Методическая статья

Применение стресс хроническим сдержанность лоу кост протокола анализа след и висит ящик тест для мышей

DOI:

10.3791/59027

⸱

23 января 2019 г.

 , 
1Division of Biology, Center for Molecular Medicine, Jichi Medical University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Лоу кост протокол, состоящий из анализа след и висит ящик тест после того, как стресс сдержанность является полезным для оценки расстройства движения мыши модели.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нарушения походки часто наблюдается у больных с двигательными нарушениями. В моделях мыши, используемых на двигательные расстройства походка анализ является важным поведенческих тест, чтобы определить ли мышей передразнить симптомы пациентов. Мотор дефицита часто индуцированных стресс, когда не спонтанное мотор фенотип наблюдается в моделях мыши. Таким образом анализ походки, следуют напряжений будет чувствительным методом для оценки мотор фенотипу мыши модели. Однако исследователи сталкиваются требование дорогой аппарат для получения количественных результатов автоматически от анализа походки. Для снятия стресса желательно напряжений простые методы без дорогих аппаратов для поражения электрическим током и принудительного запуска. Таким образом мы представляем простой и недорогой протокол, состоящий из анализа след с бумаги и чернил, висит ящик тест для оценки двигательной функции, и стресс загрузки определяется сдержанность с конической трубки. Успешно моторного дефицита мышей были обнаружены настоящим Протоколом.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Двигательные расстройства определяются как расстройства нервной системы, показаны избытка или недостатка добровольных или автоматические движения1. В частности нарушения походки часто документально среди пациентов с движения расстройства2,3,4. Таким образом анализ походки является подходящей поведенческих тест для проверки животных моделей двигательных расстройств. В мышей автоматизированных походка анализа были произведены для прогулок на естественную скорость5 и регулируемой скоростью беговой дорожки6,7. Эти анализы автоматически предоставлять количественные результаты походки. Альтернативный метод для обнаружения нарушения походки называется анализ следа. После маркировки дно ног с чернилами, мышей ходить на бумаге, и анализируются следы. Первоначально вазелин и порошкового древесного угля были использованы для визуализации след8и затем были заменены чернила на полиграф бумага9 и фотографические разработчик на фотобумаге10. Дешевле и менее токсичных метод, с помощью чернил и бумаги, чем другие методы по-прежнему остается на сегодняшний день11. Анализ следа является менее дорогостоящим по сравнению с автоматизированного анализа5,6,7 и было бы полезно оценить двигательных расстройств в моделях мыши для исследователей без обильные исследовательские фонды .

Висячие поле тест является своего рода четыре конечности висит тестов с помощью проволоки Кейдж крышку12 и арматурной сетки экрана13. Поле является аппаратом с крышкой вращающийся сетки верхней части коробки вдоль центра бар. Помимо анализа походки, можно легко и недорого провести испытание. Таким образом, мы провели висит ящик тест, чтобы оценить прочность сцепления и баланса, в дополнение к анализу след в настоящем Протоколе.

Стресс вызывает симптомы расстройства движения14,15. Моторного дефицита часто индуцированных несколько хронических стрессов, даже когда не спонтанное мотор фенотип наблюдается в моделях мыши движение расстройство16,17,18. Сдержанность является одним из часто используемых методов для напряжений в мышей, потому что животное не физически пострадали19 и стоимость меньше по сравнению с другими методами, такими как электрическим током с посвященный аппарат и принудительного запуска с использованием беговой дорожке. Сдержанность, трубка, которая выполняется, ограничивая мышь в отверстиями 50 мл Конические трубки, легче, чем другие методы, такие как проволоки сетки сито, тесьмой конечности и упаковки животного с марлей (обзор20). В этой статье, мы суммируем протоколы след анализ и поле висит тест после сдержанность в трубку. Этот протокол позволит нам использовать мышь модели двигательных расстройств без спонтанное мотор фенотип.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты на животных были проведены гуманным образом. Институциональные животного эксперимента Комитет от Jichi медицинского университета одобрил исследование. Исследование было проведено в соответствии с институциональной регулирования для животного эксперимента и основополагающие руководящие принципы для надлежащего поведения животного эксперимента и связанной с этим деятельности в академических научно-исследовательских институтов под юрисдикцией МПКСНТ Японии. Мышей, используемые в настоящем Протоколе, были описаны ранее,21.

