Измерение ремоделирования костей и воссоздания микроокружения опухоли и кости с использованием кокультуры Кальварии и гистоморфометрии

Summary

Ex vivo культуры костных explants может быть ценным инструментом для изучения физиологии костей и потенциальной оценки препаратов в костной ремоделирования и костных заболеваний. Представленный протокол описывает подготовку и культуру кальварии, изолированных от новорожденных черепов мышей, а также их применение.

Abstract

Кость представляет собой соединительную ткань, образовавизированную из остеобластов, остеоцитов, остеокластов и минерализованной внеклеточной матрицы, что придает ей силу и гибкость и позволяет выполнять свои функции. Кость постоянно подвергается воздействию различных стимулов, которые в патологических условиях могут дерегулировать ремоделирование костей. Для изучения биологии костей и заболеваний и оценки потенциальных терапевтических агентов, было необходимо разработать в пробирке и in vivo моделей.

Данная рукопись описывает процесс вскрытия и культурные условия кальварии, изолированные от неонатальных мышей для изучения формирования костей и микроокружения костной опухоли. В отличие от моделей in vitro и in vivo, эта модель ex vivo позволяет сохранять трехмерную среду ткани, а также клеточное разнообразие кости при культивации в определенных условиях для имитации желаемой микросреды. Таким образом, можно исследовать костной ремоделирования и ее механизмы, а также взаимодействия с другими типами клеток, таких как взаимодействие между раковыми клетками и кости.

В анализах, представленных здесь, используются кальварии от 5-7-дневных мышей BALB/C. Полученные геми-кальвары культивируются в присутствии инсулина, раковых клеток молочной железы (MDA-MB-231), или обусловленной среды от культур раковых клеток молочной железы. После анализа было установлено, что инсулин индуцировал новое формирование костей, в то время как раковые клетки и их обусловленная средняя индуцированная резорбция костей. Кальвариальная модель успешно используется в фундаментальных и прикладных исследованиях для изучения развития костей и онкологических заболеваний костей. В целом, это отличный вариант для легкого, информативного и недорогого асссе.

Introduction

Кость является динамической соединительной ткани, которая имеет несколько функций, в том числе поддержку мышц, защиты внутренних органов и костного мозга, а также хранения и высвобождения кальция и факторов роста^1,2. Для поддержания целостности и правильной функции костная ткань постоянно находится в процессе ремоделирования. В общих чертах цикл ремоделирования костей можно разделить на костную резорбцию и формирование костей^1. Дисбаланс между этими двумя фазами ремоделирования костей может привести к развитию костных патологий. Кроме того, такие заболевания, как рак молочной железы, часто влияют на целостность костей; примерно более 70% пациентов на поздних стадиях имеют или будут иметь метастазы в кости. Когда раковые клетки молочной железы попадают в кости, они влияют на метаболизм костей, что приводит к чрезмерной резорбции (остеокластические поражения) и/или образованию (остеобластные поражения)³.

Чтобы понять биологию костных заболеваний и разработать новые методы лечения, необходимо понять механизмы, связанные с ремоделированием костей. В исследованиях рака, важно исследовать процесс метастазировать костей и его отношение к метастатической микросреды. В 1889 году Стивен Пэджет предположил, что метастазы возникают, когда есть совместимость между опухолевыми клетками и целевой ткани, и предположил, что метастатический сайт зависит от сродни опухоли для микросреды⁴. В 1997 году и Гиз ввели концепцию порочного цикла метастаз костей, чтобы объяснить, как опухолевые клетки модифицируют микроокружение костей для достижения их выживания и роста, и как микроокружение кости способствует их росту, предоставляя кальций и факторы роста^5,6,7.

