других пластин или слайдов.

1. Подготовка белков, разбавитель, и окрашивания буферов

  1. Равновесие флаконов ЭКМ, лигандов и цитокинов к комнатной температуре (RT) и краткоцентрике. Добавьте соответствующий объем соответствующего буфера RT, указанного в листе данных о продукте. Следуйте рекомендациям производителя в расчете на концентрацию запасов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Полный список лигандов и ЭКМ с их запасами и конечными концентрациями приведен в таблице 1 и таблице2. Оба лиганда и ЭКМ, как правило, используются при самой высокой концентрации диапазона, рекомендованных производителем, что вызывает биологический эффект в стандартных 2-дневный анализ культуры. Ручка белки мягко и в биобезопасности шкафы под ламинарный поток, чтобы избежать загрязнения.
  2. Инкубировать флаконы с нежным раскачиванием на RT за 1 ч. Не вихревые белки, так как это может привести к их денатурации.
  3. Белки Aliquot для долгосрочного хранения так, что все aliquots одноразового использования только для того чтобы во избежание деградация с повторными циклами замораживания/оттепели. Храните лиофилизированные белки при -80 градусах по Цельсию (если не указано иное) до необходимости. Позаботьтесь о сборе всех метаданных для будущей ссылки, таких как: (i) название белка, (ii) дата подготовлена, (iii) лот/номер партии, (iv) поставщик, (v) номер каталога, (vi) концентрация, (vii) объем, и (viii) подготовителя.
  4. Приготовьте разбавительный буфер, содержащий 20% (v/v) глицерол, 10 мМ EDTA, 200 мМ Tris-HCl, pH 7.2, и фильтр стерилизовать. Держите этот буфер стерильным и храните на RT.
  5. Подготовка окрашивания буфера, содержащего 2% (w/v) BSA, 1 мМ MgCl2, и 0.02% NaN3 в фосфат-буферных солив (PBS). Фильтр и хранить при 4 градусах По Цельсию.

2. Подготовка ECM Исходная плита

  1. Удалите алицитные запасы белков ECM для печати и оттаивания на льду. Запись всех номеров лотов для отслеживания метаданных.
  2. Флик трубки оттаяли белков осторожно, чтобы обеспечить надлежащее повторное приостановление и спина вниз в центрифуге.
  3. Сделать ECM печати смесей (EPMs) и флуоресцентные фидуциальное для использования жидким роботом обработки, который создаст рандомизированных 384-хорошо источник пластин.
    ПРИМЕЧАНИЕ:     384-хорошо источник пластин ы будет использоваться сенсорным контактным массивом принтера для создания печатных массивов в 8 хорошо пластин.
    1. Этикетка 1,5 мл микроцентрифуговых труб для каждого EPM и фидуциальной.
    2. Подготовьте каждый EPM, объединив 125 л разбавительного буфера (см. шаг 1.4) с соответствующим объемом eCM запаса и довести смесь до общего объема 250 Зл с PBS. Окончательные концентрации в каждой трубке EPM будут 1x eCM протеин, 5 mM EDTA, 10% glycerol, и 100 mM Tris.
    3. Подготовьте флуоресцентный фидуциал, растворив его в соответствующем буфере, указанном производителем, и перенесите 250 л на маркированную фидуциальную трубку.

