Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Сайт Направленный мутагенез для In Vitro и In Vivo экспериментов примером взаимодействия РНК в Escherichia Coli

20.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58996

⸱

5 февраля 2019 г.

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Southern Denmark

В этой статье

Краткое содержание

Сайт Направленный мутагенез — это метод, используемый для внедрения специфических мутаций в дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Этот протокол описывает, как сделать сайт направленного мутагенеза с шага 2 и 3-х ступенчатая полимеразной цепной реакции (ПЦР) на основе подхода, который применяется к любой фрагмент ДНК интерес.

Аннотация

Сайт Направленный мутагенез — это метод, используемый для внедрения конкретных мутации в ДНК для изучения взаимодействия между малых молекул некодирующих рибонуклеиновой кислоты (Срна) и целевой messenger РНК (мРНК). Кроме того сайт Направленный мутагенез используется для сопоставления определенных белков сайтов связывания РНК. Описан шаг 2 и шаг 3 ПЦР на основе внедрения мутаций. Этот подход имеет отношение к всех белков РНК и исследования взаимодействия РНК-РНК. Короче говоря метод полагается на проектирование грунты с желаемой mutation(s) и через 2 или 3 шаги PCR, синтезирующий продукт PCR с мутацией. Затем продукт PCR используется для клонирования. Здесь мы опишем, как выполнять сайт направленного мутагенеза с 2 - х и 3-х ступенчатый подход к внедрению мутации Срна, McaS и мРНК, csgD, расследовать РНК-РНК, РНК белковых взаимодействий. Мы применяем этот метод для изучения взаимодействия РНК; Однако методика применима ко всем исследованиям мутагенез (например, ДНК белковых взаимодействий, амино кислоты замещения/удаления/добавления). Это можно представить какой-либо мутация, за исключением ненатуральных баз, но техника применяется, только если продукт PCR может быть использован для вниз по течению приложения (например, клонирование и шаблон для дальнейшего ПЦР).

Введение

ДНК часто называют чертеж живой клетки, так как все структуры ячейки кодируются в последовательности ДНК. Точная репликация и ДНК ремонт механизмов гарантируют, что происходят только очень низкие темпы мутаций, которая необходима для поддержания правильной функции закодированных генов. Изменения последовательности ДНК может повлиять на последующие функции на различных уровнях, начиная с ДНК (признание факторов транскрипции и энзимов ограничения), затем РНК (base пара взаимодополняемости и вторичной структуры изменения) и/или белки (аминокислоты кислоты замены, удаления, дополнений или смены кадра). Хотя многие мутации не существенно влияет на функции гена, некоторые мутации в ДНК может иметь огромные последствия. Таким образом сайт Направленный мутагенез является ценным инструментом для изучения важность определенных участков ДНК на всех уровнях.

Этот протокол описывает подход целевой мутагенеза, используется для введения специфических мутаций. Протокол опирается на две разные стратегии ПЦР: шаг 2- или 3-шаг ПЦР. 2-шаг ПЦР является применимым, если желаемый мутации недалеко от ' конец 5 или 3' концу ДНК интерес (< 200 пар оснований (ВР) от конца) и ПЦР 3-шаг применяется во всех случаях.

В 2-х ступенчатый подход ПЦР 3 грунты разрабатываются, в которой один набор праймеров предназначен для того чтобы усилить дна интереса (грунтовки 1 и 3, вперед и назад, соответственно), и один учебник предназначен для включения мутации. Мутация, представляя грунтовка (праймер 2) должен иметь обратный ориентации, если мутации недалеко от ' конец 5 и вперед ориентации если мутация близок к 3' конца. На первом шаге PCR праймер 1 + 2 или 2 + 3 усиливает небольшой фрагмент недалеко от ' конец 5 или 3' конца, соответственно. Полученный продукт PCR затем используется как грунт на втором шаге грунтом 1 или 3, в результате чего в продукт PCR с мутации в ДНК интерес (рис. 1A).

