Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Количественные экспертизы по чувствительности к антибиотикам Neisseria gonorrhoeae агрегатов с помощью АТФ использования коммерческих анализов и Live/мертвые пятнать

8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58978

⸱

8 февраля 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Marine Biotechnology and Resources, National Sun Yat-Sen University, 2Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland

В этой статье

Краткое содержание

Простой АТФ измерительные пробирного и/мертвые окрашивания метода были использованы для количественной оценки и визуализировать Neisseria gonorrhoeae выживание после лечения с Цефтриаксон. Этот протокол может быть расширен для изучения антимикробного воздействия любой антибиотик и может использоваться для определения минимальной ингибирующее концентрацию антибиотиков в бактериальные биопленки.

Аннотация

Появление устойчивых к антибиотикам Neisseria gonorrhoeae (GC) представляет собой угрозу для здоровья во всем мире и подчеркивается необходимость выявления лиц, которые не лечение. Это грамотрицательные бактерии вызывает гонорею исключительно в организме человека. Во время инфекции она способна формы агрегатов и/или биопленки. Минимальная концентрация тормозной (MIC) тест используется для определения чувствительности к антибиотикам и определить соответствующее лечение. Однако механизм ликвидации в естественных условиях и его связь с лабораторных результатов не известны. Был разработан метод, который проверяет как GC агрегации влияет на чувствительности к антибиотикам и показывает связь между совокупный размер и чувствительности к антибиотикам. Когда GC агрегат, они более устойчивы к антибиотикам убийства, с бактериями в центре выжившие Цефтриаксон лечения лучше, чем те, на периферии. Эти данные указывают, что N. gonorrhoeae агрегирование может уменьшить свою подверженность цефтриаксон, который не отражается Стандартный агар пластины-методов на основе MIC. Метод, используемый в данном исследовании позволит исследователям для тестирования бактериальных Восприимчивость клинически соответствующих условиях.

Введение

Гонорея является общим половым путем инфекции (STI)1. Neisseria gonorrhoeae (GC), грамотрицательные бактерии diplococcal, является возбудителем этого заболевания. Симптомы инфекции половых органов может привести к боли во время мочеиспускания, обобщенные половых боль и мочеиспускательного канала разряда. Инфекция часто бессимптомной2,3,,45, и это позволяет для расширенной колонизации. Эти необработанные инфекций являются основных проблем системы здравоохранения, поскольку они имеют потенциал для облегчения передачи организма, и это может привести к осложнениям, например, воспалительные заболевания тазовых органов (PID) и распространены гонококковая инфекция (DGI)6. Устойчивых к антибиотикам гонорея — кризис общественного здравоохранения и растущее социально-экономическое бремя7. Уменьшенной восприимчивости к цефалоспорины привело к изменению режима лечения от одного антибиотика для двойной терапии, которая сочетает в себе доксициклина или азитромицина с Цефтриаксон8. Увеличение неудача Цефтриаксон и азитромицин9,10, в сочетании с бессимптомной инфекции, подчеркивает необходимость понимания неудач лечения гонореи.

Минимальная концентрация тормозной (MIC) теста, включая агар разрежения и диск диффузии испытаний, был использован как стандартный медицинский тест для определения устойчивости к антибиотикам. Тем не менее неясно, если тест MIC отражает бактерий к антибиотикам в естественных условиях. Формирование бактериальные биопленки способствует выживания бактерий в присутствии бактерицидные концентрации антибиотика: MIC тестирования не удается обнаружить этот эффект11. Потому что GC может формировать биоплёнки слизистой поверхности12, мы предполагаем, что антибиотика чувствительности в пределах агрегатов будет отличаться от что видел в отдельных GC. Кроме того исследования показали, что трехфазные переменной поверхности молекул, пили, непрозрачность связанные белком (Opa), и lipooligosaccharides (Лос), которые регулируют взаимодействие между бактерия, привести к различным размером агрегатов13, 14 , 15. вклад этих компонентов к антибиотикам не были рассмотрены из-за отсутствия надлежащих методов.

