Методическая статья

Иодид желтый флуоресцентный белок разрыв соединения межклеточные связи Assay

DOI:

10.3791/58966

⸱

1 февраля 2019 г.

 , 
1College of Pharmacy, Yonsei Institute of Pharmaceutical Sciences, Yonsei University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол для Роман разрыв соединения межклеточные связи assay предназначен для высокопроизводительного скрининга разрыв соединения модулирующих химических веществ для обнаружения наркотиков и токсикологические оценки.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Разрыв соединения (GJs) являются каналы клеточной мембраны, которые позволяют диффузии молекул меньше 1 кДа между соседними ячейками. Как они физиологических и патологических ролей, существует необходимость высокопроизводительного скрининга (HTS) анализов для выявления GJ модуляторы в наркотиками открытий и токсикологии анализов. Роман йодид желтый флуоресцентный белок разрыв соединения межклеточные связи (I-рекламы ЯФП-GJIC) пробирного удовлетворяет эту потребность. Это на основе ячеек пробирного, включая доноров и акцепторов клетки, которые разработаны для стабильно Экспресс вариант желтый флуоресцентный белок (рекламы ЯФП), чьи флуоресценции чутко закаленном йодида, или SLC26A4, иодид транспортер, соответственно. Когда йодида добавляется к смешанной культуре клеток двух типов, они ввести клеток донора через SLC26A4 транспортер и диффузного в прилегающих акцептора клетки через GJs где они утолить рекламы ЯФП флуоресценции. Рекламы ЯФП флуоресценции измеряется от скважины в кинетическую режиме. GJ деятельность отражает скорость тушения рекламы ЯФП. Assay надежный и быстрый, чтобы использоваться для Хайтс Протокол assay рекламы ЯФП-GJIC с использованием LN215 клеток, клеток глиомы человека, описал.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Разрыв соединения (GJs) выступать в качестве межклеточного каналы, чтобы разрешить распространение малых молекул < 1 кДа таких питательных веществ, метаболитов и сигнальных молекул между соседними ячейками. Соединительной элементы включают hemichannel или Коннексоны в каждой ячейке, и каждый Коннексоны представляет собой шесть connexins (Cxs)1. GJs и Cxs были использованы в токсикологии анализов канцерогенных веществ таких как полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), которые являются GJ ингибиторы2,3,4. Нарушена GJIC был связан с nongenotoxic канцерогенез5,6. Как потенциальной терапевтической цели ГДЖ участие было сообщено в частности подтипы изъятий7,8, защита от сердца и мозга ишемии/реперфузии травмы9, мигрень с аурой10, лекарственно индуцированные травма печени6,11и ранозаживляющее12. Высокопроизводительного скрининга (HTS) анализы необходимы для выявления GJ-модулирующих химических веществ или антител для обнаружения наркотиков, для анализов токсикологии и выявления роман сотовой регуляторы активности GJ. HTS анализов может также использоваться для расследования связей структура активность GJ модуляторы2,13,,1415.

Некоторые GJIC анализы включают переноса красителя или двойной патч зажим методов. Люцифер желтый чемпион (LY) и Флуорексон acetoxymethyl эфира (Флуорексон ам) были использованы в красителях передача анализов. Клетки не проницаемой для LY, который вводится путем микроинъекции, лом загрузки или электропорации. Раз внутри клетки, LY распространяется на соседние клетки через GJs и GJ деятельность assayed масштабы миграции LY16. Флуорексон-ам анализов обычно включают в себя разрыв флуоресценции восстановления после Фотообесцвечивание17,18. Флуорексон-ам является клеток permeant красителем, который внутриклеточно преобразован в непроницаемой Флуорексон внутренней эстеразы. Assay требует Конфокальный микроскоп для наблюдения за передачей Флуорексон ам в клетку от окружающих его после лазерной Фотообесцвечивание. Если функциональные GJs присутствуют, Флуорексон ам в соседних ячейках входит photobleached клеток и флуоресценции восстанавливается. GJ активность assayed по степени восстановления флуоресценции клеток photobleached. Анализы на красителях передача кропотливая и требует много времени или низкой чувствительности. Зажим двойной патч является электрофизиологических метод, который измеряет соединительной проводимости. Это относительно чувствительных, с прямая зависимость проводимости на количество открытых GJs19; Однако она является технически сложным, трудоемким и дорогим20. Assay рекламы ЯФП-GJIC был разработан для использования в Хайтс