В 3-х ступенчатая PCR 4 грунтовки предназначены, в которых один набор праймеров предназначен для того чтобы усилить дна интереса (грунтовки 1 и 4, вперед и назад, соответственно) и один набор праймеров предназначен для учета специфических мутаций с перекрывающимися взаимодополняемости (грунты, 2 и 3, обратить вспять и вперед, соответственно). В шаге один и два, грунтовки 1 + 2 и 3 + 4 усиливают 5' и 3' конца. На шаге 3 результирующий продукты PCR от шаг 1 и 2 используются как шаблоны и усиливается с праймерами 1 + 4. Таким образом полученный продукт PCR является ДНК интерес с желаемой мутация (рис. 1B).

В то время как мутировал ДНК может использоваться для любого приложения, ниже по течению, этот протокол описывает вновь объединить вектор клонирования ДНК. Использование клонирования векторов имеет ряд преимуществ, таких как простота клонирования и конкретных экспериментальных приложений в зависимости от особенностей вектора. Эта возможность часто используется для исследования взаимодействия РНК. Другой метод для исследования взаимодействия РНК является структурной зондирующего РНК в комплексе с другой РНК1,белка или2 3,4. Однако структурные зондирование выполняется только в пробирке в то время как сайт направленного мутагенеза и последующего клонирования позволяют для исследования взаимодействия в естественных условиях.

Сайт Направленный мутагенез широко применяется для исследования взаимодействия РНК, представленные здесь. Однако ключевым методом относительно 2 - или 3-шаг ПЦР применима к любой фрагмент ДНК и таким образом не ограничивается только исследования РНК взаимодействия.

Чтобы проиллюстрировать, техника и его возможного использования, используется характеристика регионов важно для post-transcriptional регулирование мРНК, csgD, Escherichia coli (E. coli). В E. coli, csgD является мишенью малые РНК-кодирования, McaS, в сотрудничестве с белками, Hfq, для подавления выражения протеина CsgD2,4,5. Метод используется для внедрения мутаций в регионе база сопряжения между csgD и McaS и Hfq привязки сайта csgD. Затем полученные ДНК клонируется в вектор подходит для последующих экспериментов. Нисходящие приложения методики включают в vivo и in vitro экспериментов. Для иллюстрации пример 1 характеризуется в естественных условиях, используя западную помарку пробирного и пример 2 характеризуется в пробирке, используя assay переноса электрофоретической подвижности (EMSA). В обоих случаях это иллюстрированный как сайт Направленный мутагенез может использоваться в сочетании с другими методами биологического выводы о ген интереса.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. вектора выбора

  1. Выберите вектор для выполнения течению эксперименты с. Для этого метода ПЦР 2 - и 3-шаг применим любой вектор.
  2. На основе выбора вектора, выберите надлежащие энзимы ограничения для клонирования.

2. грунтовка дизайн для сайта направленного мутагенеза

  1. Выбор между ПЦР стратегия 2-шаг или 3-ступенчатая (2-шаг предназначен только для перегласовок < 200 bp из любого конца ДНК интерес). Для 2-ступенчатой PCR перейдите к шагу 2.2 и для 3-х ступенчатая PCR, перейдите к шагу 2.3.
  2. Праймеры дизайн для 2-ступенчатой ПЦР.
    1. Конструкция праймера 1 и 3, чтобы усилить дна интереса и с 5' навес, содержит 4 нуклеотидов (например, ATAT или СЛКП) следуют соответствующие ограничения распознавания сайта необходимо клонировать в выбранный вектор.
    2. Дизайн праймера 2 ввести mutation(s) на нужный сайт и фланка мутации с 10-15 дополнительных нуклеотидов с обеих сторон. Сделать обратный если мутация вводится в конце 5' грунтовка или если мутация вводится в конце 3'.
  3. Дизайн праймеров PCR 3-шаг.
    1. Конструкция праймера 1 и 4, чтобы усилить дна интереса и с 5' навес, содержит 4 нуклеотидов (например, ATAT или СЛКП) следуют соответствующие ограничения распознавания сайта необходимо клонировать в выбранный вектор.
    2. Дизайн праймера 2 и 3 для внедрения mutation(s) на нужный сайт и фланка мутации на 10-15 дополнительных нуклеотидов с обеих сторон. Грунтовка, 2 и 3 являются обратный взаимодополняющими.

3. ПЦР-амплификации дикого типа ДНК для клонирования

Примечание: Данные по PCR, см.6.