1. подвесной ящик тест

  1. Запишите вес каждой мыши. Марк хвост путем маркировки ручка для отдельных дискриминации (например., линии, двойной линии и тройной линии).
    Примечание: Для индекса общее состояние здоровья22используются кривых роста.
  2. Место мыши в экспериментальный номер по крайней мере 30 минут до поведенческих тест. Установите поле висит, которая состоит из четко коробки (25 x 25 x 40 см3) с крышкой вращающийся сетки на верхней части (рис. 1). Крышку сетки может поворачиваться вдоль центрального бара, так что верхней переворачивается на 180 градусов.
  3. Положите мыши в центре крышки сетки. Осторожно поверните крышку сетки вверх.
  4. Измерьте задержку падения (висит время) мыши из сетки крышкой.
    Примечание: Если мышь не попадают в течение 5 мин, запишите задержку в 5 мин.
  5. Вернуться домой клетку мыши. Очистите поле повешение с 70% этанола после каждого теста.

2. след анализ

Примечание: После подвески коробки тест, анализ след.

  1. Настройка Взлетно-посадочная полоса (Рис. 2A).
    1. Вырезать кусок белой бумаги (29,7 см x 42 см x 0,09 мм) продольно на три длины равной ширины. Набор кусок белой бумаги (9,9 x 42 см) в таблице.
    2. Поместите поле темные цели на дистальном конце бумаги. Положить другие коробки (примерно одинаковую длину, что и бумага), стены по обе стороны взлетно-посадочной полосы, предотвращения побега мышей.
    3. Положите черными чернилами и красными чернилами в отдельные Петри (35 мм в диаметре).
  2. Учебная сессия.
    Примечание: Выполните тренировки только в 4-недельного возраста.
    1. Поместите мышь на проксимальном конце документа (лицо головой в сторону поле цели). Пусть мыши ходьбы от проксимального конца в поле цель. Удаление мыши из окна цели. Если мыши останавливается на бумаге, аккуратно нажмите мышью в поле цель палец.
    2. Удерживайте кнопку мыши, держа загривок между большим и указательным пальцами, чтобы ограничить движение Передние конечности. Затем захватите спины и хвоста между мячом большого пальца и другие пальцы, чтобы ограничить движение гомотерия.
      Примечание: Недостаточным проведение мыши приводит к пятна краски на одежде.
    3. Погружайте днища Передние конечности красными чернилами и днища гомотерия черными чернилами. Немедленно Положите мыши на проксимальном конце документа (лицо головой в сторону поле цели). Пусть мыши ходьбы от проксимального конца в поле цель. Если мыши останавливается на бумаге, аккуратно нажмите мышью в поле цель палец.
    4. Удаление мыши из окна цели. Перейдите на сеанс теста.
  3. Сеанс теста.
    1. После тренировки, настройте взлетно-посадочной полосы для следы с новой отрезанный кусок белой бумаги.
    2. Удерживайте кнопку мыши, держа загривок между большим и указательным пальцами, чтобы ограничить движение Передние конечности. Затем захватите спины и хвоста между мячом большого пальца и другие пальцы, чтобы ограничить движение гомотерия.
    3. Погружайте днища Передние конечности красными чернилами и днища гомотерия черными чернилами. Немедленно Положите мыши на проксимальный конец бумаги. Пусть мыши ходьбы от проксимального конца в поле цель.
      Примечание: Потому что мыши предпочитают темные, ходьба становится устойчивыми, как мыши подходы поле темные цели. Если мыши останавливается на бумаге, аккуратно нажмите мышью в поле цель палец. Затем, если для анализа не получены надежные следы (см. шаг 2.4. Анализ следов за подробности) потому что мышь остановился, повторите сеанс теста.
    4. Вернуться домой клетку мыши из окна цели. Очистите поле цели с 70% этанола после каждого теста. Просушите фут печатный документ.
  4. Анализ следов
    1. Получить три измерения каждого параметра (шаг длины базы шириной гомотерия, Передние и задние и передние конечности, перекрываются между передних конечностей и задних конечностей, Рисунок 2B) с линейкой от фут печатный документ.
      Примечание: Потому что следы проксимальных и дистальных концов часто показывают большие вариации из-за остановки или запуска, выберите часть с шаблоном обороты следы. Средней части стопы печатный документ обычно будут пригодны для анализа.
      1. Для длина шага Измерьте расстояния между такими же частями лапы (например, лапы pad или ног).
      2. Для передней ширина основания Нарисуйте линию между подряд вправо (или влево) передние контуры. Затем Измерьте длину вертикальной линии из pad след передней левой (или правой) к линии, проведенной между следы вправо (или влево).
      3. Для задних ширина основания Нарисуйте линию между подряд вправо (или влево) задние следы. Затем Измерьте длину вертикальной линии от колодки задние след левой (или правой) к линии, проведенной между следы вправо (или влево).
      4. Для дублирования Измерьте расстояние между подушечки слева (или справа) передние и задние следы.
    2. Средняя три измерения для каждого человека. Используйте отдельные среднее значение каждого параметра для статистического анализа.
      1. Длина шага используйте среднее индивидуальных средние левой и правой успехов.
      2. Для асимметрии длина шага используйте абсолютное значение разницы между отдельными средними левой конечности и длину шага правой конечности.
      3. Для статистического анализа других параметров (Фронт ширина основания, Задние ширина основания и перекрытия) используйте отдельные среднем непосредственно.