3. Создание исходной плиты с использованием жидкого обработчика

  1. Дизайн 384-луп овойте, который рандомизирует позиции ECM и оптимизируется для используемой головки контактного кода принтера массива. Дизайн размещения фидуциальных так, что он будет напечатан в строке 1, столбец 1 положение каждого хорошо, чтобы помочь в ориентации массива.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения надежных данных используется в общей сложности 14–15 репликаций каждого ECM. Включите дополнительные репликации коллагена или другого ECM, который дает надежное вложение для оценки единообразия связывания. Макет, возможно, потребуется использовать несколько 384-колодец пластин в зависимости от количества ECMs интерес.
  2. Передача EPM трубки жидких обработчик, сохраняя трубки на 4 кВ либо с охлажденный трубки стойки или с помощью жидкой обработки робота, расположенного в холодной комнате.
  3. Используя программное обеспечение обработчика жидкости, запустите программу для переноса 15 qL каждого EPM и фидуциальных к заранее назначенным скважинам в пределах 384-хорошей пластины источника (ы).
  4. Pipet PBS в любые неиспользованные скважины для повышения влажности и защиты от высыхания во время процесса печати.
    ПРИМЕЧАНИЕ: См Рисунок 2 на примере 384-хорошо набор пластины источника, который оптимизирован для 4 х 7 контактный головка и включает в себя коллаген i блок и PBS.
  5. Печать пластины (ы) и держать при 4 градусах По Цельсию до готовности к печати.

4. Печать MEMAs с использованием робота-печати array

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая часть протокола конкретно описывает подготовку и использование MEMA для исследования влияния различных белков микросреды на рост и распространение клеток MCF7. Тем не менее, протокол может быть легко адаптирован для использования различных лигандов, ECMs и клеток для изучения других клеточных линий и конечных точек интереса.

  1. Использование сенсорного принтера, печать EPMs и фидуциальных пятен в 8 хорошо пластин. Печать нескольких репликаций каждого состояния ECM для обеспечения воспроизводимости.
    ПРИМЕЧАНИЕ:     Другие форматы пластин или слайды могут быть использованы для печати, но оптимизация буфера может потребоваться для достижения оптимального образования точек.
    1. Печать ECMs для MEMA с использованием 350 мкм диаметром булавки расположены в 4 х 7 печати головы конфигурации. Печать массивов в 8-ну колодцев, как 20 столбцов на 35 строк, в общей сложности 700 пятен. Большие массивы возможны в этих пластинах, но поставляются с компромиссом увеличенных эффектов края как в связывании клеток и окрашивания.
  2. После печати храните тарелки в обезвраживаемом месте в течение как минимум 3 дней до использования.

5. Создание лигандских лечебных пластин

  1. Дизайн 96-ну хорошо планировки пластины в том числе лиганды интерес. Чтобы облегчить обработку многих пластин MEMA сразу, спроектируйте эту пластину с интервалом, что позволяет использовать многоканальный трубчатый с 4 расставленными наконечниками для передачи жидкостей между скважинами 8-хорошо MEMAs и 96-хорошей пластиной.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используется полный набор лигандов, перечисленных в таблице 2.
  2. Оттепель лиганды на льду. Кратко Флик и спина вниз каждой трубки.
  3. Разбавлять лиганды до 200-х рабочих запасов с помощью рекомендованный буфер производителя (обычно PBS).
  4. Пипер 10 л каждого 200-х лиганда в соответствующую скважину в пределах 96-колодца пластины.
  5. Печать и хранить тарелки при -20 градусах Цельсия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сделать лиганд лечения пластин в партиях, захватив все метаданные для анализа вниз по течению.

6. Культивирование ячеек на МЕМА

  1. Блок MEMAs в течение 20 минут с 2 мл на скважину не-загрязнения блокирующий буфер, содержащий 1% незагрязняющий блокирующий агент(Таблица материалов) в двойной дистиллированной воде (ddH2O).
  2. Аспир блокирующий буфер и тройной промывки скважин с помощью PBS. Для предотвращения высыхания, оставьте окончательный объем PBS в скважинах до готовности к клеточному покрытию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это чрезвычайно полезно иметь два скамейки работников для клеточной культуры шаги на MEMAs. Один работник скамейки может выполнять шаги аспирации, в то время как второй выполняет дополнительные шаги. Рекомендуется использовать 1 мл многоканального пайпета с наконечниками, расположенными в соответствии с 8-хорошо пластины для pipetting и Y-сплиттер с двумя пастерпицы, чтобы аспирировать несколько скважин одновременно.
  3. Семена 2 х 105 клеток MCF7 на скважину в 2 мл модифицированной среды Орла Dulbecco (DMEM), содержащей 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед полным экспериментом MEMA, выполнить эксперимент титрования клеток для оптимизации числа клеток, таким образом, что пятна MEMA имеют высокие номера клеток (но не конфлеятор) в конце желаемой экспериментальной продолжительности.
  4. После 2–18 ч слякоть, аспирируйте среднюю и заменяйте 2 мл среды с пониженным ростом (DMEM с 0,1% FBS).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Снижение сыворотки (например, 0,1% FBS) или фактор роста истощенных условиях могут быть использованы в это время для изоляции стимулирующего воздействия конкретных лигандов.
  5. Оттепель лигандовой лечебной пластины на льду. Центрифуга разморожена по 200 х г в течение 1 мин.
  6. Перенесите 200 л среды от каждого колодца в культурной тарелке к соответствующему колодцу в лечебной пластине. Pipet вверх и вниз, чтобы смешать объем лиганда со средним и передать эту смесь обратно в соответствующий хорошо в пластине MEMA.
  7. Слегка раскачивайтесь вручную и возвращайте пластины MEMA в инкубатор. Культура на протяжении всего эксперимента при наличии комбинации лиганд/Экм при 37 градусах Цельсия и 5% CO2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Типичный эксперимент MEMA длится 72 ч; более длительные эксперименты могут потребовать замены средней и повторной обработки лигандой.
  8. Пульс овсяные скважины MEMA при 71 ч со 100х 5-этинил-2'-деоксюридин (EdU) для окончательной концентрации 10 мкм. Инкубируйтев экспериментальных условиях с EdU для 1 ч при 37 C и 5% CO 2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Другие живые клетки лечения также могут быть использованы в это время.

7. Фиксация и окрашивание МЕМА

  1. После 72 ч и любых живых клеточных процедур, аспирных колодцев. Исправить MEMAs в 2 мл на скважину 2% параформальдегида (PFA) в течение 15 минут на RT.
  2. Аспир ПФА. Пермяки с 2 мл на скважину 0,1% неионического сурфактанта в течение 15 мин.
  3. Аспирируй неионический сурфактант и мыть с 2 мл на скважину PBS. Аспирируй PBS. Мытье с 2 мл PBS с 0,05% полисорбат 20 (PBS-T).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поверхность MEMA гидрофобна, и отказ мыть с PBS-T до инкубации пятна и антитела приведет к образованию пустот в скважинах во время инкубационных шагов и приведет к окрашиванию артефактов.
  4. Аспират PBS-T. Добавьте реагенты реакции обнаружения EdU. Инкубировать в течение 1 ч на RT, качаясь и защищены от света. После 1 ч инкубации, утолить реакцию с предусмотренным коммерческим буфером утоления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: EdU обнаружения и окрашивания / антитела шаги могут быть выполнены в 1,5 мл на хорошо, чтобы уменьшить стоимость.
  5. Призадыхать утолить буфер и промыть PBS-T до инкубации с пятнами или антителами.
  6. Инкубировать MEMA скважины с антителами против гистона H3K9me3 (1:1,000) и фибрилларин (1:400) в окрашивание буфера, содержащего 2% (w/v) бычьей сыворотки альбумина (BSA), 1 мМ MgCl2 и 0.02% NaN3 ночь на 4 кв.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните титрования антител, чтобы определить оптимальные концентрации до их использования на полном наборе MEMA.
  7. После первичного антитела или пятно инкубации, мыть колодцы 2x с PBS и один раз с PBS-T.
  8. Добавьте вторичные антитела (осел анти-мышь IgG и осел анти-кролик IgG, как 1:300) и 0,5 мкг /мл 4 "6-диамидино-2-фенилинзол (DAPI). Инкубировать 1 ч на RT в темноте.
  9. Вымойте скважины 2x с 2 мл на скважину PBS, оставляя их в финале 2 мл PBS.
  10. Приступить к визуализации или хранить окрашенные MEMAs для последующего изображения в PBS при 4 градусах по Цельсию, защищенных от света.