Рисунок 1 иллюстрирует компоненты и действия рекламы-ЯФП GJIC assay, который использует акцептора клетки, выражая вариант рекламы ЯФП йодид чувствительных, H148Q и I152L (QLрекламы ЯФП) и клеток донора, выражая йодида транспортера (SLC26A4)21 . Две мутации, перевозимых рекламы ЯФПQL позволяют тушения флуоресценции йодида22. Йодиды добавляются к совместно культивируемых акцептора и клеток донора; не вводите акцептора клетки, они принимаются до настоящего SLC26A4 транспортеры на клеток донора. Йодиды в клеток донора диффундируют через функционирование GJs в прилегающих акцептора клетки, где они утоляют рекламы ЯФПQL флуоресценции. Если GJs закрыты или заблокированы ингибиторы, йодида нельзя ввести акцептора клетки, чтобы утолить флуоресценции. GJ деятельность отражает скорость тушения рекламы ЯФПQL . Процедура анализа GJIC рекламы-ЯФП сложным ни много времени. Он совместим с HTS и может использоваться для проверки воздействия большого числа соединений на ГДЖ активность в течение относительно короткого периода. Он требует только акцептора и клеток донора и два сбалансированных солевых растворов. Протокол, в описанный ниже основывается на LN215 клетки, чьи основные Cx-Cx4321. LN215-рекламы ЯФПQL рецепторов и LN215-я− доноров клеток были порожденных трансдукция с lentiviruses, выражая рекламы ЯФПQL или SLC26A421,23.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. поколение lentiviruses, выражая рекламы ЯФПQL и SLC26A4

  1. Растут HEK293T человеческих эмбриональных почечных клеток до 80% confluency на 100 мм культуры пластин. Дульбекко изменение орла среднего (DMEM) дополнены плода бычьим сывороточным 10%, 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина 100 мкг/мл является питательной среды, используемые протоколом для поддержания HEK293T и другие клетки, указанных ниже.
  2. 6-ну культуры пластины пальто, добавив 2 мл 0,005% раствора стерильную поли L-лизин (PLL) для каждой скважины на 10 мин аспирационная PLL решения и ополосните поверхность два раза с 2 мл стерильной воды.
  3. Мойка HEK293T клетки с 10 мл фосфата буфер солевой раствор (PBS) и лечения монослои клеток в каждое блюдо 100 мм с 2 мл 0,25% раствора трипсина ЭДТА при 37 ° C на 3 мин добавить 5 мл питательной среды и Ресуспензируйте клетки.
  4. Подсчитать ячейки в Горяева и регулировка плотности суспензии клеток до 250.000 клеток/мл в питательной среды и добавьте 500000 клеток в 2 мл питательной среды для каждого лизин покрытием хорошо плит 6-хорошо. Инкубировать клетки в увлажненные 5% CO2/95% воздуха атмосферы при 37 ° C в течение 24 часов и затем замените культурной среде DMEM без пенициллина и стрептомицина.
  5. В 1,5 мл трубку Разбавьте 20 мкл Реагента трансфекции с 500 мкл DMEM без сыворотки или антибиотики. Осторожно перемешать, закупорить и дать постоять 5 мин при комнатной температуре.
  6. Тем временем, Пипетка 250 мкл DMEM в каждый из двух 1.5 мл пробирок и затем добавить 1500 нг pLVX Энн-рекламы ЯФПQL или pLenti6P-SLC26A4, 1225 нг psPAX2 и 375 нг pMD2.G каждому. Два лентивирусные плазмид были ранее описанных21. Добавить 250 мкл разбавленного трансфекции реагента в каждую пробирку плазмида, осторожно перемешать и проинкубируйте втечение 20 мин при комнатной температуре.
  7. После 20 минут добавьте 500 мкл Реагента и плазмиды комплексов трансфекции в 1,5 мл пробирок каплям для каждой культуры пластины Шаг 1.4 и микс, тряся пластину и обратно. Инкубируйте клетки при 37 ° C в CO2 инкубатора для 12 h.
  8. Замените носитель 2,5 мл свежей среды и проинкубируйте дополнительных 48 ч. Затем место пластину культуры на льду для 5 минут чтобы кондиционером среду, содержащую человека, охлажденные поддерживать инфективности.
  9. Сбор средств массовой информации, содержащие lentiviruses и передать 15 мл конические трубы. Центрифуга на 3000 x g при 4 ° C на 3 мин, а затем удалите плавающей HEK293T клетки из супернатанта, фильтрации на 0,4 мкм.
  10. Храните носитель, содержащий lentiviruses на 4 ° C для использования в течение 2 дней. Для последующего использования храните 200 мкл аликвоты −80 ° C.