3. сдержанность стресс загрузки

  1. Подготовка трубки сдержанность.
    1. Делает 16 отверстия (примерно 2 мм в диаметре) в 50 мл Конические трубки (30 мм диаметром x 115 мм в длину) вдоль масштаба знаков (5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 мл) и задней части каждой шкалы Марк квадратных сверла (рис. 3). Сделайте отверстие на кончике 50 мл Конические трубки (около 5 мм в диаметре) для дыхания, отрезать кончик. Сделайте отверстие (примерно 4 мм в диаметре) в крышку трубки пройти хвост мышей.
  2. Напряжение нагрузки
    1. Место мыши в экспериментальной комнате.
    2. Держите мышь, держа загривок между большим и указательным пальцами. Введите мышь в сдержанности трубку от головы. Передайте хвост через отверстие в крышке. Закройте крышку.
      Примечание: Ограничение движения передних конечностей, потому что мышей отклонить ввода трубки, Передние конечности.
    3. Держите мышь, прилагается 2 h на столе при комнатной температуре. Удаление мыши из трубки, сдержанность и вернуться домой клетку.
      Примечание: Удерживающей трубы может быть повторно использован после стирки и сухой.

4. экспериментальный график (рис. 4):

  1. Выполните висит поле тест и анализ следа в тот же день в возрасте 4 недель (см. шаг 1. Висячие поле тест и шаг 2. Анализ след подробную информацию) как базовые измерения на всех мышей до группирование в «стресс группа» и группу-стресс.
    Примечание: Около 8-10 мышей в 2-3 помета могут быть пригодны для использования в эксперименте. Анализ следа в 4 недель возраста состоит из обучения и тестирования сессий.
  2. Случайным образом разделите мышей на группу стресс и группу-стресс.
    Примечание: Когда мышей используются, состоящий из нескольких пометов, разделите однопометники равномерно на обе группы. Номер в каждой группе состоит из около 4-5 мышей.
  3. Применить сдержанность стресс к группе стресс 6 раз в течение двух недель (см. шаг 3. Сдержанность напряжений для подробной информации).
    Примечание: 6 раз сдержанности применяются каждые две недели, после чего висит поле анализ тест и след от 6-12 недель возраста. Не применять сдержанность стресса в день теста висит поле тест и анализ следа.
  4. Выполните висит поле тест и тест сессии анализ следа в тот же день в 6, 8, 10 и 12 недель возраста.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гетерозиготных мышей-самцов Atp1a3 (Atp1a3+/ −), которые модель мыши для быстрого начала дистонии паркинсонизм и одичал тип однопометники использовались в настоящем Протоколе. Atp1a3+/ − показали значительно короче длины шага передних конечностей и задних конечностей чем те из дикого типа на 4 недели (Рисунок 5А и 5B рисунок, откройте круг и квадрат). «Подчеркнул» Atp1a3+/...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анализ следа и поле висит тест простой и недорогой поведенческие тесты для моторной функции мышей. Эти тесты успешно обнаружил нейроповеденческих фенотипы в нескольких моделях мыши. Например, сократить длину шага в боковой амиотрофический склероз24, увеличение длины асимметричные шаг в атаксия телеангиэктазии25, увеличение продолжительности дублирования в болезни Гентингтона26 и дистонии27, и расширение базы в атаксии

