Полностью автономные характеристика и сбора данных от кристаллов биологических макромолекул

Summary

Здесь мы опишем, как использовать автоматизированной проверки и параметры сбора данных доступны на некоторых Синхротронное излучение. Ученые отправить образцы cryocooled синхротрон, дифракционные свойства проверяются, наборы данных собираются и обрабатываются и, где это возможно, структура решения осуществляется — все это без вмешательства человека.

Abstract

Высокий блеск рентгеновские лучи в сочетании с автоматизации привели к использованию излучение на базе синхротронного макромолекулярной кристаллографии рентгеновского снимка (MX) для даже самых сложных проектов в структурной биологии. Однако большинство учреждений по-прежнему требуют присутствия ученый на сайте для выполнения экспериментов. Новое поколение автоматизированных излучение, посвященный полностью автоматическая характеристика и сбор данных, недавно разработан кристаллы биологических макромолекул. Эти излучение представляют собой новый инструмент для структурных биологи на экран результаты первоначальных кристаллизации испытания и/или сбор большого числа наборов данных дифракции, без необходимости контролировать излучение самих пользователей. Здесь мы покажем, как настроить эксперимент для автоматической проверки и сбора данных, как эксперимент проводится на излучение, как обрабатываются результирующие наборы данных, и как, когда это возможно, Кристаллическая структура биологических макромолекул решена.

Introduction

Определение трехмерной структуры специфических белков имеет решающее значение в биологии. Информацию, которая является производным от делать так проливает свет на биологические функции и формы и специфика активных и/или обязательного сайтов, содержащийся в молекуле под исследование. Во многих случаях, это позволяет механизмы действий определены или, где это уместно, потенциальных терапевтических молекул, чтобы быть разработаны. MX является метод наиболее часто используется для получения структурной информации, но узкое определение оптимальных условий для получения хорошо Дифрагирующая кристаллов. Таким образом кристаллизации испытания проводятся в многочисленных различных условиях и затем проверяются, чтобы найти лучший кристаллов, которые будут использоваться для сбора данных дифракции. Автоматизация установки кристаллизации испытания¹ четко помог в этом отношении. Однако последующие шаги (то есть, монтажа кристалла, скрининг дифракции и дифракции сбора данных) обычно осуществляется вручную, занимая много времени, усилий и ресурсов. Автоматизации дифракции обследования и сбора данных поэтому, означало бы огромный выигрыш во времени и эффективности.

Чаще всего дифракции обследования и сбора данных в MX осуществляется на Синхротронное MX излучение, на котором автоматизации во многом облегчает этот процесс. Однако в большинстве случаев, это необходимо для ученого присутствовать на излучение во время эксперимента или управлять им дистанционно. Недавно новое поколение полностью автоматизированный излучение MX был развитых². Здесь пользователям не нужно присутствовать, либо физически, либо удаленно, экспериментальной сессии. Это позволяет ученым тратить больше времени на меньше повседневных задач, а не тратить весь день и часто ночи, скрининг кристаллы и сбор данных о дифракции. В мире первый полностью автоматизированный излучение является массово автоматизированный пример выбора комплексных объект (массив-1, ID30A-1)^2,3 в Европейский фонд синхротронного излучения (ESRF). Он имеет уникальный образец среды, в которой высокой емкости Дьюар содержащие образец работает в тандеме с роботизированной Пример смены, который также действует как излучение гониометр^4,5. МАССИВ-1 является ондулятор излучение с одного Фотон подсчет гибрид пикселей детектор⁶, которая работает на фиксированной длине волны 0,969 Å (12.84 кэВ) с интенсивным рентгеновского пучка (2 x 10¹² фотоны/s). Размер луча в положении образца можно регулировать между менее 10 мкм (круглый луч) до максимум 100 мкм x 65 мкм (горизонтальный, вертикальный луч размер). В среднем излучение может обработать, в полностью автоматическом моды (см. ниже), 120 кристаллы в 24 ч. Работа излучение основана на серии процессов⁷, каждое из которых принимает интеллектуальные решения, основанные на результатах предыдущих шагов в рабочем процессе, чтобы обеспечить измерение наилучших данных из образца исследуемого. В частности оценки дифракционного характеристики индивидуальный образец принимает во внимание кристалл объем и поток и обеспечивает, где кристалл больше чем рентгеновского пучка, что только лучший регион кристалла используется для последующих данных коллекции. Таким образом, дифракция наборы данных оптимизированы для максимального разрешения с свернутого излучения ущерб^2,3. Требовательных протоколы сбора данных, такие как псевдо-винтовой (многопозиционное) данных стратегий сбора для сбора данных как родной и одной длины волны аномальных дифракции (ЕАД), являются также доступны⁸.