В настоящее время существует несколько методов для измерения искоренение биопленки. Наиболее широко используемый количественных методом является измерение изменений в биомассе, используя фиолетовый кристалл, окрашивание16. Однако этот метод требует значительных экспериментальных манипуляций, который потенциально может генерировать ошибки в эксперимент повторяется17. Метод окрашивания жить/мертвые, используемый здесь позволяет визуализации живых и мертвых бактерий и их распределения в рамках биопленки. Однако структура биопленки может представлять как физический барьер, который уменьшает проникновение красителя. Таким образом для количественной оценки жить/Мертвые бактерии внутри группы, окрашивание ограничивается малых биоплёнки или его предшественником microcolonies или агрегатов. Другие методы, включая тесты диффузии агар разрежения и диск, не способны измерить воздействие агрегации. Для изучения GC восприимчивость внутри агрегата после антибиотикотерапии экспозиции, идеальный метод будет необходимо иметь оба количественных assay который может измерить живут бактерии и визуализировать их распределения.

Процедуру, описанную здесь сочетает АТФ использование измерения и жить/мертвые пятнать количественно assay для и визуально изучить вызовы GC восприимчивость в агрегаты присутствии антибиотики.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Общее обслуживание штаммов GC

  1. Полоска штаммы N. gonorrhoeae GCK агар с 1% Келлогг дополняет18 (Таблица 1, таблица 2) из морозильника запасов и инкубировать 37 ° C с 5% CO2 для 16-18 ч. Использование MS11 выражая фаза переменная опа (MS11Opa +), без опа (MS11ΔOpa), или усеченных Лос (MS11ΔLgtE).
  2. Тщательно выберите пили отрицательные (колонии без темный край) или положительным (колонии с темный край) колонии от каждого штамма, основанные на колонии морфология19 с использованием рассечения световой микроскоп и полоска на новую пластину ГЦК.
  3. Инкубируйте при 37 ° C с 5% CO2 для 16-18 ч перед использованием.

2. жизнеспособность количественная оценка GC агрегатов

  1. Собирайте с помощью стерильных аппликатор GC. Тампоном GC от плиты и вновь приостановить GC в подогретым отваром (GCP, Таблица 3) дополнены с 4,2% NaHCO3 и 1% Келлогг решения18. Используйте Спектрофотометрия на длине волны 650 Нм (ОД650 1 = ~ 1 x 109 кое/мл) для определения концентрации взвешенных бактерий.
  2. Регулировка концентрации GC ~ 1 x 108 кое/мл.
  3. Мкл 99 скорректированных GC подвески в скважины 96-луночных плиты.
  4. Инкубировать пластину для 6 ч при 37 ° C с 5% CO2 позволяет бактерии для статистической обработки.
  5. 1 мкл серийный разреженных Цефтриаксон (1000, 100, 50, 25, 12.5, 6.2, 3.1, 1.5, 0,8, 0,4, 0,2 мкг/мл) в каждой скважине. Оставьте некоторых скважин, лечить в качестве элементов управления.
  6. Инкубируйте пластину для 24 ч при 37 ° C с 5% CO2.
  7. Sonicate подвеска 3 раза в каждую лунку для 5 s на 144 Вт и 20 кГц.
  8. Добавить 100 мкл Реагента свечение использование коммерчески доступных АТФ в каждой скважине, Пипетка вверх-вниз на 3 раза и инкубировать в течение 15 минут при 37 ° C с 5% CO2.
  9. Тщательно передача 150 мкл смеси от каждой скважины в новый колодец в черный 96-луночных микропланшетов и избежать пузырей.
  10. Измерение оптической плотности каждой скважины на 560 Нм, используя читателя пластины.
  11. Рассчитайте выживаемость, соотношение чтения, полученные после лечения серийный Цефтриаксон к чтению из необработанной скважин.