  1. Выполните ПЦР6 с помощью грунтовки 1 + 2 (2-шаг ПЦР) или 1 + 4 (3-шаг ПЦР) и дикого типа ДНК как шаблон для получения продукта PCR I. Использование программы ПЦР в таблице 1.
  2. Проверка ПЦР электрофорезом геля агарозы.
    1. Сделайте агарозы геля раствор (2%), добавив 2 g агарозы на 100 мл 1 x трис ацетат Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) (ТЭ) буфера. Растворите агарозы путем кипячения в микроволновой печи. Добавьте бромид ethidium краситель ДНК окрашивание (до конечной концентрации ~ 0,5 мкг/мл) для агарозы гель решение для визуализации.
    2. Литой геля агарозы, поместите ее в устройство электрофореза и загрузить образцы ПЦР (смешанные с ДНК загрузки красителя) и ДНК лестница известного размера. Запуск образцов на 75 W 45 мин, или до полосы отделены адекватно и визуализировать полос столом ультрафиолетового (УФ) или с гель системы.
  3. Очистить продукт PCR с комплектом извлечения геля (Таблица материалов) и измерять концентрацию очищенная ДНК с спектрофотометр (Таблица материалов).
  4. Храните очищенная ДНК при-20 ° C (в буфер Tris-ЭДТА (TE) – длительный срок хранения) или 4 ° C (в dH2O – короткий срок хранения) до используется в шаге 5.

4. ПЦР представить сайт направлен мутации в ДНК

  1. ПЦР для 2-ступенчатой ПЦР (см. шаг 4.2 для PCR 3-шаг)
    1. Выполнять ПЦР6 с помощью грунтовки 1 + 2, если мутации в ' конец 5 или 2 + 3 Если мутации в 3' конца и использовать дикого типа ДНК в качестве шаблона для получения продукта PCR II (см. таблицу 1 для ПЦР программы).
    2. Проверка ПЦР электрофорезом геля агарозы как шаг 3.2.1 и 3.2.2.
    3. Очистить продукт PCR с комплектом извлечения геля (Таблица материалов) и измерять концентрацию очищенная ДНК с спектрофотометр (Таблица материалов).
    4. Магазин очищенная ДНК при-20 ° C (в буфере TE) или 4 ° C (в dH2O) до используется в шаге 5.
    5. Выполнять ПЦР6 с помощью ПЦР продукта II как грунт вместе с грунт 3 Если мутации в 5' конца или праймер 1 Если мутации в конце 3' и использовать дикого типа ДНК как шаблон для получения продукта PCR III (см. в таблице 1 для ПЦР программы).
    6. Проверка ПЦР электрофорезом геля агарозы как шаг 3.2.1 и 3.2.2.
    7. Очистить продукт PCR с комплектом извлечения геля (Таблица материалов) и измерять концентрацию очищенная ДНК с спектрофотометр (Таблица материалов).
    8. Магазин очищенная ДНК при-20 ° C (в буфере TE) или 4 ° C (в dH2O) до шаг 5.
  2. ПЦР для 3-шаг PCR
    1. Выполнять ПЦР6 с помощью грунтовки 1 + 2 и 3 + 4 в отдельный реакциях и использования дикого типа ДНК в качестве шаблона для получения продукта PCR II и III (см. таблицу 1 для ПЦР программы).
    2. Проверка ГКДЗ электрофорезом геля агарозы как шаг 3.2.1 и 3.2.2.
    3. Очистить продуктов ПЦР с комплектом извлечения геля (Таблица материалов) и измерять концентрацию очищенная ДНК с спектрофотометр (Таблица материалов).
    4. Магазин очищенная ДНК при-20 ° C (в буфере TE) или 4 ° C (в dH2O).
    5. Выполнять ПЦР6 с помощью грунтовки 1 + 4 и использовать 2-5 нг обоих продуктов ПЦР II и III как шаблоны (в тот же реакция) для получения ПЦР продукта IV (см. таблицу 1 для ПЦР программы).
    6. Проверка ПЦР электрофорезом геля агарозы как шаг 3.2.1 и 3.2.2.
      Примечание: Это не редкость получить несколько неправильные полосы (может иногда быть уменьшена с помощью менее шаблона). Однако неправильные продукты PCR может игнорироваться, если правильно размера группы является подакцизным и гель извлекается.
    7. Если все правильно, очистить продукт PCR с комплектом извлечения геля (Таблица материалов) и измерять концентрацию очищенная ДНК с спектрофотометр (Таблица материалов).
    8. Магазин очищенная ДНК при-20 ° C (в буфере TE) или 4 ° C (в dH2O) до шаг 5.