Полностью автоматическая эксперименты на массив-1 включают криозаморозки и монтажа кристаллов на горе магнитные образца, подходит для желаемого излучение оборудование стандарта булавки позвоночника⁹, ввод желаемой экспериментальной параметров в ' дифракции план ' таблица в комплексной системе кристаллография протеина излучение (ISPyB)¹⁰, веб-информационная система управления для MX экспериментов и отправка образцов в излучение. В Европейский центр синхротронного излучения, все расходы по перевозке образцов из излучение поддерживаются ESRF пользователя Office (см. веб-сайт ESRF¹¹ для подробной информации). МАССИВ-1, никаких ограничений на размер петли или качество хрусталя. При выборе плана дифракции на данный кристалл, пользователь может либо использовать параметры по умолчанию или выбрать из определенных рабочих процессов, которые могут быть настроены для каждого образца. Доступны несколько предопределенных рабочих процессов. В рабочем процессе³ MXPressEсодержащие образец цикла сначала выравнивается в положение образца с помощью оптических центрирования. Затем рентген-основе центрирование гарантирует, что лучший регион кристалл центрируется рентгеновского пучка. Стратегии сбора данных затем рассчитываются с помощью eEDNA, фреймворк для разработки приложений на основе плагина специально для онлайновых данных анализа в области рентгеновского эксперименты, принимая во внимание кристалл объем и реального времени поток на излучение. После завершения сбора набора данных полной дифракции это затем обрабатываются с помощью ряда автоматической обработки данных трубопроводов¹² и результаты доступны для проверки и загрузки в ISPyB. Процесс³ MXPressE саднаправлена на селенометионина содержащих кристаллы целевого белка и использует тот факт, что операционных энергия массив-1 это просто выше края Se K. Здесь, стратегия сбора данных eEDNA MXPressE оптимизирована для сбора ГРУСТНО данных (т.е. Высокая избыточность и с резолюцией, установить туда, где R_{слияния} между парами Bijvoet ниже 5%). На экране свойства дифракционных серии кристаллов без последующего сбора, Рабочий процесс³ MXScoreможет использоваться производить полный качества оценки анализируются кристаллов. В рабочем процессе³ MXPressI180 °, вращение данных собраны с помощью 0,2 ° колебания и начальный угол фи и резолюции, определяется eEDNA стратегии. MXPressO ³ включает в себя preobserved резолюции в рабочий процесс (по умолчанию: d_мин = 2 Å). Чтобы сделать первоначальную оценку кристаллов, результате кристаллизации суда, предлагается³ рабочий процесс MXPressM. Это выполняет сетку высок дозы сканирования более широкую ориентацию образца поддержки без сбора данных или центровки. Недавно два новых процессов эксперимент, MXPressP и MXPressP_SAD, которые выполняют pseudohelical данных коллекции, было реализовано⁸. Выполнение всех этапов в всех рабочих процессов может следовать онлайн и в реальном времени пользователем, с помощью ISPyB.

Здесь мы покажем, как подготовить полностью автоматизированный MX эксперимент в массив-1 и как извлекать и анализировать данные, получаемые от эксперимента. В качестве примера мы используем человека митохондриальной глицин расщепления системы белка H (GCSH). Этот липоевая кислоты, содержащий белок является частью системы расщепления глицин, ответственность за ухудшение глицина. Эта система также включает в себя P белка, пиридоксаль фосфат зависимых глицин декарбоксилаза, T белка, требующих тетрагидрофолата фермента и L белков, lipoamide дегидрогеназа. GCSH передает группе метиламина глицина из белка P T белка. Дефекты в протеине H являются причиной nonketotic hyperglycinemia (NKH) в люди¹³.

