Здесь мы представляем протокол для Роман разрыв соединения межклеточные связи assay предназначен для высокопроизводительного скрининга разрыв соединения модулирующих химических веществ для обнаружения наркотиков и токсикологические оценки.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Иодид желтый флуоресцентный белок разрыв соединения межклеточные связи Assay
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Разрыв соединения (GJs) являются каналы клеточной мембраны, которые позволяют диффузии молекул меньше 1 кДа между соседними ячейками. Как они физиологических и патологических ролей, существует необходимость высокопроизводительного скрининга (HTS) анализов для выявления GJ модуляторы в наркотиками открытий и токсикологии анализов. Роман йодид желтый флуоресцентный белок разрыв соединения межклеточные связи (I-рекламы ЯФП-GJIC) пробирного удовлетворяет эту потребность. Это на основе ячеек пробирного, включая доноров и акцепторов клетки, которые разработаны для стабильно Экспресс вариант желтый флуоресцентный белок (рекламы ЯФП), чьи флуоресценции чутко закаленном йодида, или SLC26A4, иодид транспортер, соответственно. Когда йодида добавляется к смешанной культуре клеток двух типов, они ввести клеток донора через SLC26A4 транспортер и диффузного в прилегающих акцептора клетки через GJs где они утолить рекламы ЯФП флуоресценции. Рекламы ЯФП флуоресценции измеряется от скважины в кинетическую режиме. GJ деятельность отражает скорость тушения рекламы ЯФП. Assay надежный и быстрый, чтобы использоваться для Хайтс Протокол assay рекламы ЯФП-GJIC с использованием LN215 клеток, клеток глиомы человека, описал.
Введение
Разрыв соединения (GJs) выступать в качестве межклеточного каналы, чтобы разрешить распространение малых молекул < 1 кДа таких питательных веществ, метаболитов и сигнальных молекул между соседними ячейками. Соединительной элементы включают hemichannel или Коннексоны в каждой ячейке, и каждый Коннексоны представляет собой шесть connexins (Cxs)1. GJs и Cxs были использованы в токсикологии анализов канцерогенных веществ таких как полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), которые являются GJ ингибиторы2,3,4. Нарушена GJIC был связан с nongenotoxic ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. поколение lentiviruses, выражая рекламы ЯФПQL и SLC26A4
- Растут HEK293T человеческих эмбриональных почечных клеток до 80% confluency на 100 мм культуры пластин. Дульбекко изменение орла среднего (DMEM) дополнены плода бычьим сывороточным 10%, 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина 100 мкг/мл является питательной среды, используемые протоколом для поддержания HEK293T и другие клетки, указанных ниже.
- 6-ну культуры пластины пальто, добавив 2 мл 0,005% раствора стерильную поли L-лизин (PLL) для каждой скважины на 10 мин аспирационная PLL решения и ополосните поверхность два раза с 2 мл стерильной воды.
- Мойка HEK293T клетки с 10 мл....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Двадцать девять 96-луночных культуры пластины были использованы для экрана 2,320 химических веществ для определения романа Модуляторы GJIC рекламы-ЯФП GJIC анализа с использованием LN215-рекламы ЯФПQL и LN215-я− клетки. На рисунке 2показаны результаты, полученные с табличкой представитель. Процент рекламы ЯФП флуоресценции в каждой скважине показана как линейную диаграмму в Рисунок 2A и проц.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Assay рекламы ЯФП-GJIC может использоваться для HTS, потому что это надежный, быстрый и недорогой. HTS assay считается надежной Если Z'-фактор превышает 0,525. Смотреть Zhang et al. для описания статистического анализа, используемый для оценки пригодности HTS анализов25. Когда LN215 клетки были использованы, Z'-фактор > 0.5 без оптимизации анализа. Если используются другие типы клеток в assay и его Z'-фактор < 0.5, надежность может быть улучшена путем расширения пробирного .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют никаких конфликтов интересов раскрыть.
Благодарности
Это исследование было поддержано базовой программы исследований науки через национальных исследований фонда из Кореи (NRF) финансируется министерством образования (2011-0023701, 2016R1D1A1A02937397 и 2018R1A6A1A03023718).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 96-луночный планшет | SPL | 30096 | |
| Кальция хлорид (CaCl2) | Sigma | C5670 | I-раствор |
| D-(+)-глюкозы | Sigma | G7021 | C-раствор, I-раствор |
| диметилсульфоксида (DMSO) | 276855 | ||
| HEPES | Sigma | RES6003H-B7 | C-раствор, I-раствор |
| липофектамина 2000 | трансфекции | Invitrogen | 11668-027 |
| Магния хлорид гексагидрат (MgCl2 6H2O) | Sigma | M2393 | C-раствор С-ридер |
| для чтения микропланшетов | BMG LabTech | POLARstar Омега 415-1618 | |
| pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| Polybrene | sigma | H9268 | |
| Poly-L-лизиновый раствор | sigma | P4707 | |
| Хлорид калия (KCl) | Sigma | P5405 | C-раствор, I-раствор |
| psPAX2 | Addgene | #12260 | |
| Puromycin Dihydrochloride | sigma | P8833 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S5886 | C-раствор, I-раствор |
| Гидрооксид натрия (NaOH) | Sigma | S2770 | |
| Йодид натрия (NaI) | Sigma | 383112 | I-раствор |
Ссылки
- Goodenough, D. a, Goliger, J. a, Paul, D. L. Connexins, connexons, and Intercellular Communication. Annual Review of Biochemistry. 65, 475-502 (1996).
- Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. M....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