2. LN215-рекламы ЯФПQL и LN215 поколения-я− клеток лентивирусные трансдукция

  1. Растут LN215 клеток в культуре тарелки 100 мм до 80%, confluency в среде DMEM, дополненная 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) 100 ед/мл пенициллин и 100 мкг/мл стрептомицина, как описано выше.
    Примечание: Если рекламы ЯФП-GJIC assay проводится с помощью различных ячеек строки, используйте соответствующие питательной среды. LN215-рекламы ЯФПQLи LN215-я– клетки могут быть предоставлены Фондом университет-промышленность, Йонсейского университета. Пожалуйста, свяжитесь с соответствующей автором.
  2. Один день до трансдукции, мыть дважды с 10 мл PBS, ячейками с 2 мл 0,25% трипсина-ЭДТА при 37 ° C на 3 мин Ресуспензируйте клетки в 5 мл питательной среды с 10 мл Серологические Пипетки и регулировка плотности 50 000 клеток/мл. Добавьте 20 000 ячеек в 400 мкл средств массовой информации в каждой скважине 24-ну культуры пластины для лечения не вирус, рекламы ЯФПQL, и SLC26A4 клетки.
  3. После 24 ч инкубации при 37 ° C передают два колодца, заменив питательной среды с 400 мкл смесь 1:1 pLVX Энн-рекламы ЯФПQL или pLenti6P-SLC26A4 Лентивирусы и свежей питательной среды, дополняется Полибрен в конечной концентрации 4 мкг/мл. Для элементов управления не вирус замените питательной среды.
  4. Инкубации клеток при 37 ° C на 15 h, аспирационная носитель, содержащий lentiviruses, добавить свежей питательной среды и инкубации клеток для дополнительного 72 ч.
    Предупреждение: Для предотвращения заражения человека между скважинами, используйте новые советы или пипетки для каждой скважины при аспирационная питательной среды, содержащие Лентивирусы или распределять свежий роста среднего.
  5. Мыть каждый хорошо дважды с 0,5 мл PBS, ячейками с 300 мкл трипсина-ЭДТА на 3 мин Ресуспензируйте клетки в 2 мл питательной среды и пластины в шести ну культуры пластин с 2 мкг/мл puromycin.
  6. Культура клетки в средствах массовой информации, содержащие 2 мкг/мл puromycin, до тех пор, пока все ячейки в элементе управления хорошо мертвы (круглые или плавающей когда наблюдается в Микроскоп), который обычно занимает неделю. Обновите культуры средств массовой информации, содержащие puromycin каждый день в период отбора. Если LN215-рекламы ЯФПQL или LN215-я– культур стали притока до завершения отбора, передачи клетки до 100 мм пластины и продолжить выбор как шаг 2,5.