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана JSP-страницы (Япония общество содействия развитию науки) KAKENHI (целевые субсидии для научных исследований C), предоставить номер 18K 07373 (Э.С.) и субсидии для частных университетов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Подвесной ящикO' Хара и Со.http://ohara-time.co.jp/products/wire-hanging-test/
Маркерная ручкаЗЕБРАМО-120-МС-БК
Ворота BoxO' Хара и Со.http://ohara-time.co.jp/products/balanced-beam-test/Принадлежности для аппаратуры для испытания сбалансированных пучков
БоксыO' Хара и Со.-Боковая стенка взлетно-посадочной полосы
Черные чернилаShin-asahi-Красные
чернилаMaruyamakogyoBC-6
Одноразовая чашка ПетриCorning351008чашки Петри (диаметр 35 мм)
Askul Multipaper Super White J Monochrome A3Askul701-712Белая бумага (29,7 см x 42 см x 0,09 мм)
50 мл Коническая трубкаCorning
КорпорацияKAKURIDIY FACTORY (K32-0313)
Сверло 430829

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Warner, T. T. Movement disorders. Practical Guide to Neurogenetics. , Elsevier Health Sciences. (2008).
  2. Brashear, A., DeLeon, D., Bressman, S. B., Thyagarajan, D., Farlow, M. R., Dobyns, W. B. Rapid-onset dystonia-parkinsonism in a second family. Neurology. 48 (4), 1066-1069 (1997).
  3. Linazasoro, G., Indakoetxea, B., Ruiz, J., Van Blercom, N., Lasa, A. Possible sporadic rapid-onset dystonia-parkinsonism. Movement Disorders. 17 (3), 608-609 (2002).
  4. Svetel, M., Ozelius, L. J., et al. Rapid-onset dystonia-parkinsonism: case report. Journal of Neurology. 257 (3), 472-474 (2010).
  5. Vrinten, D. H., Hamers, F. F. T. "CatWalk" automated quantitative gait analysis as a novel method to assess mechanical allodynia in the rat; a comparison with von Frey testing. PAIN. 102 (1), 203-209 (2003).
  6. Berryman, E. R. DigigaitTM quantitation of gait dynamics in rat rheumatoid arthritis model. Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions. 9 (2), 89-98 (2009).
  7. Beare, J. E., Morehouse, J. R., et al. Gait analysis in normal and spinal contused mice using the TreadScan system. Journal of Neurotrauma. 26 (11), 2045-2056 (2009).
  8. Rushton, R., Steinberg, H., Tinson, C. Effects of a single experience on subsequent reactions to drugs. British Journal of Pharmacology and Chemotherapy. 20, 99-105 (1963).
  9. Lee, C. C., Peters, P. J. Neurotoxicity and behavioral effects of thiram in rats. Environmental health perspectives. 17, 35-43 (1976).
  10. van der Zee, C. E., Schuurman, T., Traber, J., Gispen, W. H. Oral administration of nimodipine accelerates functional recovery following peripheral nerve damage in the rat. Neuroscience Letters. 83 (1-2), 143-148 (1987).
  11. Leroy, T., Stroobants, S., Aerts, J. -M., D'Hooge, R., Berckmans, D. Automatic analysis of altered gait in arylsulphatase A-deficient mice in the open field. Behavior Research Methods. 41 (3), 787-794 (2009).
  12. Sango, K., McDonald, M. P., et al. Mice lacking both subunits of lysosomal beta-hexosaminidase display gangliosidosis and mucopolysaccharidosis. Nature Genetics. 14 (3), 348-352 (1996).
  13. Deacon, R. M. J. Measuring the Strength of Mice. Journal of Visualized Experiments. (76), e2610(2013).
  14. Djamshidian, A., Lees, A. J. Can stress trigger Parkinson's disease? Journal of Neurology, Neurosurgey, and Psychiatry. 85 (8), 879-882 (2014).
  15. Brashear, A., Dobyns, W. B., et al. The phenotypic spectrum of rapid-onset dystonia-parkinsonism (RDP) and mutations in the ATP1A3. Brain. 130 (Pt 3), 828-835 (2007).
  16. Kirshenbaum, G. S., Saltzman, K., Rose, B., Petersen, J., Vilsen, B., Roder, J. C. Decreased neuronal Na+,K+-ATPase activity in Atp1a3 heterozygous mice increases susceptibility to depression-like endophenotypes by chronic variable stress. Genes, Brain and Behavior. 10 (5), 542-550 (2011).
  17. DeAndrade, M. P., Yokoi, F., van Groen, T., Lingrel, J. B., Li, Y. Characterization of Atp1a3 mutant mice as a model of rapid-onset dystonia with parkinsonism. Behavioral Brain Research. 216 (2), 659-665 (2011).
  18. Sugimoto, H., Ikeda, K., Kawakami, K. Heterozygous mice deficient in Atp1a3 exhibit motor deficits by chronic restraint stress. Behavioral Brain Research. 272, 100-110 (2014).
