Здесь мы представляем протокол изолировать плазматической мембраны, цитоплазмы и митохондрии клеток U937 без использования высокоскоростной центрифуги. Этот метод может использоваться для очистки субцеллюлярные фракций для последующего изучения белков локализации через immunoblotting.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Фракционирование клеток U937 клеток в отсутствие высокоскоростной центрифуги
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В этом протоколе мы подробно метод для получения субцеллюлярные фракций U937 клеток без использования ultracentrifugation или неизбирательного моющих средств. Этот метод использует гипотонический буферов, digitonin, механический лизис и дифференциального центрифугирования изолировать цитоплазмы, митохондрии и плазматической мембраны. Этот процесс может масштабироваться для удовлетворения потребностей исследователей, является недорогим и простым. Этот метод позволит исследователям для определения локализации белка в клетках без специализированных центрифуги и без использования коммерческих комплекты, оба из которых могут быть дорогими. Мы успешно использовали этот метод, чтобы отделить цитозольной, плазматической мембраны и митохондриальных протеинов в линии клеток человека Моноцит U937.
Введение
Надежная идентификация белка локализации часто бывает необходимо при рассмотрении молекулярные пути в эукариотических клеток. Методы для получения субцеллюлярные фракции используются исследователями более внимательно изучить клеточных компонентов, представляющих интерес.
Большинство существующих методов фракционировки клетки, как правило, делятся на две широкие категории, на основе моющих средств1,2 и на основе ultracentrifugation3,4,5, который может быть различаются по скорости, точности и....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовьте буферов и реагенты
Примечание: См. таблицу 1.
- Подготовка решений буфер A, литического буфера B, буфер образца и digitonin.
- Подготовка буфера A, добавив 8.77 г NaCl и 50 мл HEPES (1 М, рН 7,4) до 900 мл деионизированной воды, настроить конечный объем до 1 Л деионизированной водой.
Примечание: Окончательный концентрации являются 150 мм NaCl и 50 мм HEPES. - Подготовка буфера lysis B, добавив 20 мл HEPES (1 М, рН 7,4), 0,75 г KCl, 0,19 g MgCl2, 2 мл Этилендиаминтетрауксусная кислота (0,5 М ЭДТА), 2 мл этиленгликоля bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-tetraacetic кислота ....
- Подготовка буфера A, добавив 8.77 г NaCl и 50 мл HEPES (1 М, рН 7,4) до 900 мл деионизированной воды, настроить конечный объем до 1 Л деионизированной водой.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Успешное фракционирование недифференцированных клеток U9378 , выращенных в подвеска была выполнена с использованием протокола подробно изложенных выше и показан на рисунке 1. Образцы, полученные с помощью этого метода были подвергнуты западных blotting9 , используя влажный передачи метода винилидена фторида (PVDF) мембраны. Мембрана впоследствии был исследован с антителами против цитоплазмы, митохондриальных и м.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В разработке этого протокола, обусловленные неспособность отделить митохондриальных и мембраны образцов, используя коммерчески доступные наборы для анализа белка локализации во время necroptosis14. Основная ограничения готовые комплекты являются их неспособность быть адаптированы к потребностям отдельных исследователей, их стоимость образца и ограниченное количество образцов может быть обработан. Метод, представленный здесь могут выполняться без использования дорогостоящих реагентов и без необходи.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют никакого конфликта интересов
Благодарности
Работа была поддержана низ 1R15HL135675-01 для Ларокка Тимоти Дж.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Дигитонин | TCI Chemicals | D0540 | Для цитоплазменной экстракции |
| D-маннитол | Sigma-Aldrich | M4125 | Для лизиса буфера B |
| Гомогенизатор Dounce | VWR | 22877-282 | Для гомогенизации |
| концевой ротатор | Barnstead | N/A | Для цитоплазменной экстракции |
| этиленгликоль-бис(&бета;-аминоэтиловый эфир)-N,N,N' ,N'-тетрауксусная кислота (EGTA) | Alfa Aesar | J61721 | Для буфера для лизиса |
| B Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) | Sigma-Aldrich | E7889 | Для буфера для лизиса B |
| GAPDH (14C10) | Cell Signalling Technologies | 2118 | Для обнаружения цитоплазматических фракций на вестерн-блот, dilution: 1:10000 |
| HEPES | VWR | J848 | Для буферов лизиса A и B |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | Для буфера для лизиса B |
| MgCl2 | Alfa Aesar | 12315 | Для буфера для лизиса |
| B Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) | Cell Signalling Technologies | 23565 | Для обнаружения фракций плазматической мембраны на вестерн-блоттинге, dilution: 1:1000 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | для буфера для лизиса A |
| фенилметансульфонилфторид (PMSF) | VWR | M145 | Для экстракции цитоплазмы и гомогенизации |
| Буферный зонд ультразвуковой аппарат | Qsonica | Q125-110 | Для конечных образцов |
| коктейль ингибиторов протеазы, общее использование | VWR | M221-1ML | Для экстракции цитоплазмы |
| рефрижераторная центрифуга | Beckman-Coulter | N/A | |
| Додецилсульфат натрия (SDS) | VWR | 227 | Для буфера для проб |
| ортованадат натрия (SOV) | Sigma-Aldrich | 450243 | Для буферов для лизиса A и B |
| Сахароза | Sigma-Aldrich | S0389 | Для буфера для лизиса B |
| Трис-буферный физиологический раствор (TBS) | VWR | 788 | Для буфера для проб |
| VDAC (D73D12) | Технологии | клеточной сигнализации4661 | Для обнаружения митохондриальных фракций на вестерн-блоттинге, dilution: 1:1000 |
Ссылки
- Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, e440-e445 (2015).
- Hwang, S. II, Han, D. K.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