Protocol

Примечание: Производства, очистки и кристаллизации GCSH описаны в дополнительных файлов 1.

1. Краткое описание автономный подготовки и монтажа кристалла

1. Положение петлю нейлона или другой кристалл опора уже фиксированной контактный позвоночника под один или несколько кристаллов и избавить их от осадков раствора (20 мкл 0,5 М натрия Формиат рН 4,0 + 25 мкл раствора белка).
   1. Удалите жидкость оптом вокруг crystal(s) прикоснувшись к горе с фитилем бумаги для сосать у любой избыток жидкости.
2. Замочите crystal(s) в криозащитных раствор, содержащий осадков физраствора плюс 30% глицерина; затем удалите кристалл поддержки и crystal(s).
   1. Удалите жидкость оптом вокруг crystal(s) прикоснувшись к горе с фитилем бумаги для сосать у любой избыток жидкости.
3. Горе в пучину позвоночника флакон заполнен жидким азотом и хранить его, наряду с другими кристаллами, аналогичным образом подготовлен, в Европейской лаборатории молекулярной биологии (ЕЛМБ) / ESRF sample changer шайбу⁹ при температуре жидкого азота.
   Примечание: Crystal(s) являются стабильными в этом состоянии до тех пор, пока beamtime доступен.

2. с просьбой beamtime на массив-1

1. Запрос beamtime как можно скорее на главной странице Европейский центр синхротронного излучения (в http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying).
   Примечание: Существует ряд возможных режимов доступа к ESRF MX излучение. Лаборатории могут коллективно применяться как часть из блока распределения группы (мешок), иметь beamtime, выделенных для 2 лет. Если группы желают применять отдельно, они могут применяться для прокатки доступ, что позволяет им быстрый доступ к излучение после коллегиального обзора. Предложение группы будут рассмотрены и одобрены ESRF группы безопасности, которые может запросить дополнительную информацию. Если предложение будет принято, будет сообщаться эксперимент номер и пароль. Собственные исследования может выполняться путем покупки beamtime.
2. Заполните необходимые безопасность онлайн обучение (в http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/SafetyTraining).
3. Книга beamtime на календаре массив-1.
   Примечание: Это можно заказать максимум 50 держатели образца для анализа за смену.
4. Заполните формы A объявить почты в эксперименте (http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/new-a-form), вместе со сведениями о безопасности, для образцов, которые должны быть измерены.

3. Создание плана дифракции в ISPyB

Примечание: Дифракции план содержит всю информацию, необходимую для образца в ISPyB и может содержать дополнительную информацию, чтобы адаптировать эксперимент выполняется для каждого образца.

1. Открыть ISPyB (в https://exi.esrf.fr/).
2. Выберите MX экспериментов.
3. Войдите в систему эксперимент номер и пароль.
4. Нажмите на перевозки | Добавить новые и предоставлять необходимую информацию. Нажмите кнопку сохранить.
5. Нажмите кнопку Добавить посылку и заполните всю необходимую информацию. Нажмите кнопку сохранить.
6. Затем нажмите кнопку добавить контейнер, дайте шайбу штрих-код как имя и выберите позвоночника шайбу. Нажмите кнопку сохранить.
7. Нажмите на символ контейнера и редактироватьи заполните необходимую информацию, как имя белка, предпочитаемый рабочий процесс, кристалл позиции в шайбу, и т.д., касающихся образцов.
8. Выберите белок (например, GCSH или лизоцима), который был одобрен группой безопасности Европейский центр синхротронного излучения.
9. Введите уникальный образец имя для идентификации каждого индивидуального образца. Это позволяет при необходимости сканировать штрих-код PIN-код. Остальная часть приводимая ниже информация является необязательным.
10. Введите дополнительные сведения.
    1. Для каждого индивидуального образца, введите тип эксперимент (то есть, MXPressE_SAD, оценка или MXPressO, и т.д., по умолчанию MXPressE) под Exp. типа. Это определяет, какие автоматический бизнес-процесс будет использоваться для обработки каждого кристалла. Учитывая, что кристаллы GCSH иглы, выберите MXPressP.
    2. Введите группу пространства (например, C2, P1 и P2₁2₁2₁), если он известен. Если он присутствует, это будет использоваться для вычисления стратегии сбора данных и доступных конвейеров автоматической обработки данных.
    3. Введите требуемое разрешение (по умолчанию: d_мин = 2.0 Å). Это определяет расстояние кристалл детектор для первоначального сетки сканирование, характеристика и сбора данных по умолчанию.
    4. Установите желаемый порог разрешение (например, 1,5 Å или 2.3Å), для предотвращения сбора полного наборов данных из кристаллов, которые не преломлять этот предел. Это может сэкономить время пространства и анализа хранения данных.
    5. Установка требуемой полноты (по умолчанию: 0.99). Установите требуемый кратности (по умолчанию: 4). Если более чем один кристалл содержится на образце поддержку, задать максимальное количество кристаллов для анализа. Значение по умолчанию равно 1 или 5 для MXPressP.
    6. Выберите соответствующий пучка размера (по умолчанию: 50 мкм). Если определенное значение не выбран, рентген-центрирование и вычисления стратегии сбора данных будет осуществляться с луч размером 50 мкм.
       Примечание: В ходе любого последующего сбора комплектов данных, размер луч будет адаптирована автоматически.
    7. Положите в группе пространстве, если известно, в столбце Группа принудительного пространства. Установите излучения чувствительность кристаллов (0,5 – 2,0 для низкой до высокой чувствительности, значение по умолчанию 1).
11. При необходимости задайте угол поворота всего собираться для полного набора данных коллекции (по умолчанию: угол поворота всего, определяется eEDNA).
12. Сохраните значения. Нажмите на возвращение в поставках. Нажмите отправить груз в Европейский центр синхротронного излучения.
13. Печать этикетки судоходства и отправить образцы. Пользователям следует организовать пикап с курьером, используя данные учетной записи, Европейский центр синхротронного излучения.
    Примечание: Очень важно выбрать Включить возврат лейбл разрешить бесшовной возвращение образцов (см. https://www.esrf.eu/MXDewarReimbursement).

4. сбор данных, просмотр и поиск

Примечание: В день эксперимента, образцы передаются в массив-1 Дьюар высокой емкости (HCD). Излучение ученых затем Запуск сбора данных, которая может сопровождаться пользователям удаленно. Для каждого типа различных образцов пользователи получают сообщение электронной почты, информирующее о том, что сбор данных начался. Как отмечалось ранее, выполнение всех этапов в всех рабочих процессов может следовать онлайн и в реальном времени от пользователя через ISPyB, от которой можно просмотреть и загрузить результаты.

1. Для каждого образца, проанализированы изучите результаты автоматического эксперимент в ISPyB (https://exi.esrf.fr/).
   1. Войти в систему, используя эксперимент номер и пароль и нажмите на желаемый экспериментальной сессии на ID30A-1.
   2. Выберите предпочтительный (Топ озвучивание) autoprocessing трубопровод (например, гранаты или XDS_APP) и загрузить данные записываются в группе правильное пространство с высоким полноты и высоким разрешением, нажав на Последние результаты сбора и Затем, скачать.
      Примечание: Все сетки, линии и характеристик изображения находятся в подкаталоге для каждого образца, называется /MXPressE_01. Европейский центр синхротронного излучения автоматически выполняется пять отдельных обработки пакетов, а именно: EDNA_proc¹², гранаты¹², XDS_APP¹⁴, автоматически выполняемой¹⁵и XIA2¹⁶. Интеграция данных основана на XDS, за исключением XIA2, который основан на ЦИФЕРБЛАТАХ. Все пакеты также запускаются в аномальных и nonanomalous режимах, позволяя автоматическое обнаружение аномальных сигнала, если они присутствуют в данных, использоваться в САДЕ, поэтапного протоколы. Каждый пакет использует различные параметры и деревья принятия решений, что означает, что некоторые пакеты работать лучше с некоторых образцов. Однако это может сделать для большого числа результатов, когда учитывается количество пакетов и возможное пространство групп. Таким образом, результаты оцениваются примерно на основе резолюции и другие качества метрик, таких как R_{слияния} в низкие резолюции оболочки, CC(1/2) и полноты. Это, направленные на руководство пользователя для лучших наборов данных, но все возможное пространство групп и результаты должны быть проверены тщательно.
2. Распакуйте загруженный папку, которая будет включать в себя все файлы журналов и необъединенных XDS_ASCII. Слияния и масштабных .mtz файлы и HKL.
   Примечание: В случае, если структура (в формате PDB) протеин интереса или закрыть гомолога был загружен на ISPyB в начале эксперимента, autoprocessing трубопровода в Европейский центр синхротронного излучения будет автоматически выполнять молекулярные замена (MR) выполняются с использованием этой структуры, как модель поиска на лучшее озвучивание решение. Результаты Мистер конвейера отображаются в ISPyB и можно найти в папке обработанных данных (например, /data/visitor/mx2112/id30a1/20180711/PROCESSED_DATA/GCSH/GCSH-x5/autoprocessing_GCSH-x5_run1_1/grenades_fastproc/user_nohet.pdb_ mrpipe_dir /). Здесь окончательная модель будет называться coot1.pdb и отражения данных sidechains.mtz. Обратите внимание, что трубопровод может снизить симметрии ячейки (сокращение на примитивные клетки) для того, чтобы повысить вероятность нахождения решения. В случае здесь Мистер трубопровода написал решение в ячейке моноклинная (C2), а не в камеру ромбическая (₁C222). Подробная информация о том, как выполнять молекулярные замену вручную запустить (примером является второй наиболее скоринга решения autoprocessing) включены в Дополнительные файлы.