3. флуоресценции микроскопический анализ Live/мертвые GC агрегатов

  1. Собирайте с помощью стерильных аппликатор GC. Тампоном GC от плиты и вновь приостановить GC в подогретым GCP медиа плюс 1% Келлогг добавки.
  2. Определить количество бактерий методом спектрофотометрии на длине волны 650 нм и регулировка концентрации GC ~ 1 x 107 кое/мл.
  3. Мкл 198 GC подвески в в 8-Ну coverslip нижней палаты.
  4. Инкубируйте камеры для 6 ч при 37 ° C с 5% CO2 разрешить агрегации формирования.
  5. 2 мкл Цефтриаксон (100 мкг/мл или различных разведениях), в каждой скважине в пределах каждого состояния агрегации. Инкубируйте на требуемое время при 37 ° C с 5% CO2.
  6. 0,6 мкл жить/мертвые окрашивание раствора смеси в каждой скважине и проинкубируйте втечение 20 мин при 37 ° C с 5% CO2.
  7. Приобрести Z-серии изображений с помощью конфокального микроскопа (эквивалент микроскоп может использоваться).
  8. Анализ изображения с помощью ImageJ программное обеспечение для измерения размера GC агрегатов и коэффициент интенсивности флуоресценции (РПИ) жить к мертвый пятнать в каждой совокупности.