Для характеристики механизмов, связанных с ремоделированием костей и метастазами костей, и для оценки молекул с возможным терапевтическим потенциалом, необходимо разработать модели in vitro и in vivo. Тем не менее, эти модели в настоящее время представляют собой множество ограничений, таких как упрощенное представление микроокружения кости, и их стоимость^8,9. Культура костных экскультур explants ex vivo имеет то преимущество, что поддерживает трехмерную организацию, а также разнообразие костных клеток. Кроме того, можно контролировать экспериментальные условия. Модели explant включают культуру плюсневых костей, бедренных головок, calvarias, и mandibular или trabecular сердечников¹⁰. Преимущества моделей ex vivo были продемонстрированы в различных исследованиях. В 2009 году Nordstrand и сотрудники сообщили о создании модели кокультуры, основанной на взаимодействии между клетками костей и рака предстательной железы¹¹. Кроме того, в 2012 году Кертин и его коллеги сообщили о разработке трехмерной модели с использованием ex vivo cocultures¹². Цель таких моделей ex vivo – как можно точнее воссоздать условия микроокружения костей, чтобы иметь возможность охарактеризовать механизмы, участвующие в нормальной или патологической ремоделировании костей, и оценить эффективность новых терапевтических агентов.

Настоящий протокол основан на процедурах, опубликованных Гарретт^{омичем и} Мохаммадом и др.¹⁴. Неонатальные мыши кальварии культуры были использованы в качестве экспериментальной модели, так как они сохраняют трехмерную архитектуру кости в стадии разработки и костных клеток, в том числе клеток на всех стадиях дифференциации (т.е., остеобласты, остеокласты, остромальные клетки), которые приводят к зрелым остеокластам и остеообластов, а также минерализованной матрицы¹⁴. Модель ex vivo не представляет патологический процесс костных заболеваний полностью. Тем не менее, влияние на костной ремоделирования или рак индуцированного костного остеолиза могут быть точно измерены.

Кратко, этот протокол состоит из следующих шагов: вскрытие calvarias от 5-7 дней мышей, кальварии прекультуры, кальварии культуры приложений (например, культура в присутствии инсулина, раковых клеток или условных среды, и даже агентов с терапевтический потенциал, в соответствии с целью исследования), фиксация костей и декальцинации кальварии, обработка тканей, гистологический анализ, и интерпретация результата.

Protocol

Все мыши, используемые в этих анализов были получены из BALB/c штаммов мышей, используя мужчин и женщин мышей без разбора. Предыдущие эксперименты культуры также были выполнены с использованием других штаммов, таких как FVB, швейцарских мышей, CD-1, и CSA мышей^11,12,14. Все мыши были размещены в соответствии с Национальными институтами здравоохранения (NIH) руководящие принципы, Приложение No. Процедуры с участием животных субъектов были одобрены институционального ухода за животными и использования комитета (IACUC) в Центре научных исследований и высшего образования в Энсенаде (CICESE).