5. рекомбинации дикого типа и мутантов версию(и) ДНК в выбранный вектор

Примечание: Подробные сведения на следующие шаги, см7.

  1. Дайджест очищенные продукты PCR I и III (от 2-х ступенчатый ПЦР) и IV (от 3-х ступенчатая ПЦР) с помощью соответствующих энзимов ограничения.
    1. В 20 мкл 1 x пищеварение буфер с 1 мкл каждого энзима ограничения, дайджест 200 ng ПЦР продукта при 37 ° C за 30-60 мин.
  2. Очистить переваривается ПЦР продукта экстракцией гель, используя набор извлечения геля (Таблица материалов), измерения концентрации ДНК очищенная ДНК с спектрофотометр (Таблица материалов) и хранить при температуре-20 ° C (в буфере TE) или 4 ° C (в dH2 O) до тех пор, пока используется для шага 5.6.
  3. Дайджест очищенный вектор с соответствующими энзимов ограничения и лечения с щелочной фосфатазы уменьшить события повторного перешнуровка вектора. Не относитесь продуктов ПЦР с щелочной фосфатазы.
    1. В 30 мкл 1 x пищеварение буфер с 1 мкл каждого энзима ограничения и 1 мкл щелочной фосфатазы, дайджест 1000 ng вектора при 37 ° C за 30-60 мин.
  4. Отдельные переваривается вектор из отходов ДНК (например, режиссерский вектор и вырежьте из ДНК) с использованием геля агарозы как шаг 3.2.1 и 3.2.2.
  5. Очистить переваривается вектор экстракцией гель, используя набор извлечения геля (Таблица материалов), измерения концентрации ДНК очищенная ДНК с спектрофотометр (Таблица материалов) и хранить при температуре-20 ° C (в буфере TE) или 4 ° C (в dH2O) до тех пор, пока используется для шага 5.6.
  6. Перевязать переваривается продуктов ПЦР в переваривается вектор с реакции, указанных в таблице 2.
  7. Инкубации при комнатной температуре на 2 ч или ночлег на 16 ° C.
  8. Трансформировать получателей деформации (например, E. coli K12) с перевязкой реакций.
    1. Расти штамм ОД600= 0,3-0,5 и передачи 1 мл культуры столько 1.5 мл пробирок как лигаза реакций.
    2. Спина на 3500 x g 5 минут и удалить супернатант.
    3. Ресуспензируйте клетки в 200 мкл буфера трансформации (10 мл бульона (LB) lysogeny с 0,1 г/мл полиэтиленгликоля 3350, 5% диметил сульфат и 20 мм MgCl2).
    4. Добавить реакции перешнуровки и место трубы на льду за 30 мин.
    5. Тепло шок для 2 мин при 42 ° C.
    6. Добавьте 1 mL фунта для 1.5 мл пробирок и позволяют фенотипические выражения к антибиотикам для по крайней мере 45 минут при 37 ° C.
    7. Спина клетки на 3500 x g 5 мин, отменить 1 мл супернатант и Ресуспензируйте ячейки в остальные супернатант.
    8. Пластина клетки на пластинах с соответствующие антибиотики и Инкубируйте на ночь на 37 ° C.
  9. Определите трансформантов, укрывательство векторов с успешной интеграции Вставка ДНК (например, с использованием вектора - и вставка специфические праймеры PCR).
  10. Проверить последовательность ДНК Сэнгером последовательности.
    Предостережение: Не используйте же Праймеры для последовательности, используемое для шага 5.9.

6. использование сконструированного векторов для эксперименты в лабораторных условиях или в естественных условиях

  1. В естественных условиях эксперимента
    Примечание: Это пример использования вектор выразить дикого типа/мутировал РНК характеризовать post-transcriptional регулирования. Для получения более подробной информации о Западный blotting смотрите8.
    1. Растут штаммов E. coli K12 с построены векторные в соответствующей среде и побудить выражение, если требуется. Урожай образцы центрифугированием.
    2. Подготовка образцов для натрия Додециловый сульфат – полиакриламидный гель-электрофорез (SDS-PAGE) путем растворения гранул клеток в 1 x буфер образца SDS (62,5 мм трис-HCl pH 6.8, 2,5% SDS, 0,002% бромфеноловый синий, β-меркаптоэтанол 5%, 10% глицерина) и варить при 95 ° C за 5 мин.
      Примечание: Это можно бросить гель или использовать коммерчески доступных сборного гель. Последний был использован в результаты, представленные на рисунке 3 (Таблица материалов).
    3. Загрузить 107 клеток каждого образца в отдельных скважинах (включая трапом протеина) и Побегите гель на 200 V до тех пор, пока белки разделяются (примерно 45 минут).
    4. Блот белков на целлюлозы мембрану полусухим переводом на 80 мА на 1 ч.
    5. Блокировать мембраны смесью белков (например, 5% молока порошок растворяют в 1 x Tween 20-трис буфер солевой (TTBS) буфера).
    6. Добавление основного антитела (растворяют в 1 x TTBS буфера) протеина интереса (например, GFP-, флаг- или его меткой белка) и инкубировать 1 час с нежным агитации.
    7. Вымойте мембраны в 1 x TTBS удалить несвязанные антитела для 10 мин. Повторите дважды больше.
    8. Добавление вторичного антитела (растворяют в 1 x TTBS буфера), предназначенный для первичного антитела и позволяют для обнаружения (например, пероксидаза (ПХ)-конъюгированных вторичные антитела. Инкубируйте 1 час с нежным агитации.
    9. Вымойте мембраны в 1 x TTBS удалить несвязанные антитела для 10 мин. Повторите дважды больше.
    10. Визуализируйте мембраны с техникой, совместимый с вторичные антитела (например, путем обработки изображений после инкубации с люминол производные хемилюминесценции, если используется вторичное антитело проспряганное ПХ).
  2. В пробирке эксперимент
    Примечание: Это пример использования вектора как шаблон для в vitro транскрипция РНК характеризовать РНК белковых взаимодействий. Для получения более подробной информации о EMSA см9.
    1. Сделайте в пробирке стенограммы, используя T7 в vitro транскрипция kit (Таблица материалов) и векторы из шага 5 в качестве шаблонов.
    2. Отдельные РНК стенограммы на страницу на 4,5% мочевина 7 М, Денатурирующий гель и извлечь РНК непосредственно из геля, электро элюирование с диализа трубы (Таблица материалов).
    3. Ярлык РНК (например, radiolabeling с γ -32P-ATP используя T4-полинуклеотид киназы (Таблица материалов) и очистить снова с колоннами (Таблица материалов).
      Предупреждение: Перед началом работы с радиоактивными материалами, консультироваться с сотрудником местной радиационной безопасности.
    4. Смешайте помечены РНК с увеличением концентрации белка в отдельные реакции в 1 x привязки буфера (20 мм трис, рН 8, 100 мм KCl, 1 мм MgCl2, 1 мм Дитиотреитол (DTT)).
      Примечание: В представленные результаты (рис. 4), 2 Нм radiolabeled csgD мРНК смешивали с градиентом от 0 до 2 мкм Hfq белка (концентрации мономера).
    5. Разрешить белка и РНК гибридизируйте перед загрузкой гибридизации микс на-Денатурирующий гель полиакриламида и запустить гель для 1,5 h 200 V.
    6. Визуализируйте гель с техникой, совместимый с маркировки от шага 6.1.3. (например, путем phosphoimaging, если radiolabeling был применен).
    7. Количественную оценку относительной интенсивности полос перешли с работой с образами, программа обработки и подходят кривой (сигмоид) к данным с помощью графа и программное обеспечение для анализа данных (Таблица материалов). Основываясь на гладкой кривой, диссоциация констант (dK) может определяться автоматически с программным обеспечением.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для изучения взаимодействия РНК относительно post-transcriptional регулирование csgD, двойной Векторный установки был выбран: выразить csgD мРНК и другой выразить малые РНК-кодирования, McaS. csgD был клонирован в pBAD33, который является арабинозы индуцибельной средне копировать плазмиду с хлорамфеникол сопротивления и McaS был клонирован в мини-pNDM220 R1, который является изопропиловый β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) индуцибельной низкой копировать плазмиду ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Сайт Направленный мутагенез имеет широкий спектр различных приложений, и здесь, представитель результаты от in vivo и эксперимент в лабораторных условиях были включены в качестве примеров того, как сделать биологических выводы, используя технику. Сайт Направленный мутагенез уже давно золотой стандарт для исследования взаимодействия РНК. Сила технику в комбинации внедрения соответствующих мутаций с течению анализов и эксперименты (Западная помарка или EMSA), чтобы сделать выводы о конкретных сайтов ДНК и их значение в фун...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют не конкурирующие интересы.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Университет Южной Дании открытого доступа политики грантов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Антитело Anti-GroEL, полученное в кроликеMerckG6532Первичное антитело
Azure c200AzureNAGel imaging Рабочая станция для визуализации геля
Пользовательский олиго ДНКMerckVC00021
DeNovix DS-11DeNovixNA Спектрофотометр для измерения нуклеиновых кислот
Гелевая загрузка ДНК Краситель (6X)Thermo ScientificR0611
Раствор бромида этидия 1 %Carl Roth2218.1
Набор для экстракции геляGeneJET Thermo ScientificK0691
GeneRuler DNA Ladder Mix FermentasSM0333
Gerard GeBAflex-tube MidiGerard BiotechTO12Диализные трубки для электроэлюирования
MEGAscript T7 Transcription KitInvitrogenAM1334
Mini-Sub Cell GT CellBio-Rad1704406Система горизонтального электрофореза
Моноклональное антитело ANTI-FLAG M2, полученное у мышейMerckF3165Первичное антитело
Мышиные иммуноглобулиныDako CytomationP0447HRP конъюгированное вторичное антитело
NucleoSpin miRNAMacherey Nagel740971очистка РНК
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels ThermoScientificNP0323BOXBis-Tris гели для разделения белков
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix с HF BufferNew England BiolabsM0531SДНК-полимераза
PowerPac HC Сильноточный источник питанияBio-Rad1645052
кроликами ИммуноглобулиныDako CytomationP0448HRP конъюгированные вторичное антитело
SeaKem LE AgaroseLonza50004
SigmaPlotSystat Software IncNAGraph and data analysis software tool
T100 Thermal CyclerBio-Rad1861096ПЦР машина
T4 ДНК-лигазаNew England BiolabsM0202Лигаза
T4 ПолинуклеотидкиназаNew England BiolabsM0201S
Буфер TAE (трис-ацетат-ЭДТА) (50X)Thermo ScientificB49