  19. Zimprich, A., Garrett, L., et al. A robust and reliable non-invasive test for stress responsivity in mice. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 125(2014).
  20. Buynitsky, T., Mostofsky, D. I. Restraint stress in biobehavioral research: recent developments. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 33 (7), 1089-1098 (2009).
  21. Ikeda, K., Satake, S., et al. Enhanced inhibitory neurotransmission in the cerebellar cortex of Atp1a3-deficient heterozygous mice. The Journal of Physiology. 591 (13), 3433-3449 (2013).
  22. Crawley, J. N. Motor functions. What's Wrong with My Mouse?. , John Wiley & Sons. (2007).
  23. R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. Available from: https://www.R-project.org/ (2014).
  24. Wils, H., Kleinberger, G., et al. TDP-43 transgenic mice develop spastic paralysis and neuronal inclusions characteristic of ALS and frontotemporal lobar degeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3858-3863 (2010).
  25. Eilam, R., Peter, Y., et al. Selective loss of dopaminergic nigro-striatal neurons in brains of Atm-deficient mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (21), 12653-12656 (1998).
  26. Lin, C. -H., Tallaksen-Greene, S., et al. Neurological abnormalities in a knock-in mouse model of Huntington's disease. Human Molecular Genetics. 10 (2), 137-144 (2001).
  27. Dang, M. T., Yokoi, F., et al. Generation and characterization of Dyt1 ΔGAG knock-in mouse as a model for early-onset dystonia. Experimental Neurology. 196 (2), 452-463 (2005).
  28. Glynn, D., Drew, C. J., Reim, K., Brose, N., Morton, A. J. Profound ataxia in complexin I knockout mice masks a complex phenotype that includes exploratory and habituation deficits. Human Molecular Genetics. 14 (16), 2369-2385 (2005).
  29. Becker, E. B. E., Oliver, P. L., et al. A point mutation in TRPC3 causes abnormal Purkinje cell development and cerebellar ataxia in moonwalker mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (16), 6706-6711 (2009).
  30. Heck, D. H., Zhao, Y., Roy, S., LeDoux, M. S., Reiter, L. T. Analysis of cerebellar function in Ube3a-deficient mice reveals novel genotype-specific behaviors. Human Molecular Genetics. 17 (14), 2181-2189 (2008).
  31. Kirshenbaum, G. S., Dawson, N., et al. Alternating hemiplegia of childhood-related neural and behavioural phenotypes in Na+,K+-ATPase α3 missense mutant mice. PLoS ONE. 8 (3), e60141(2013).
  32. Klein, A., Wessolleck, J., Papazoglou, A., Metz, G. A., Nikkhah, G. Walking pattern analysis after unilateral 6-OHDA lesion and transplantation of foetal dopaminergic progenitor cells in rats. Behavioral Brain Research. 199 (2), 317-325 (2009).
  33. Geldenhuys, W. J., Guseman, T. L., Pienaar, I. S., Dluzen, D. E., Young, J. W. A novel biomechanical analysis of gait changes in the MPTP mouse model of Parkinson's disease. PeerJ. 3 (Pt 7), e1175(2015).
  34. Cecchi, M., Khoshbouei, H., Morilak, D. A. Modulatory effects of norepinephrine, acting on alpha1 receptors in the central nucleus of the amygdala, on behavioral and neuroendocrine responses to acute immobilization stress. Neuropharmacology. 43 (7), 1139-1147 (2002).
  35. Chu, X., Zhou, Y., et al. 24-hour-restraint stress induces long-term depressive-likephenotypes in mice. Scientific Reports. 6, 32935(2016).
  36. Freeman, M. L., Sheridan, B. S., Bonneau, R. H., Hendricks, R. L. Psychological Stress Compromises CD8+ T cell control of latent herpes simplex virus type 1 infections. The Journal of Immunology. 179 (1), 322-328 (2007).
  37. Lauretti, E., Di Meco, A., Merali, S., Praticò, D. Chronic behavioral stress exaggerates motor deficit and neuroinflammation in the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Translational Psychiatry. 6, e733(2016).
  38. Quartermain, D., Stone, E. A., Charbonneau, G. Acute stress disrupts risk assessment behavior in mice. Physiology and Behavior. 59 (4-5), 937-940 (1996).
  39. Bannon, D. The Behavioural effects of stress and aluminum toxicity on a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis Parkinsonism-dementia complex. , 1-186 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи