Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

На основе пластины цитотоксичность анализ для оценки крысы плацентарной естественной клетки убийцы Цитолитические функции

5.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58961

⸱

2 июня 2019 г.

 ,  ,  , 
1Department of Emergency Medicine, University of Mississippi Medical Center, 2Department of Experimental Therapeutics and Pharmacology, University of Mississippi Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы предоставляем подробную методологию, чтобы изолировать и оценить цитотоксическую функцию естественных киллеров из плаценты с помощью цветометрического анализа пластины. Снижение маточных перфузионного давления крысы модель плацентарного, был выбран, чтобы продемонстрировать антитело-опосредованной изоляции и оценки цитотоксической функции естественных клеток убийцы.

Аннотация

Хорошо известно, что децидвойные естественные клетки убийцы (НК) играют решающую роль в установлении и поддержании нормальной беременности. Недавние исследования продемонстрировали измененную популяцию циркулирующих и децидуальных НК-клеток у женщин, страдающих от неблагоприятных осложнений беременности, таких как рецидивирующий выкидыш и преэклампсия. Исследования, проведенные нашей группой, показали, что гипертония при беременности связана с увеличением популяции активированных НК-клеток в плаценте на основе экспрессии маркеров поверхностной активации. Данная рукопись представляет собой подробный протокол для оценки цитотоксической функции НК-клеток, изолированных от плаценты в виде животной модели хирургически индуцированной плацентарной иоэклампсии. Ниже описаны следующие этапы: Генерация одноклеточной суспензии, НК-клеточная изоляция, стимуляция в естественных условиях, эффектор: Целевая клеточная сокультура и цитотоксичность.

Введение

Преэклампсия-гипертензивное расстройство беременности, характеризующееся ограничением роста плода, повреждением конечного органа и хронической иммунной активацией. Хроническая иммунная активация у женщин с преэклампсией приводит к увеличению циркулирующих и плацентарных воспалительных цитокинов, дисбаланс в CD4+ т-клеток населения, и увеличение популяции активированных естественных киллеров (НК) клеток1. Исследования, недавно опубликованные нашей лабораторией, демонстрируют роль НК-клеток в возникновении некоторых патофизиологии, ассоциируемых с преэклампсией в «уменьшении давления маточных перфузии» (Рапп), модели преэклампсии. Использование потока цитометрии для измерения поверхностного выражения маркеров активации на НК-клеток, увеличение популяции активированных НК-клеток в обращении и плаценты Рапп крыс по сравнению с нормальным беременных (НП) крысы наблюдались2.

Для подтверждения наблюдений за потоком цитометрии были выполнены функциональные исследования для оценки цитотоксической активности НК-клеток, выделенных из плаценты НП и крыс РУППП. Существует несколько методов оценки цитотоксической функции цитотоксических CD8+ т-клеток и НК-клеток. Золотым стандартом функционального цитотоксического анализа является анализ высвобождения хрома3. Другие разработанные протоколы, используемые включают поток цитометрия4, изображение цитометрии5, calcein релиз6, и совсем недавно биолюминесценции7. Это видео будет предоставлять подробный протокол об использовании хорошо наладившейся лактата дегидрогеназы (LDH) релиз анализа для измерения цитотоксической функции НК-клеток с использованием коммерчески доступных LDH цитотоксичность анализа комплекта.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все протоколы были одобрены институциональным Комитетом по уходу и использованию животных в медицинском центре Университета Миссисипи. Уход и обработка животных были в согласии с национальными институтами здоровья руководящие принципы для этичного лечения животных.

1. изоляция клеток лимфоцитов от плаценты

  1. Удалите одну плаценту от крысиной матки (день беременности 19) и поместите в 10 мл ледяной PBS8.
  2. Поместите одну плаценту на фильтр 100 мкм и сядьте в чашку Петри, содержащую 13,5 мл RPMI и 1,5 мл ФПС (общий объем 15 мл). Использование плоской стороне шприц поршень, чтобы подтолкнуть плаценту через фильтр в чашку Петри.
  3. Подготовьте 3 15 mL конические трубы для каждой ткани. Добавьте 3 mL градиент плотности среднего (см. таблицу материалов) к каждой трубке, после этого тщательно наложи 5 мл однородности плаценты в каждую трубку.
  4. Центрифуга на 25 мин при температуре 300 х г при комнатной температуры (RT) без тормозов. Соберите тонкий белый охристым слоем с передачей пипетки.
    Примечание: После центрифугирования, 3 слоя видны, красный RPMI наверху, белый охристые слои в середине, и четкий градиент плотности среднего слоя внизу. Используйте передачу пипетки, чтобы подтянуть белый охристые слой из трубки. Комбинат Баффи слой из всех труб из той же плаценты в 1 трубу.
  5. Добавьте 10 мл RPMI в комбинированные охристые слои. Центрифуга на 10 мин, 300 х г, при температуре 4 °c, и отказаться от супернатант.