1. Кальварское вскрытие

1. Стерилизовать приборы для вскрытия (например, 1 х 2 щипцы ткани зубов, прямые хирургические ножницы, рассекающие ножницы, тонко опрокинутые пинцеты, тонкий изогнутый кончик рассекающие щипцы, рассекающие щипцы, рассекающие щипцы, скальпель). Стерильная дистиллированная вода может быть использована для очистки хирургических инструментов между каждым вскрытием, а стерильные 1x PBS могут быть использованы для очистки каждой геми-кальварии.
2. Поместите стерильные приборы для вскрытия, воду, 1x PBS и необходимые материалы для проведения процедуры (например, микропипеты, осаждаемые стаканы, стерильные блюда Петри) в ламинарный капюшон.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Проведите всю процедуру в стерильных условиях.
3. Добавьте 12 мл стерильных 1x PBS в две 10 см посуды Петри.
4. Выберите щенков и поместите их рядом с капотом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вскрыть calvarias от 5-7 дней старых щенков.
5. Выберите и удерживайте мышь тщательно с помощью рассекающихщися щипц.
6. Обезглавить мышь, используя рассекающие ножницы и поместите голову в чашку Петри с PBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обезглавливание не подходит для пожилых мышей. Если эксперимент должен быть сделан со взрослыми мышами, метод эвтаназии должен быть изменен в соответствии с правилами экспериментов на животных.
7. Держите голову твердо области носа с 1 х 2 щипцвыще й 2 ткани зубов и удалить кожу над черепом, пока кальвария не видна.
8. Определите швы (т.е. сагиттал, коронал и лямбдоид) черепа на открытой кальварии.
9. Проникать кончиком микросцизоров примерно на 2 мм за швом лямбдоида и сделайте прямой разрез рядом с ним.
10. Вставьте кончик микросцизоров на задней стороне черепа. Сделайте прямой разрез вдоль дистальной стороны шва лямбдоида к корональном шву. Продолжить аналогичным образом с другими лямбдоидный шов.
11. Сделайте еще один разрез (под углом 45 градусов), чтобы соединить конец разреза, сделанного с разрезом передней фонтана.
12. Повторите шаги 1.10 и 1.11 с другим швом lambdoid.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно определить швы, чтобы сделать соответствующие сокращения и быть в состоянии выполнять адекватные встраивания и анализа данных.
13. Используйте тонкие наконечникщины, чтобы удалить кальварию и поместить его в чашку Петри. С помощью скальпеля, сделать прямой разрез из задней фонтанеля вдоль сагитального шва через корональный шов и заканчивается в передней фонтанель, чтобы получить два геми-кальварии.
14. Возьмите каждый из геми-кальварии с тонкой наконечником пинцета и поместите их в новое блюдо Петри, содержащее PBS.

2. Культура Кальварии

1. Добавьте 1 мл высокоглюкозного Среднего DMEM, дополненного 0,1% бубовой сыворотки альбумина (BSA) и 1% антибиотик/антимикот (т.е. пенициллина и стрептомицина) в колодцах 24 скважины. С тонкой кончик щипцы, забрать каждый hemi-calvaria и поместить его в колодец.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Положите геми-кальварии вогнутой стороны вниз.
2. Инкубировать геми-кальварии для 24 ч при 37 C с 5% CO₂.
3. Удалите культурную среду из каждого колодца и добавьте 1 мл свежих носителей, содержащих соединение, для тестирования или условных носителей из других клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте по крайней мере три геми-кальварии для каждой группы лечения и использовать отрицательные и положительные элементы управления.
4. Инкубировать геми-кальварии в течение 7 дней, меняя средства массовой информации каждые 2-3 дня.

3. Культура с раковыми клетками

1. Выберите чашку Петри с раковыми клетками при слиянии 80-90% и протрите их. Чтобы попробовать промывку, мыть раковые клетки 1x с помощью PBS (5 мл на 75 см² колбы), а затем инкубации в растворе HBSS, содержащем 0,05% трипсин и 0,53 мм EDTA (2 мл на 75 см² колбы).
2. Перенесите суспензию клетки в коническую трубку 15 мл и центрифугу при 800 х г в течение 5 мин при комнатной температуре (RT).
3. Удалите и отбросьте супернатант.
4. Приостановить гранулы в 2 мл DMEM, содержащий 2% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) и 1% антибиотик / антимикотический. Считайте живые клетки.
5. Присваивайте геми-кальварии каждой исследуемой группе (т.е. группе отрицательного контроля и кокультуры для анализа РНК или гистологии).
6. Удалите культуры средств массовой информации из геми-кальварии и добавить 1 мл DMEM, содержащий 2% FBS и 1% антибиотик / антимикотические дополнены или не дополнены раковыми клетками.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество ячеек, чтобы добавить может меняться в зависимости от клеточной линии испытания. С раковыми клетками, такими как MDA-MB-231 или PC-3, 500 000 клеток на хорошо работают надлежащим образом.
7. Инкубировать в течение 24 ч при 37 градусах Цельсия с 5% CO₂. Передайте каждую геми-кальварию новому колодцу, чтобы сохранить только раковые клетки, которые придерживались костной ткани.
8. Инкубировать в течение 7 дней при 37 градусах Цельсия с 5% CO₂ и менять средства массовой информации каждые 2-3 дня.