4. анализ

  1. Оценка размера бактериальных агрегатов.
    1. Откройте ImageJ и откройте изображение, перетащив файл raw изображений в строке меню ImageJ.
    2. Нажмите в строке меню ImageJ Произвольные линии и обведите область каждого агрегата в изображении.
    3. Нажмите кнопку анализ | Мера в строке меню ImageJ.
    4. Получите номер в новом окне в столбце область .
  2. Количественная оценка коэффициента жить к мертвый агрегатов
    1. Откройте ImageJ и откройте изображение, перетащив файл raw изображений в строке меню ImageJ.
    2. Нажмите кнопку анализ | Набор измерений в строке меню ImageJ.
    3. Проверьте комплексной плотность во всплывающем окне и нажмите кнопку ОК.
    4. Нажмите на изображение, | Цвет | Каналы инструмент в строке меню и выберите Цвет.
    5. Проверьте канал 1 как флуоресценции для живых бактерий пятнать.
    6. Нажмите в строке меню ImageJ Произвольные линии и обведите область каждого агрегата.
    7. Нажмите кнопку анализ | Мера в строке меню ImageJ.
    8. Получение числа в столбце IntDen .
    9. Проверьте 2 канала как флуоресценции для окрашивания мертвых бактерий. Повторите шаги 4.2.6-4.2.8.
    10. Получите коэффициент жить к мертвый путем деления числа из шага 4.2.8 из шага 4.2.9.
  3. Статистический анализ
    1. Открыть GraphPad Призма и введите цифры, полученные из ImageJ в нужный столбец.
    2. Нажмите кнопку анализировать и выберите t тесты под столбцов анализа.
    3. Установите требуемый столбец для сравнения и нажмите OK.
    4. Получите значение P под окно анализа .
    5. Выберите Линейной регрессии по XY анализы из шага 4.3.3
    6. Получите на R-квадрат и P-значение под окном анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Использовались два метода: assay использования СПС и жить/мертвые окрашивание assay. Результаты можно либо объединить, или индивидуально используется для изучения бактериальных выживания в рамках агрегатов после лечения антибиотиками. Было показано, что СПС использования пробирного измерить точно жизнеспособные бактерии в S. aureus биоплёнки20,21. Здесь MS11Opa + Pil + штамм был использован для изучения роли GC агрегации ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Бактерии могут образовывать биоплёнки во время инфекции человеческого тела. Традиционные MIC тестирования может не отражать концентрации, необходимые для искоренения бактерий в биопленки. Чтобы проверить влияние антибиотиков на биопленки, методы, основанные на биопленки биомассы, а также покрытие CFUs может быть ошибочным воздействием биопленки структуры. Например метод покрытия работает только если биопленки может быть нарушена. Следовательно полученные CFU может быть ниже, чем фактическое количество жизнеспособных бакт...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грант от национального института здравоохранения д.х.н. и в.с. AI123340. Л-К.В, J.W., переменного тока, и е.н. были поддержаны в части/участие в программе «Первый год инноваций и исследований опыт», финансируемого университета штата Мэриленд. Спонсоры имел никакой роли в исследования дизайн, сбор данных и анализ, решение публиковать, или подготовка рукописи. Мы признаем UMD CBMG изображений ядра для всех экспериментов микроскопии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
100x добавка
AgarUnited States BiologicalA0930
BacTiter Assay PromegaG8232
CeftriaxoneTCIC2226
Difco GC средняя база BD228950
Нитрат железа, нонагидратSigma-Aldrich254223-10G
ГлюкозаThermo Fisher ScientificBP350-1
L-глутамин кристаллический порошокFisher ScientificBP379-100
BacLight живое/мертвое окрашиваниеInvitrogenL7012
MS11 Neisseria gonorrhoeae штаммлюбезно предоставлено доктором Германом Шнайдером, Армейский институт Уолтера Рида для
Исследования Двухосновной фосфат калия (K2HPO4)Fisher ScientificP290-500
Моноосновной фосфат калия (KH2PO4)Fisher ScientificBP329-1
Протеозный пептон BD Biosciences211693
Хлорид натрия (NaCl)FisherScientific S671-10
Растворимый крахмалSigma-AldrichS9765
Тиамин пирофосфатSigma-AldrichC8754-5G
Оборудование
Чашки ПетриVWR25384-302
8-луночный Камера с покровным дном Thermo Fisher Scientific155411
96-луночные планшеты для культивирования тканей Corning, Falcon3370
Шкаф биобезопасности (NU-425-600 Класс II, A2 Ламинарный колпак для биологической опасности)Nuaire32776
CO2 ИнкубаторFisher Scientific  Модель 3530
Конфокальный микроскоп с камерой для визуализации в реальном времениLeicaSP5X
Corning  96 лунок Микропланшет из черного полистирола Осветитель Corning3904
Glomax PromegaE6521
Наконечники для пипеток (0,1-10 &; L)Thermo Fisher Scientific02-717-133
Наконечники для пипеток (1000 &; L)VWR83007-382
Наконечники для пипеток (200 &; L)VWR53509-007
Спектрофотометр Ultrospec 2000 UVPharmacia Biotech80-2106-00
Стерильные конические пробирки 15 млVWR21008-216
Стерильные микроцентрифужные пробирки (1,7 мл)Sorenson BioScience16070
Стерильные аппликаторы с полиэфирными наконечникамиFisher Scientific23-400-122
Ультразвуковой аппаратKontesэквивалентный 9110001
Kellogg's,