2. изоляция естественных клеток убийцы

  1. Ресуспензируем ячейки гранул в 50 мкл ледяной PBS
  2. Добавить биотин-маркировку CD3 антитела к гранулированных клеток в соответствии с протоколом производителя и хорошо перемешать с пипетки. Поместите трубку в трубку ротатора и инкубации 20 мин при температуре 4 ° c.
  3. Добавьте 1 мл RPMI, центрифугу на 10 мин при 400 х г и 4 °c и откажитесь от супернатант.
  4. Ресуспензируем гранулы в 1 мл RPMI и сочетать с 150 мкл магнитных бусин в 1,5 мл трубки микроцентрифуги. Поместите пробирку микроцентрифуги в трубку ротатора и вращайте при инкубации в течение 30 минут при температуре 4 ° c.
    Примечание: В это время вытащите буфер высвобождения и позвольте достичь RT в кабинете биобезопасности.
  5. Поместите трубы в магнит на 1 мин. Соберите супернатант и сохраните населенность CD3-клетки в пробке 15 ml на льдах.
    Примечание: Это CD3- популяция клеток.
  6. Снимите трубку с магнита и добавьте 1 мл RPMI. Смешайте клетки и бисер 5 раз с пипетки.
  7. Повторите шаг 2,5.
  8. Центрифуга CD3- популяции клеток в течение 10 мин при температуре 400 х г и 4 °c и сбросьте supernatant. Ресуспензируем ячейки гранулы в 50 мкл ледяной PBS
  9. Добавить биотин-помечены антитела CD161a к CD3- клеток в соответствии с протоколом производителя и хорошо перемешать. Поместите трубку в трубке ротатора и инкубировать в течение 20 минут при температуре 4 ° c.
  10. Добавьте 1 мл RPMI, центрифугу на 10 мин при 400 х г и 4 °c и откажитесь от супернатант. Ресуспензируем гранулы в 1 мл RPMI и сочетать с 150 мкл магнитных бусин в 1,5 мл трубки микроцентрифуги.
  11. Место трубки микроцентрифуга в трубке ротатора и вращать при инкубации в течение 30 минут при температуре 4 ° c.
  12. Поместите трубки в магнит на 1 мин. Соберите супернатант и выбросите CD3-/Cd161a- клетки.
  13. Снимите трубку с магнита и добавьте 1 мл RPMI. Смешайте клетки и бисер 5 раз с пипетки.
  14. Повторите шаг 2,12.
  15. Удалите трубки микроцентрифуг из магнита и добавьте 1 мл буфера выпуска RT. Место трубки на трубе ротатора и вращать при инкубации в течение 15 минут на RT.
  16. Поместите трубы в магнит на 1 мин. Соберите супернатант в новой 15 мл конической трубки на льду.
    Примечание: Это население НК-клеток.
  17. Снимите трубку с магнита и добавьте 1 мл RT RPMI. Смешайте клетки и бисер 5 раз с пипетки.
  18. Повторите шаг 2,16, поместив супернатант в той же трубе. Хорошо перемешать и взять 20 мкл образец для подсчета клеток
    Примечание: Держите трубку на льду.
  19. Центрифуга CD3-/Cd161a+ ячейки для 10 мин, 400 х г при температуре 4 °c, затем удалите supernatant. Ресуспензируем клетки в RPMI (10% ФБС, 1% пен/стрептококк, 2 нг/мл IL-2) и семян при концентрации 3 х 105 клеток/хорошо в 6-хорошо пластины в 2,5 мл НК активации ячейки Media. Инкубировать клетки для 48 h на 37 °C, 5% CO2 в увлажненный инкубатор.

3. цитотоксичность анализ: извлечение НК-клеток или YAC1 от культуры или прохождения клеток

Примечание: Все шаги должны быть проведены под капотом. Все клеточные трубки должны храниться на льду во все времена.