Ссылки

  1. Bouvier, M., et al. Small RNA binding to 5' mRNA coding region inhibits translational initiation. Molecular Cell. 32 (6), 827-837 (2008).
  2. Jorgensen, M. G., et al. Small regulatory RNAs control the multi-cellular adhesive lifestyle of Escherichia coli. Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).
  3. Antal, M., et al. A small bacterial RNA regulates a putative ABC transporter. The Journal of Biological Chemistry. 280 (9), 7901-7908 (2005).
  4. Andreassen, P. R., et al. sRNA-dependent control of curli biosynthesis in Escherichia coli: McaS directs endonucleolytic cleavage of csgD mRNA. Nucleic Acids Research. , (2018).
  5. Thomason, M. K., et al. A small RNA that regulates motility and biofilm formation in response to changes in nutrient availability in Escherichia coli. Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).
  6. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).
  7. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
  8. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
  9. JoVE Science Education Database. Biochemistry. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA). Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
  10. Kunkel, T. A. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (2), 488-492 (1985).
  11. Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
  12. Wells, J. A., Vasser, M., Powers, D. B. Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites. Gene. 34 (2-3), 315-323 (1985).
  13. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  14. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

EMSA
Сайт Направленный мутагенез для In Vitro и In Vivo экспериментов примером взаимодействия РНК в Escherichia Coli
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.