Method Article

Улучшенная и высокой пропускной способности Assay микро нейтрализация респираторно-синцитиальный вирус (RSV)

DOI:

10.3791/59025

⸱

January 26th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Murdoch Children's Research Institute, 2Department of Paediatrics, University of Melbourne, 3School of Chemistry and Molecular Bioscience, University of Queensland, 4London School of Hygiene and Tropical Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование описывает высокую пропускную способность, на основе изображений микро нейтрализация пробирного определить титр нейтрализующих антител специфических для респираторно-синцитиальный вирус (RSV). Этот assay формат был протестирован на различных образцов типов.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Органов дыхания-синцитиальный вирус специфических нейтрализующие антитела (RSV NAbs) являются важным маркер защиты против RSV. Количество различных пробирного форматов в настоящее время используются во всем мире так что необходимо для точной и высок объём метода измерения RSV NAbs. Мы опишем здесь на основе изображений микро нейтрализация assay который был протестирован на RSV подгруппы A и также может быть адаптирована для RSV подгруппы B и различные примеры типов. Этот метод является весьма воспроизводимость, с вариациями между анализами для ведения антисыворотки, менее 10%. Мы считаем, что этот assay может быть легко установлена во многих лабораториях во всем мире при относительно низких затратах. Разработка улучшилось, высок объём assay который измеряет RSV NAbs представляет собой значительный шаг вперед для стандартизации этот метод на международном уровне, а также имеют решающее значение для оценки Роман RSV вакцина кандидатов в будущем.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Респираторно-синцитиальный вирус (RSV) является ведущей причиной инфекции нижних дыхательных путей в педиатрической населения во всем мире1. Несмотря на его высокое бремя существует до сих пор нет вакцины или лечения доступны. С 2013 года Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) объявила RSV вакцина развития как приоритет крупных исследования, с ежегодной встречи ВОЗ консультации2,3. ВОЗ согласовали использование RSV, нейтрализуя антитело (NAb) измерения для мониторинга иммуногенность вакцины, как это признается в качестве основных серологических маркеров защиты4

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примечание: Все шаги должны быть выполнены в капюшоне BSL2, если не указано иначе. Вирусная титрования требуется заблаговременно PRN анализа для определения оптимальной концентрации RSV, используемых в PRN assay. Рекомендуется Алиготе запасов вируса в небольшом объеме, который будет разморожен раз и используется для калибровочных наб. Также рекомендуется использовать тот же вирусные запас для всех анализов NAb, выполняются для всех образцов из одного исследования. Убедитесь в культуре средств массовой информации и фосфат амортизированное saline (PBS) нагревается при 37 ° C перед добавлением в ячейку пластины.

1. RSV вирусных ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Титрование запасов вируса была выполнена с 1:10 до 1:108 разрежения для определения запасов концентрация вируса до пробирного PRN (представитель результаты, показанные на рисунке 5). Рисунок 5, PFU может учитываться надежно в разведениях от 1:104 и 1:10-5. Было рассчитано среднее количество ПФУ от трех экземплярах скважин на же разрежения. С среднее количество пятен в 1:10,5 разведение .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы разработали и оптимизированы простой и эффективный RSV микро нейтрализация assay, который может быть легко адаптирована в большинстве лабораторий. Этот assay возможность измерить способность вирусной инфекции, а также измерения ингибирования вирусной инфекции на NAb на клеточном уровне, используя сканирование компьютерных изображений. Специфичность и чувствительность месте обнаружения по сравнению с традиционными налета обнаружения методы6,7, возросло использо.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят всех участников. Мы признаем правительство викторианской оперативной инфраструктуры поддержки программы. ПВЛ является получателем NHMRC стипендий развития карьеры.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Cell line
A549ATCCCCL-185предоставлено доктором Китом Чаппеллом, Университет Квинсленда
Viral strains
RSV A2ATCCVR-1540номер партии 60430286
Reagents
АцетонMerck1000142511
Alexa-Fluor ослик против коз IgG (хранится при 4 ° град; C)Life TechnologiesA11055
CMC порошок натриевой солиSigma-AldrichC5678-500G
DMEM (без сыворотки, 3,7 г/л NaHC, P/S) (хранится при 4 ° В)Научные услуги – КультураMCRI в домашних условиях Сыворотка
для теленка плода (хранится в 50 мл аликвот при -20 °°; C)InterpathSFBS-F Goat
X RSV антителоMerckAB1128
человеческая поликлональная антисыворотка к респираторно-синцитиальному вирусу (РСВ) (хранится в 45 & микро; L аликвоты при -20 °°; C)BEI ResourcesNR-4022Бесплатный заказ через BEI Resources после регистрации. Эта сыворотка относится к группе антисыворотки человека и иммуноглобулина к РСВ (NR-32832)
M199 порошокLife Technologies31100035
раствор для блокирования разбавителя молока (хранящийся при 4 ° C)Australian Biosearch50-82-01
Пенициллин/стрептомицин (хранящийся в аликвотах объемом 6 мл при -20 °°; C)Life Technologies15140122
s.d.H2O от дозатора Milli-QMerckIn-house dispensation
Sterile 1x PBS для культуры (хранится при температуре 4 ° В)Научные услуги – КультураMCRI на дом поставка
Tween 20 полисорбатSigma-Aldrich9005-64-5
Общие расходные материалы
конические пробирки Falcon (50 мл)Invitro TechnologiesFAL352070
Фильтрующая установка 0,22 m (500 мл)Thermo FisherNAL5660020
Стерильные пробирки Eppendorf (1,5 мл)Australia PLAM12400
Стерильные плоскодонные пластины (96-луночные с крышкой)Interpath655180
Стерильные U-образные пластины (96-луночные с крышкой)Interpath650180
5 мл серологическая пипеткаSigma-AldrichCLS4487-200EA
10 мл серологическая пипеткаInterpath607180
25 мл серологическая пипеткаSigma-AldrichCLS4251-200EA
Tip Pipette 1-200 &микро; L Clear Maxymum Recovery Racked Предварительно стерилизованный 10RACKS x 96TIPS PKG960Fisher BiotecTF-200-L-R-S
Tip Pipette 5-20 &; L Clear Maxymum Recovery Racked Предварительно стерилизованный 10RACKS x 96TIPS PKG960Fisher BiotecTF-20-L-R-S
Tip Pipette 100-1,000 &; LClear Maxymum Recovery Racked Предварительно стерилизованный 10RACKS x 100TIPS PKG1000Fisher BiotecTF-1000-L-R-S
Tip Pipette 1-10 &МИКРО; L Clear Maxymum Recovery Racked Предварительно стерилизованный 10RACKS x 100TIPS PKG1001Fisher BiotecTXLF-10-L-R-S
Оборудование и программное обеспечение
ELISpot система считыванияAID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Страсбург, Германия
AID ELISpot версия программного обеспечения 5.0AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Страсбург, Германия
Microsoft Excel 2007
тканей тканей

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
  2. Modjarrad, K., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

RSV Neutralization AssayMicro neutralization AssayImaging based AssayRSV Subgroup ARSV Subgroup BSerum DilutionVirus Stock PreparationPlaque Reduction AssayAutomated Spots ReaderSemi log Graph Analysis

Related Articles