  1. Используйте стекло серологических пипетки собрать YAC1 клеток и средств массовой информации из колбы, место в 50 ml трубки на льду, и хорошо перемешать. Возьмите 20 мкл для подсчета клеток.
  2. Спин YAC1 клеток в течение 10 минут при 300 х г и 4 °c. Считайте ячейки, пока они вращаются.
  3. Добавить трипсин/ЭДТА к каждому хорошо в НК ячейки 6-хорошо пластины. Нажмите на тарелку и поместите в инкубатор.
  4. После клетки инкубировали с трипсин/ЭДТА для ~ 5 мин при температуре 37 ° c, царапать пластины/фляжка с стерильной пластины скребком. Добавить 1 мл НК ячейки средств массовой информации для каждого хорошо.
  5. Сбор клеток и средств массовой информации с серологических пипетки и собирать в 15 мл трубки центрифуги. Возьмите 20 мкл для подсчета клеток.
  6. Спин НК-клеток в течение 10 мин, 400 х г при температуре 4 °c. Подсчитайте образец ячеек из шага 3,5 во время этого центрифугирования.
    Примечание: Вид культуры пластин под микроскопом, прежде чем выбросить их, чтобы убедиться, есть не больше клеток, привязаны к нижней части скважин. Так как эксперимент использует НК-клетки и YAC1 клетки, обязательно считайте каждый отдельно.
  7. Подсчитывайте клетки и ресуспензируем на концентрациях, определяем при оптимизации испытаний для проверки соответствующего количества цели: коэффициент эффектора. Это будет достигнуто путем повторного приостановления гранулы в соответствующих средствах массовой информации, чтобы сделать следующую ячейку концентрации: YAC1 на 4 х 105 клеток/мл и НК-клеток при 2 х 107 клеток/мл.

4. цитотоксичность анализ: Протокол анализа

  1. Использование круглого дна, культуры лечение 96-хорошо пластины для установки пластины, как это предлагается в таблице 1. В этой таблице показаны экспериментальные элементы управления и 3 комплекта экспериментальных колонн НК. Это может быть расширена в общей сложности 10 НК экспериментальных колонн в 96-хорошо пластины.
  2. Центрифуга Пробирной пластины на 250 x g в течение 4 минут, чтобы быть уверенным, что Эффектор и целевые клетки находятся в контакте. Инкубировать 96-хорошо пластины в течение 5 часов в увлажненный инкубатор камеры при 37 ° c, 5% CO2 для достижения достаточного контакта между целью и эффекторных клеток и лизиза целевой клетки эффекторных клеток.
    Примечание: Протокол может быть приостановлен здесь.
  3. 45 мин до уборки supernatants, добавить 10 мкл 10x лизиса решение целевой ячейки максимальная LDH-релиз скважин (Уэллс 1E, 1E, 1E, и 1E) и поместите пластину обратно в увлажненный камеры.
  4. После завершения инкубации, центрифуга пластины на 250 x g в течение 4 мин. с помощью мультиканально-трубопроводного, передача 50 мкл aliquототы из всех скважин на свежий 96-хорошо плоско-дно Пробирной пластины.
    Примечание: Не прикасайтесь к дну скважин так, чтобы клетки не передавались в свежую пластину пробирки. Не используйте культивируемые пластины, как свежие пластины анализа.
  5. Сделать анализ реагента.
    1. После анализа буфера достигла комнатной температуры, добавить 12 мл пробирного буфера в один субстрат Mix бутылку. Инвертировать и трясти осторожно, пока полностью не растворится. 1 бутылка достаточно для 2 96-хорошо пластин.
      Примечание: Анализ буфера должны быть защищены от света во время оттаивания. Смешайте непосредственно перед использованием.
  6. Добавить 50 мкл пробирного реагента ко всем скважинами в пластине пробирки от шага 4,6. Обложка пластины с фольгой, чтобы защитить его от света и инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре.
    Примечание: Недавно сделанный анализ реагента должен храниться в морозильной камере. Реагент хорошо в течение примерно 8 недель.
  7. Добавьте 50 мкл стоп-решения каждому хорошо. Прочитайте тарелку в течение 1 часа после добавления стоп-решения и запишите всасывающей абсорбту на 490 Нм. Репрезентативные данные отображаются в таблице 2.

5. расчет результатов

  1. Вычислить среднее значение поглощения от культуры средних фоновых скважин и вычитания из всех значений поглощения для экспериментальных, Целевая ячейка спонтанного релиз LDH и Эффэкторных клеток спонтанных скважин LDH релиз.
  2. Расчет средних значений абсорбционной для регулировки громкости для управления скважинами и вычитания из значений поглощения, приобретенных для максимального количества LDH-контроля скважин для целевой ячейки.
  3. Используйте исправленные значения от шагов 5,1 и 5,2 в следующей формуле, чтобы вычислить процент цитотоксичности для каждого эффектора: цель хорошо.
    figure-protocol-1

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Плацентарные НК-клетки, полученные от ПР и РУППА крысы инкубировали в течение 5 ч с целевыми клетками в соответствующих средах в соотношении 50:1 (НК: цель). Абсорбта была записана в 490 Нм, а исходные данные показаны в таблице 2. Рассчитывались средние показатели абсорбцией культуры среднего фона и просчитывались колодцы регулировки громкости. Эти усредненные величины были вычтены из соответствующих скважин, указанных в протоколе производителя, и представлены в таблице 3. Затем исправле...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Существует ряд важных ключевых заметок для рассмотрения для достижения оптимальных результатов. Стерильность используемых клеток очень важна. После сбора плаценты важно, чтобы подготовка и изоляция НК-клеток выполняли в стерильных условиях в кабинете биобезопасности. Кроме того, поскольку все ячейки релиз LDH на клеточных повреждений, следует позаботиться, чтобы получить высокую жизнеспособность НК-клеток после изоляции и во время совместного процесса культуры. Слишком много спонтанного выпуска LDH из НК-клеток часто мож...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Никакие конфликты интересов, финансовые или иные, не объявляются авторами.