8. Изображение МЕМА

  1. Изображение MEMA на автоматизированной системе визуализации с соответствующими каналами флуоресцентного обнаружения.
  2. Вывод данных изображений в систему управления изображениями. Сегментные клетки и вычислить уровни интенсивности с помощью CellProfiler8.

9. Анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ данных состоит из нормализации, коррекции изменений и обобщения необработанных данных CellProfiler. В этом случае R-среда с пользовательским кодом используется для выполнения всех шагов. Тем не менее, любая статистическая среда или программа программного обеспечения могут быть использованы для выполнения эквивалентных действий. Пример пользовательского кода с открытым исходным кодом для среды R для анализа доступен по адресу: https://www.synapse.org/#!Synapse:syn2862345/wiki/72486.

  1. Предварительное обработка и нормализация сегментированных данных изображений.
  2. Определите количество точечных клеток с помощью окрашенных ядер DAPI.
  3. Авто-ворота EdU интенсивность для обозначения клеток, как EdU. Измерьте пролиферацию, используя пропорцию клеток EdUв каждом месте.
  4. Медианные суммируют цитоплазматические пятна и измерения ядерной морфологии на спот-уровне.
  5. Выполните удаление нежелательных изменений (RUV) нормализации на данных для улучшения качества данных9.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот подход применяется к каждой интенсивности и морфологии сигнал атебов независимо как матрица с массивами, использующими строки и пятна, как столбцы, как описано ранее9.
  6. Применить нормализацию двухвариатной лэсск к нормализованным остаткам RUV, используя строку массива и столбец массива в качестве независимых переменных для коррекции пространственных или связанных с интенсивностью эффектов.
  7. Как только нормализация завершена, медиана суммирует репликации для каждого состояния микросреды для отчетности и дальнейшего анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для упрощения воздействия микроenvironmentalов на рост и пролиферацию клеток и выявления условий, способствующих или препятствуя росту и пролиферации клеток, линия клеток рака молочной железы MCF7 была посеяна на комплекте из восьми 8-ну хорошо MEMAs, как описано в протоколе. Этот анализ подвергал клетки 48 различным ЭКМ и 57 различным лигандам, в общей сложности 2736 комбинаторных микроэкологических условий. После 71 ч в культуре, клетки были импульсивные с EdU, фиксированные, permeablized, и окрашенные DAPI, реакция на...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Важность "мерности" и контекста был мотивирующее фактор в развитии систем культуры in vitro в качестве инструментов в характеристике раковых клеток через их взаимодействие с микросредой11, и способность in vitro культурные системы для имитации среды in vivo является движущей силой стремления улучшить эти культурные системы. In vitro системы, однако, остаются важными инструментами исследования рака именно из-за их способности перегонять сложные in vivo ситуации вплоть до упрощенной модели