3. Подготовка необходимых для assay решений

  1. Подготовка 500 мл раствора C (10 мм HEPES, 140 мм NaCl, глюкоза 10 мм, 5 мм KCl, 1 мм MgCl2и 1 мм CaCl2) и 500 мл раствора (10 мм HEPES, 140 мм Най, глюкоза 10 мм, 5 мм KCl и 1 мм CaCl2).
  2. Отрегулируйте пэ-аш обоих решений 7.4 с 1 N NaOH, стерилизовать решения путем фильтрации на 0,4 мкм для хранения. Хранить при 4 ° C до 1 месяца. Перед использованием проверьте pH.

4. покрытие LN215-рекламы ЯФПQL и LN215-я− клетки

  1. Культура LN215-рекламы ЯФПQL и LN215-я− клетки в 100 мм пластин отдельно в питательной среды для охвата населения, необходимые для анализа. LN215-рекламы ЯФПQL и LN215-я− клетки в 40% и 80% confluency в 100 мм пластин, соответственно, достаточно для assay 96-луночных пластины.
  2. Один день до проведения рекламы-ЯФП GJIC assay, мыть каждой пластины культуры 100 мм с 10 мл ФСБ. Лечить каждый плита с 2 мл 0,25% раствора трипсина ЭДТА и инкубировать и при 37 ° C за 5 мин Ресуспензируйте ячеек в каждой пластинке в 4 мл питательной среды и передаче 15 мл конические трубы.
  3. Пелле клетки центрифугированием на 1000 x g на 3 мин удалить супернатант и Ресуспензируйте Пелле каждой ячейки с 5 мл питательной среды. Разбейте любой ячейки сгустки в отдельные клетки, закупорить вверх и вниз примерно в 20 раз с 10 мл Серологические Пипетки.
  4. Подсчитать ячейки в Горяева и разбавленных клетки в культуре среднего сделать суспензий клеток LN215-рекламы ЯФПQL на 80000 клеток/мл и LN215-я− на 160 000 клеток/мл.
  5. Микс 7 мл LN215-рекламы ЯФПQL и 7 мл LN215-я− клеточных суспензий в водоеме. Добавьте 100 мкл смеси в каждой скважине плиты культуры 96-луночных клеток с помощью многоканальных дозаторов.
    Примечание: Чтобы добавить 100 мкл смеси в каждой скважине 96-луночных ячейки листа, необходимо около 10 мл суспензии смешанных клеток. Рекомендуется сделать больше суспензию клеток, чем необходимо.
  6. Инкубировать клетки в увлажненный воздуха /95% 5% CO2при 37 ° C в течение 24 ч. LN215-рекламы ЯФПQL и LN215-я−клеточной культуры должно быть 100% притока, когда проводится assay.

5. проведение рекламы-ЯФП GJIC assay

Примечание: Использование флуоресцентным микроскопом с 20 кратным увеличением и GFP фильтр для проверки пластины 96-Ну чтобы там нет скопления LN215-рекламы ЯФПQL или LN215-SLC26A4 клеток и что культуры клеток, полностью вырожденная и хорошо распространяется до проведение анализа.