4. Фиксация

1. Вырезать квадраты бумаги ткани, чтобы обернуть геми-кальварии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Биопсия пены колодки или стальные капсулы для небольших биопсий также могут быть использованы.
2. Используйте прямые тонкой кончик щипцы, чтобы забрать каждый hemi-calvaria от sagittal шов, место на бумаге ткани, и оберните.
3. Поместите завернутый геми-кальвария внутри помечены встраивая кассету.
4. Поместите кассету в контейнер с 10% фосфат-буфером формалина.
5. Исправить 24 ч при 4 градусах Цельсия.

5. Декальциация

1. Удалить формалин, добавить 1x PBS, и агитировать ткани в течение 30 минут, чтобы промыть геми-кальварии.
2. Удалить PBS и добавить 10% EDTA (pH 8, 0,34 М).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что раствор покрывает ткани полностью.
3. Декальцифифицировать ткани в течение 48 ч при 4 градусах Цельсия.
4. Откажитесь от раствора EDTA и добавьте 1x PBS, чтобы промыть ткань.
5. Храните геми-кальварии в 70% этанола до гистологии обработки.

6. Обработка тканей

1. Обезвоживать ткани с раундами 96% этанола, 60 мин (3x), а затем 100% этанола, 60 мин (3x).
2. Замените этанол на 100% ксилена, 60 мин (3x).
3. Инкубировать кассеты в парафиновый воск, 60 мин (2x).

7. Встраивание

1. Откройте кассеты, аккуратно удалите бумажную ткань и разверните кальварию.
2. Возьмите каждую кальварию тщательно и стек все hemi-calvarias из той же группы в той же ориентации.
3. Положите парафина в форму.
4. Возьмите все геми-кальварии с щипками и поместите их в форму с sagittal шов вниз к основанию формы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ориентация геми-кальварии в плесени во время включения имеет решающее значение для получения последовательных гистологических разделов и воспроизводимых результатов, потому что эта ориентация позволит задней идентификации передней и теменной кости из calvarias и коронарный шов, облегчающий количественную оценку.
5. Отпустите щипц и убедитесь, что геми-кальварии остаются на месте.
6. Поместите помеченную кассету поверх формы и заполните ее более парафина, чтобы покрыть геми-кальварии.
7. Переместите формы на холодную поверхность.

8. Секция

1. Обрезка 500-600 мкм сагитального шва с микротомом.
2. Вырезать 4 мкм толщиной разделов, и собирать разделы необходимо.
3. Обрезать еще 300 мкм.
4. Вырезать и собрать еще шесть 4 мкм толщиной разделов.
5. Обрезать блок 300 мкм дальше и собрать больше разделов.
6. Установите разделы на стеклянные слайды микроскопа.
7. Сухие слайды на RT.

9. Окрашивание

1. Погрузите секции в 100% ксилена в течение 3 мин.
2. Погрузите в 100% этанол в течение 1 мин.
3. Слияние в 96% этанола в течение 1 мин.
4. Погрузитесь в 80% этанола в течение 1 мин.
5. Погрузите в 70% этанола в течение 1 мин.
6. Промыть в воде 3 мин.
7. Погрузите в гематоксилин в течение 3 мин.
8. Промыть в воде, пока раздел не прояснил.
9. Погрузите в насыщенный раствор карбоната лития в течение 10 сек.
10. Промыть в воде 3 мин.
11. Погрузить в 96% этанола в течение 1 мин.
12. Погрузиться в эосин в течение 3 мин.
13. Погрузитесь в 96% этанола в течение 1 мин.
14. Погрузите в 100% этанол в течение 1 мин.
15. Погрузите в 100% ксилена в течение 3 мин.
16. Добавьте некоторые на монтировку среды на слайд и защитить его с coverslip.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вы можете дополнить гематоксилин и эозин (H и E) окрашивания с терпящей устойчивостью кислоты фосфатазы (TRAP) окрашивания для оценки остеокласта и остеолиза.