Благодарности

Эта работа была поддержана национального института легких и крови Институт национальных институтов здравоохранения в соответствии с грантом R00HL130456, Национальный институт общих медицинских наук национальных институтов здравоохранения под награду P20GM104357, и Миссисипи ИНБРЕ, финансируемых за счет институционального развития премии (идея) из Национального института общих медицинских наук национальных институтов здравоохранения на грант номер P20GM103476. Содержание является исключительно ответственностью авторов и не обязательно представляет официальные взгляды национальных институтов здравоохранения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,5 мл пробирки EppendorfFisher5408129
100 &микро; L ФильтрFisher22363549нейлоновая сетка
15 мл коническая трубкаFisher0553859A
шприц 3 млFisher14823436
50 мл коническая трубкаFisher7203510
6-луночный планшет для клеточной культурыCorning720083
96-луночный планшет для культуры тканейCELLTREAT229190стерильный, Круглое дно
AOPINexcelomCS201065ML
Скребок для клетокFisher8100241
Кальометр Одноразовые счетные камерыNexcelomCHT4-SD100
Целлометр Vision Image ЦитометрNexcelomN/A
Cytotox 96 Набор для анализа нерадиоактивной цитотоксичностиPromegaG1780
Dynabeads Flowcomp Flexi KitInvitrogen11061D
DynaMag-2 МагнитInvitrogen12321D
EDTASigma AldrichEDS-100G
FBSAtlanta BiologicalsS11150H
проточной цитометрииТрубка Corning352008
LymphoprepFisherNC0460539градиент плотности Терпимая; 4 x 250 мл
PBSFisherSH302580110 x 500 мл
пенициллин/стрептомицинGibco15140122
чашки ПетриFisher9720500без подушечки
Очищенная мышь против крыс CD161aBD Biosciences555006
очищенная мышь против крыс CD3BD Biosciences554829
рекомбинантная крыса Ил-2НИР D Systems502-RL
RPMIGibco118751351640 Medium
T25 колбаCorning430639
трипсиномThermoFisher15090046
YAC-1 ячейкаATCCTIB-160

Ссылки

  1. Cornelius, D. C., Cottrell, J., Amaral, L. M., LaMarca, B. Inflammatory Mediators: A causal link to hypertension during pregnancy- Studies in Preeclampsia. British Journal of Pharmacology. , (2018).
  2. Elfarra, J., et al. Natural killer cells mediate pathophysiology in response to reduced uterine perfusion pressure. Clinical Science. 131 (23), 2753-2762 (2017).
  3. Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).
  4. Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. Journal of Immunological Methods. 325 (1-2), 51-66 (2007).
  5. Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry. PLoS One. 10 (10), 0141074(2015).
  6. Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).
  7. Karimi, M. A., et al. Measuring cytotoxicity by bioluminescence imaging outperforms the standard chromium-51 release assay. PLoS One. 9 (2), 89357(2014).
  8. Caporossi, C., Nogueira, P. L., Marques, J. C., Assis, R. M., Aguilar-Nascimento, J. E. Validation of the gastroschisis experimental model and the influence of the mother's diet enriched with glutamine in the fetal morphology. Acta Cirúrgica Brasileira. 29 (3), 158-165 (2014).
  9. Lv, L. H., et al. Functional distinction of rat liver natural killer cells from spleen natural killer cells under normal and acidic conditions in vitro. Hepatobiliary and Pancreatic Diseases International. 11 (3), 285-293 (2012).
  10. Flieger, D., et al. A novel non-radioactive cellular cytotoxicity test based on the differential assessment of living and killed target and effector cells. Journal of Immunological Methods. 180 (1), 1-13 (1995).
  11. Jang, Y. Y., et al. An improved flow cytometry-based natural killer cytotoxicity assay involving calcein AM staining of effector cells. Annals of Clinical Laboratory Science. 42 (1), 42-49 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

NK-клетки плацентыизоляция NK-клетокпроточная цитометриясоотношение эффекторных клеток и мишенейкокультивирование клетоканализ высвобождения ЛДГсепарация с помощью магнитных бусинсреда для активации клетоктаргетные клетки YAC1
На основе пластины цитотоксичность анализ для оценки крысы плацентарной естественной клетки убийцы Цитолитические функции
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.