  1. По крайней мере 30 минут, прежде чем делать пробу, включите Гонав и 37 ° c.
  2. Мыть трубы автоматического инжектора с 3 мл 70% этанола, 3 мл дистиллированной воды, а затем 3 мл раствора со скоростью потока 300 мкл/сек.
  3. Теплый C - и я решения до 37 ° C в водяной бане.
    Примечание: Каждый раз при необходимости 100 мкл каждого решения для каждой скважины 96-луночных пластины около 10 мл каждого решения необходим для калибровочных. Еще 10 мл раствора я-необходима для грунтования каждой пластины (в общей сложности 20 мл) и еще 25 мл раствора C необходим для мытья каждой пластины (в общей сложности 35 мл).
  4. Аспирационная среднего роста или инвертировать пластины, очистить его; вытряхнуть остаточного среднего.
    Примечание: Остаточные плода бычьим сывороточным в СМИ роста вызывает фон флуоресценции и снижение в Пробирной качества.
  5. Мкл 200 C-решения для каждой скважины из водоема с помощью многоканальных дозаторов. Аспирационная C-раствор или инвертировать пластину пустые и вытряхнуть остаточного решения.
  6. Добавьте 50 мкл мкл C-раствор, 1 мкл 2,5 мм химических запасов (см. таблицу 1) или диметилсульфоксид (ДМСО) как средство, а затем 50 мкл мкл C-решение для каждой скважины с многоканальные пипетки.
    Примечание: Большинство реагентов в библиотеке химических растворяются в ДМСО и до 1% (v/v) допускается в большинстве на основе ячеек анализов24. ДМСО имеет более высокую плотность, чем вода, реагентов, растворенных в ДМСО, как правило, спуститься на дно при добавлении к культуре тарелка скважин, которая беспокоит концентрации пробирного решений. Это можно обойти путем добавления 50 мкл C-раствор, реагенты в ДМСО и 50 мкл C - решение в порядке. Последние 50 мкл раствора C предназначен для смешивания.
  7. Инкубируйте клетки при 37 ° C в воздухе, а не 5% CO2. Время инкубации могут быть изменены, но 10 мин обычно достаточно для ионного канала модуляторы действовать.
  8. Во время инкубации, установите программу чтения Гонав придать 100 мкл-решения для каждой скважины в 1 s и для измерения флуоресценции 10 s s промежутки 0.4. Установите читателю читать флуоресценции снизу. Рекомендуется инъекции скорость составляет 135 мкл/s. набор длина волны возбуждения 485 Нм и чтения выбросов на 520 Нм.
    Примечание: Подробные параметры для программ Считыватель микропланшетов заключаются в следующем.
    1. Нажмите кнопку Управление протоколами .
    2. Нажмите кнопку создать . Выберите Интенсивность флуоресценции в разделе метод измерения и Хорошо режим в чтении раздел режим. Затем нажмите кнопку ОК . Появится новая вкладка.
    3. В Основные параметры меню, установите волны возбуждения 485 Нм и выбросов на 520 Нм. Выберите Снизу оптической читать флуоресценции со дна. Время для начала задать измерение «0 s», количество интервалов для быть «25», количество вспышек в колодец и интервал, чтобы быть «20» и интервал времени, чтобы быть «0,4 s».
    4. В меню Макет выберите нарисуйте область пластины для чтения.
    5. В Концентрации/тома/Shacking меню установите Считыватель микропланшетов придать 100 мкл-решения для каждой скважины с 135 мкл/s скорость впрыска.
      Примечание: Избегайте быстрее скорости впрыска, потому что они могут привести к отряд клеток.
    6. В меню время впрыска , установить время начала впрыска 1 s. Затем нажмите кнопку Начать измерение .
  9. После инкубации Поместите пластины для 96-луночных микропланшетов читателя и начать измерения, нажав кнопку Начать измерения снова.