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана NIH Общий фонд Библиотека сетевых сотовых подписей (LINCS) грант HG008100 (J.W.G., L.M.H., и J.E.K.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Aushon 2470Aushon BioSystemsArrayer роботизированная система используется в протоколе
Nikon HCANikonHigh Content Imaging разработана на основе инвертированного микроскопа Nikon Eclipse Ti
BioTek Precision XS Liquid Handler BioTekиспользуется в протоколе
Тризма гидрохлоридный буферный растворSigmaT2069
ЭДТАИнвитроген15575-038
глицеринСигмаG5516
Тритон X100СигмаT9284
Твин 20СигмаP7949
Коллифор P338BASF50424591
384-луночный микрочип планшет, цилиндрическая лункаThermo Fisherab1055
Nunc 8 скважинная чашкаThermo Fisher267062
Параформальдегид 16% растворЭлектронная микроскопияНаука 15710
BSAFisherBP-1600
Азид натрияSigmaS2002
Клеточная маскаМолекулярные зондыH32713
Click-iTEdU Alexa FluorМолекулярные зондыC10357
DAPIPromo KinePK-CA70740043
ALCAMR & D Systems656-ALECM
Cadherin-20 (CDH20)R & D Systems5604-CAECM
Cadherin-6 (CDH6)R & D Systems2715-CAECM
Cadherin-8 (CDH8)R & D Systems188-C8ECM
CD44R & D Systems3660-CDЭБУ
CEACAM6R & D Systems3934-CMECM
Коллаген ICultrex3442-050-01
ECM Коллаген типа IIMilliporeCC052ECM
Коллаген типа IIIMilliporeCC054ECM
Коллаген типа IVSigmaC5533
ECM Коллаген типа VMilliporeCC077ECM
COL23A1R & D Systems4165-CLECM
Десмоглеин 2R & D Systems947-DMECM
E-cadherin (CDH1)R & D Systems648-ECECM
ECM1R & D Systems3937-ECECM
ФибронектинR & D Systems1918-FNECM
GAP43Abcamab114188ECM
HyA-500KR & D SystemsGLR002ECM
HyA-50KR & D SystemsGLR001ECM
ICAM-1R & D Systems720-ICECM
LamininSigmaL6274ECM
Laminin-5Abcamab42326ECM
LumicanR & D Systems2846-LUECM
M-Cad (CDH15)R & D Systems4096-MCECM
Nidogen-1R & D Systems2570-NDECM
Остеоадхерин/OSADR & D Systems2884-ADECM
Остеопонтин (SPP)R & D Systems1433-OPECM
P-Cadherin (CDH3)R & D Systems861-PCECM
PECAM1R & D SystemsADP6
ECM Tenascin CR & D Systems3358-TCECM
VCAM1R & D SystemsADP5ECM
VitronectinR & D Systems2308-VNECM
BiglycanR & D Systems2667-CMECM
DecorinR & D Systems143-DEECM
PeriostinR & D Systems3548-F2ECM
SPARC/остеонектинR & D Systems941-SPECM
Тромбоспондин-1/2R & D Systems3074-THECM
BrevicanR & D Systems4009-BCECM
ElastinBioMatrix5052ECM
фибриллинLynn Sakai Lab OHSUN/AECM
ANGPT2RnD_Systems_Own623-AN-025Лиганд
IL1BRnD_Systems_Own201-LB-005Лиганд
CXCL8RnD_Systems_Own208-IL-010Лиганд
IGF1RnD_Systems_Own291-G1-200Лиганд
TNFRSF11BRnD_Systems_Own185-OSЛиганд
BMP6RnD_Systems_Own507-BP-020Лиганд
FLT3LGRnD_Systems_Own308-FK-005Лиганд
CXCL1RnD_Systems_Own275-GR-010Лиганд
DLL4RnD_Systems_Own1506-D4-050лиганд
HGFRnD_Systems_Own294-HGN-005Лиганд
Wnt5aRnD_Systems_Own645-WN-010Лиганд
CTGFLife_Technologies_OwnPHG0286Лиганд
LEPRnD_Systems_Own398-LP-01MЛиганд
FGF2Sigma_Aldrich_OwnSRP4037-50UGЛиганд
FGF6RnD_Systems_Own238-F6Лиганд
IL7RnD_Systems_Own207-IL-005Лиганд
TGFB1RnD_Systems_Own246-LP-025Лиганд
PDGFBRnD_Systems_Own220-BB-010Лиганд
WNT10AGenemed_Own90009Лиганд
PTNRnD_Systems_Own252-PL-050Лиганд
BMP3RnD_Systems_Own113-BP-100Лиганд
BMP4RnD_Systems_Own314-BP-010Лиганд
TNFSF11RnD_Systems_Own390-TN-010Лиганд
CSF2RnD_Systems_Own215-GM-010Лиганд
BMP5RnD_Systems_Own615-BMC-020Лиганд
DLL1RnD_Systems_Own1818-DL-050Лиганд
NRG1RnD_Systems_Own296-HR-050Лиганд
KNG1RnD_Systems_Own1569-PI-010Лиганд
GPNMBRnD_Systems_Own2550-AC-050Лиганд
CXCL12RnD_Systems_Own350-NS-010Лиганд
IL15RnD_Systems_Own247-ILB-005Лиганд
TNFRnD_ Systems_Own210-TA-020Лиганд
IGFBP3RnD_Systems_Own675-B3-025Лиганд
WNT3ARnD_Systems_Own5036-WNP-010Лиганд
PDGFABRnD_Systems_Own222-ABЛиганд
AREGRnD_Systems_Own262-AR-100Лиганд
JAG1RnD_Systems_Own1277-JG-050Лиганд
BMP7RnD_Systems_Own354-BP-010Лиганд
TGFB2RnD_Systems_Own302-B2-010Лиганд
VEGFARnD_Systems_Own293-VE-010Лиганд
IL6RnD_Systems_Own206-IL-010Лиганд
CXCL12RnD_Systems_Own351-FS-010Лиганд
NRG1RnD_Systems_Own378-SMЛиганд
IGFBP2RnD_Systems_Own674-B2-025Лиганд
SHHRnD_Systems_Own1314-SH-025Лиганд
FASLGRnD_Systems_Own126-FL-010Лиганд
Система