10. Количественная оценка: определение области для анализа

1. Изучите разделы с низкой мощностью (т.е. 4x), чтобы определить ориентацию и швы.
2. Определите коронарный шов и определите длинную поверхность кости с одной стороны и короткую поверхность с другой.
3. Определите коронарный шов под 40-кратным увеличением и переместите два или три оптических поля от шва вдоль длинной поверхности. Захват изображений этой области для анализа.
4. Определите старую область кости и новую область кости. Eosin Y с оранжевым G пятна старой кости темнее и новой кости светлее.
5. Измерьте общую площадь кости старой и новой кости с помощью программного обеспечения Image J с помощью инструмента цветового порога. Выражение результатов как мкм².

11. Анализ данных

1. Анализ результатов с помощью статистического программного обеспечения. Значительные различия между группами могут быть определены с помощью соответствующих тестов (например, непараметрический тест Манн-Уитни U, как это делается herel).

Results

Для оценки формирования костей в кальвариальной модели мы культивировали геми-кальварии в средствах массовой информации с 50 мкг/мл инсулина. Ткань разделы были подготовлены и окрашены н И Е. В этих условиях гистология показала, что совсежся структурная целостность кондиционной кости, что позволяет идентифицировать ее различные компоненты(рисунок 1). Calvarias лечение инсулином представил увеличение количества костной ткани по сравнению с контролем

Discussion

Здесь мы описываем протокол для модели calvarial ex vivo для оценки формирования или резорбции костей и изучения взаимодействия раковых клеток с костью калвариальной мыши. Критическими шагами этой методики являются вскрытие, культура, встраивание и гистоморфеметрический анализ кальварий. Во время вскрытия кальварий, очень важно, чтобы сократить геми-кальварии в трапециевидных, так как это будет сильно облегчить ориентацию во время включения парафина. При изучении взаимодействия раковых клеток с кальвариями, важн...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 луночная клеточная культура	Corning	CLS3524
24 лунки нетканевая культура	Falcon	15705-060
2 мл криовиальная	SSI	2341-S0S
Антибиотики-антимикотические	Corning	30-004-CI
BSA	Biowest	P6154-100GR
Центрифуга	Eppendorf	22628188	Центрифуга 5810R
Покровные стекла	Corning	2935-24X50
Цитосиловая смола	Richard Allen	8310-10
DMSO		D2650-100ML
Модификация Dulbecco's Eagles Medium, с 4,5 г/л глюкозы и L-глутамина, без пирувата натрия	Corning	10-017-CV
Dulbecco's PBS (10X)	Corning	20-031-CV
Встраиваемые кассеты	Sigma	Z672122-500EA
EDTA	Golden	26400
Встраиваемая рабочая станция	Thermo Scientific	A81000001
Eosin	Golden	60600
Абсолют этанола	JALMEK	E5325-17P
Фетальная бычья сыворотка	Biowest	BIO-S1650-500
Фильтры	Corning	CLS431229
Щипцы и ножницы	LANCETA HG	74165
Формалин буферный 10%	Sigma	HT501320
Стекольные стекла 25 x 75 мм	Premiere	9105
Harris's Hematoxylin	Jalmek	SH025-13
Высокопрофильные лезвия	Thermo Scientific	1001259
Histoquinet	Thermo Scientific	813150	STP 120
Инсулин из поджелудочной железы крупного рогатого скота	Sigma	16634
Микроскоп	ZEISS	Axio Scope.A1
Microtome	Thermo Scientific	905200	МИКРОМ HM 355S
Корм для мышей, 18% прот, 2018S	Harlan	T.2018S.15
Neubauer	VWR	631-0696
Orange G	Biobasic	OB0674-25G
Парапласт		39601006
парафиновая секция Флотационная ванна	Электротермальная	MH8517X1
чашка	Петри Corning	CLS430167
Флоксин B	Probiotek	166-02072
Трипан Синий	Sigma	T8154
Trypsin-EDTA	Corning	25-051-CI
Дозатор воска	Электротермический	MH8523BX1
Ксилол	Золотой	534056-500ML