6. Расчет GJIC деятельности

  1. Вычислить проценты рекламы ЯФПQL закалки и GJIC деятельности23
    Рекламы ЯФПQL закалки (%) =figure-protocol-1
    GJIC активность (%) =figure-protocol-2
    Примечание: В принципе, GJIC активности должен рассчитываться от разницы процентных рекламы ЯФП флуоресценции в скважинах с акцептором клеток и клеток донора и акцептор ячейка соответствующей только скважин. Однако, как LN215-рекламы ЯФПQL клетки показывают, незначительным рекламы ЯФП закалки, иодид после 10 s, мы не берем на фоне рекламы ЯФП закалки во внимание при проведении HTS с помощью LN215-рекламы ЯФПQL и LN215-я– клетки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Двадцать девять 96-луночных культуры пластины были использованы для экрана 2,320 химических веществ для определения романа Модуляторы GJIC рекламы-ЯФП GJIC анализа с использованием LN215-рекламы ЯФПQL и LN215-я− клетки. На рисунке 2показаны результаты, полученные с табличкой представитель. Процент рекламы ЯФП флуоресценции в каждой скважине показана как линейную диаграмму в Рисунок 2A и проц...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Assay рекламы ЯФП-GJIC может использоваться для HTS, потому что это надежный, быстрый и недорогой. HTS assay считается надежной Если Z'-фактор превышает 0,525. Смотреть Zhang et al. для описания статистического анализа, используемый для оценки пригодности HTS анализов25. Когда LN215 клетки были использованы, Z'-фактор > 0.5 без оптимизации анализа. Если используются другие типы клеток в assay и его Z'-фактор < 0.5, надежность может быть улучшена путем расширения пробирного ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют никаких конфликтов интересов раскрыть.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано базовой программы исследований науки через национальных исследований фонда из Кореи (NRF) финансируется министерством образования (2011-0023701, 2016R1D1A1A02937397 и 2018R1A6A1A03023718).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
96-луночный планшетSPL30096
Кальция хлорид (CaCl2)SigmaC5670I-раствор
D-(+)-глюкозыSigmaG7021C-раствор, I-раствор
диметилсульфоксида (DMSO)276855
HEPESSigmaRES6003H-B7C-раствор, I-раствор
липофектамина 2000трансфекцииInvitrogen11668-027
Магния хлорид гексагидрат (MgCl2 6H2O)SigmaM2393C-раствор С-ридер
для чтения микропланшетов BMG LabTech POLARstar Омега 415-1618
pMD2.G Addgene#12259
PolybrenesigmaH9268
Poly-L-лизиновый растворsigmaP4707
Хлорид калия (KCl)SigmaP5405C-раствор, I-раствор
psPAX2 Addgene #12260
Puromycin DihydrochloridesigmaP8833
Sodium chloride (NaCl)SigmaS5886C-раствор, I-раствор
Гидрооксид натрия (NaOH)SigmaS2770
Йодид натрия (NaI)Sigma383112I-раствор
sigma Реагент для