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
  2. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
  3. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
  4. LaBarge, M. A., et al. Human mammary progenitor cell fate decisions are products of interactions with combinatorial microenvironments. Integrative Biology (Cambridge). 1 (1), 70-79 (2009).
  5. Watson, S. S., et al. Microenvironment-Mediated Mechanisms of Resistance to HER2 Inhibitors Differ between HER2+ Breast Cancer Subtypes. Cell Systems. 6 (3), 329-342 (2018).
  6. Ranga, A., et al. 3D niche microarrays for systems-level analyses of cell fate. Nature Communications. 5, 4324(2014).
  7. Malta, D. F. B., et al. Extracellular matrix microarrays to study inductive signaling for endoderm specification. Acta Biomater. 34, 30-40 (2016).
  8. Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
  9. Gagnon-Bartsch, J. A., Jacob, L., Speed, T. P. Removing Unwanted Variation from High Dimensional Data with Negative Controls. University of California, Berkeley, Department of Statistics, University of California, Berkeley. , Report No. 820 (2013).
  10. Allan, C., et al. OMERO: flexible, model-driven data management for experimental biology. Nature Methods. 9 (3), 245-253 (2012).
  11. Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
  12. Bissell, M. J. The differentiated state of normal and malignant cells or how to define a "normal" cell in culture. International Review of Cytology. 70, 27-100 (1981).
  13. Serban, M. A., Prestwich, G. D. Modular extracellular matrices: solutions for the puzzle. Methods. 45 (1), 93-98 (2008).
  14. Kaylan, K. B., et al. Mapping lung tumor cell drug responses as a function of matrix context and genotype using cell microarrays. Integrative Biology (Cambridge). 8 (12), 1221-1231 (2016).
  15. Lin, C. H., Jokela, T., Gray, J., LaBarge, M. A. Combinatorial Microenvironments Impose a Continuum of Cellular Responses to a Single Pathway-Targeted Anti-cancer Compound. Cell Reports. 21 (2), 533-545 (2017).
  16. Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Microenvironment MicroarrayExtracellular Matrix ProteinsLigand TreatmentCell Proliferation AssayFluorescent ImagingCellProfiler AnalysisEdU IncorporationBreast Cancer CellsMicroenvironmental FactorsAutomated Imaging

Похожие статьи