Ссылки

  1. CDC STD Facts. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: http://www.cdc.gov/std/gonnorrhea/STDFact-gonorrhea-detailed.htm (2017).
  2. den Heijer, C. D., et al. A comprehensive overview of urogenital, anorectal and oropharyngeal Neisseria gonorrhoeae testing and diagnoses among different STI care providers: a cross-sectional study. BMC Infectious Diseases. 17 (1), (2017).
  3. Hein, K., Marks, A., Cohen, M. I. Asymptomatic gonorrhea: prevalence in a population of urban adolescents. The Journal of Pediatrics. 90 (4), 634-635 (1977).
  4. Hananta, I. P., et al. Gonorrhea in Indonesia: High Prevalence of Asymptomatic Urogenital Gonorrhea but No Circulating Extended Spectrum Cephalosporins-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strains in Jakarta, Yogyakarta, and Denpasar, Indonesia. Sexually Transmitted Diseases. 43 (10), 608-616 (2016).
  5. Chlamydia, W. H. O. Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, syphilis and Trichomonas vaginalis. Methods and results used by WHO to generate 2005 estimates. World Health Organisation, 2011. Prevalence and incidence of selected sexually transmitted infections. World Health Organisation. , accessed Oct 5 (2011).
  6. Mayor, M. T., Roett, M. A., Uduhiri, K. A. Diagnosis and management of gonococcal infections. American Family Physician. 86 (10), 931-938 (2012).
  7. Alirol, E., et al. Multidrug-resistant gonorrhea: A research and development roadmap to discover new medicines. PLOS Medicine. 14 (7), (2017).
  8. Workowski, K. A., Bolan, G. A. Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2015. MMWR Recommendations and Reports. 64, 1-137 (2015).
  9. Lahra, M. M., et al. Cooperative Recognition of Internationally Disseminated Ceftriaxone-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strain. Emerging Infectious Diseases. 24 (4), (2018).
  10. Wi, T., et al. Antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae: Global surveillance and a call for international collaborative action. PLOS Medicine. 14 (7), 1002344(2017).
  11. Singh, S., Singh, S. K., Chowdhury, I., Singh, R. Understanding the Mechanism of Bacterial Biofilms Resistance to Antimicrobial Agents. Open Microbiology Journal. 11, 53-62 (2017).
  12. Greiner, L. L., et al. Biofilm Formation by Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 73 (4), 1964-1970 (2005).
  13. Zollner, R., Oldewurtel, E. R., Kouzel, N., Maier, B. Phase and antigenic variation govern competition dynamics through positioning in bacterial colonies. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
  14. Stein, D. C., et al. Expression of Opacity Proteins Interferes with the Transmigration of Neisseria gonorrhoeae. across Polarized Epithelial Cells. PLoS One. 10 (8), 0134342(2015).
  15. LeVan, A., et al. Construction and characterization of a derivative of Neisseria gonorrhoeae strain MS11 devoid of all opa genes. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6468-6478 (2012).
  16. Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Curr Protoc Microbiol. , Chapter 1., Unit 1B.1 (2005).
  17. Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. Journal of Microbiological Methods. 72 (2), 157-165 (2008).
  18. White, L. A., Kellogg, D. S. Neisseria Gonorrhoeae Identification in Direct Smears by a Fluorescent Antibody-Counterstain Method. Journal of Applied Microbiology. 13, 171-174 (1965).
  19. Swanson, J., Kraus, S. J., Gotschlich, E. C. Studies on gonococcus infection. I. Pili and zones of adhesion: their relation to gonococcal growth patterns. Journal of Experimental Medicine. 134 (4), 886-906 (1971).
  20. Herten, M., et al. Rapid in Vitro Quantification of S. aureus Biofilms on Vascular Graft Surfaces. Frontiers in Microbiology. 8, 2333(2017).
  21. Gracia, E., et al. In vitro development of Staphylococcus aureus biofilms using slime-producing variants and ATP-bioluminescence for automated bacterial quantification. Luminescence. 14 (1), 23-31 (1999).
  22. Webb, J. S., et al. Cell death in Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Journal of Bacteriology. 185 (15), 4585-4592 (2003).
  23. Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. In vitro biofilm formation in an 8-well chamber slide. Journal of visualized experiments. (47), (2011).
  24. Wang, L. C., Litwin, M., Sahiholnasab, Z., Song, W., Stein, D. C. Neisseria gonorrhoeae Aggregation Reduces Its Ceftriaxone Susceptibility. Antibiotics (Basel). 7 (2), (2018).
  25. Lebeaux, D., Ghigo, J. M., Beloin, C. Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 510-543 (2014).
  26. Hall-Stoodley, L., et al. Towards diagnostic guidelines for biofilm-associated infections. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 127-145 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Количественные экспертизы по чувствительности к антибиотикам Neisseria gonorrhoeae агрегатов с помощью АТФ использования коммерческих анализов и Live/мертвые пятнать
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.