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goodenough, D. a, Goliger, J. a, Paul, D. L. Connexins, connexons, and Intercellular Communication. Annual Review of Biochemistry. 65, 475-502 (1996).
  2. Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. Modulated Gap Junctional Intercellular Communication as a Biomarker of PAH Epigenetic Toxicity: Structure-Function Relationship. Environmental Health Perspectives. 106, 975(1998).
  3. U, J. E. T., Chang, C., Upham, B., Wilson, M. Epigenetic toxicology as toxicant-induced changes in intracellular signalling leading to altered gap junctional intercellular communication. Toxicology Letters. , 71-78 (1998).
  4. Yamasaki, H. Role of disrupted gap junctional intercellular communications in detection and characterization of carcinogens. Mutation Research - Reviews in Genetic Toxicology. , (1996).
  5. Yamasaki, H., et al. Gap junctional intercellular communication and cell proliferation during rat liver carcinogenesis. Environmental Health Perspectives. 101, suppl 5 191-197 (1993).
  6. Vinken, M., et al. Gap junctional intercellular communication as a target for liver toxicity and carcinogenicity. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 44, 201-222 (2009).
  7. Fonseca, C. G., Green, C. R., Nicholson, L. F. B. Upregulation in astrocytic connexin 43 gap junction levels may exacerbate generalized seizures in mesial temporal lobe epilepsy. Brain Research. 929 (1), 105-116 (2002).
  8. Garbelli, R., et al. Expression of connexin 43 in the human epileptic and drug-resistant cerebral cortex. Neurology. 76 (10), 895-902 (2011).
  9. Schulz, R., et al. Connexin 43 is an emerging therapeutic target in ischemia/reperfusion injury, cardioprotection and neuroprotection. Pharmacology and Therapeutics. 153, 90-106 (2015).
  10. Sarrouilhe, D., Dejean, C., Mesnil, M. Involvement of gap junction channels in the pathophysiology of migraine with aura. Frontiers in Physiology. , (2014).
  11. Patel, S. J., et al. Gap junction inhibition prevents drug-induced liver toxicity and fulminant hepatic failure. Nature Biotechnology. 30 (2), 179-183 (2012).
  12. Kandyba, E. E., Hodgins, M. B., Martin, P. E. A murine living skin equivalent amenable to live-cell imaging: analysis of the roles of connexins in the epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 128 (4), 1039-1049 (2008).
  13. Upham, B. L., et al. Differential roles of 2 , 6 , and 8 carbon ceramides on the modulation of gap junctional communication and apoptosis during carcinogenesis. Cancer Letters. 191, 27-34 (2003).
  14. Upham, B. L., et al. Structure-activity-dependent regulation of cell communication by perfluorinated fatty acids using in vivo and in vitro model systems. Environmental Health Perspectives. 117 (4), 545-551 (2009).
  15. Weis, L. M., et al. Bay or Baylike Regions of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons Were Potent Inhibitors of Gap Intercellular Communication. Environmental Health Perspectives. 106 (1), 17-22 (1998).
  16. el-Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. Scrape-Loading and Dye Transfer: A Rapid and Simple Technique to Study Gap Junctional Intercellular Communication. Experimental Cell Research. 168 (2), 422-430 (1987).
  17. Wade, M. H., Trosko, J. E., Schindler, M. Photobleaching Assay of Gap Junction- Mediated Communication Between Human Cells. Advancement of Science. 232 (4749), 525-528 (2010).
  18. Abbaci, M., et al. In vitro characterization of gap junctional intercellular communication by gap-FRAP technique. Proceedings of SPIE. , 585909(2005).
  19. Neyton, J., Trautmann, A. Single-channel currents of an intercellular junction. Nature. 317 (6035), 331-335 (1985).
  20. Wilders, R., Jongsma, H. J. Limitations of the dual voltage clamp method in assaying conductance and kinetics of gap junction channels. Biophysical Journal. 63 (4), 942-953 (1992).
  21. Lee, J. Y., Choi, E. J., Lee, J. A new high-throughput screening-compatible gap junctional intercellular communication assay. BMC Biotechnology. 15 (1), 1-9 (2015).
  22. Galietta, L. J. V., Haggie, P. M., Verkman, A. S. Green fluorescent protein-based halide indicators with improved chloride and iodide affinities. FEBS Letters. 499 (3), 220-224 (2001).
  23. Lee, J. Y., Yoon, S. M., Choi, E. J., Lee, J. Terbinafine inhibits gap junctional intercellular communication. Toxicology and Applied Pharmacology. 307, 102-107 (2016).
  24. Hughes, J., Rees, S., Kalindjian, S., Philpott, K. Principles of early drug discovery. British Journal of Pharmacology. 162 (6), 1239-1249 (2011).
  25. Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  26. Upham, B. L. Role of Integrative Signaling Through Gap Junctions in Toxicology. Current Protocols in Toxicology. , (2011).
  27. Schalper, K. A., et al. Modulation of gap junction channels and hemichannels by growth factors. Molecular BioSystems. 8 (3), 685-698 (2012).
  28. Kulkarni, G. V., Mcculloch, C. A. G. Serum deprivation induces apoptotic cell death in a subset of Balb / c 3T3 fibroblasts. Journal of Cell Science. 1179, 1169-1179 (1994).
  29. Harris, A. L., Locke, D. Permeability of Connexin Channels. Connexins. , 165-206 (2009).
  30. Choi, E. J., Yeo, J. H., Yoon, S. M., Lee, J. Gambogic Acid and Its Analogs Inhibit Gap. Junctional Intercellular Communication. 9, 1-10 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

GJIC YFPLN215SLC26A4

Похожие статьи