Results

MXPressP рабочий процесс был использован на излучение ESRF массива-1 полностью автоматически, монтировать, центр в рентгеновского пучка, характеризуют и собирать наборы данных полный дифракции из серии кристаллов человеческого GCSH. Образцы были смонтированы и цикла проанализированы для области для сканирования (рис. 1, слева). После анализа дифракции были отобраны четыре точки внутри кристалла для сбора данных (рис. 1, право). Последующей обработки автоматизированной базы данных анализа трубопроводов, включая MR трубопровода, принесли высокого качества наборов данных (Таблица 1) для которого г-н решение было найдено. Последний позволяет пользователям быстро оценить ли полученный набор данных и используется поиск модели подходят для постепенной замены молекулярного. Кроме того присутствие лигандов можно судить, позволяя пользователю сосредоточиться только на наиболее перспективных наборов данных для дальнейшего анализа. Структура руководства определение MR принесли Карта плотности электронов высокого качества после того, как единый автоматизированный цикл уточнения (Рисунок 2a). Для этого набора данных автоматизированный конвейер вырезать данные на 1,32 Е резолюции; Однако пользователи могут по-прежнему решили сократить данные на более низкое разрешение прибыть в различных качества статистики (CC R_1/2, < I/σ(I) >,_МПС) в оболочке высокой резолюции. Кристаллическая структура человеческого GCSH структура аналогична говядину белка (3KlR)¹⁶.

Непрерывная Электронная плотность является видимым для всего аминокислот цепи, помимо N-терминальный гистидина. Из четырех замен, которые отличают человека и говядину GCSH три легко узнаваемы в плотности электронов (Иль/Val66, Asp/Glu98 и леи/Phe149; Рисунок 2b -d). Это менее ясно для замены Asp/Lys125, для которых Электронная плотность боковой цепи только частично решены за счет гибкости (Рисунок 1e). В настоящее время полученные модель R_работы и_{свободного} значения R 20,4% и 23,8%, соответственно и может быть оптимизирован путем дальнейшего циклы автоматической и ручной модель здания и изысканности.

	ГРАНАТЫ конвейер	XDS_APP конвейер
Сбор и обработка данных
Рентгеновский источник / ширина линии	ЕВРОПЕЙСКИЙ ЦЕНТР СИНХРОТРОННОГО ИЗЛУЧЕНИЯ / МАССИВ-1
Длина волны (Е)	0,966
Резолюция (Å)	41,88 – 1,48 (1.53 – 1,48)	41.86-1,32 (1,39-1,32)
Всего/Unique размышления	127670 / 28644	177332 / 40134
	(12178 / 2775)	(23772 / 5714)
Группа пространства для индексации, масштабирование и слияния	C222	C2221
Размеры ячейки
а, b, c (Å)	42.20, 83,75, 95,85	42.19, 83.72, 95,82
Mosaicity	0.05	0.05
RМЭС (%)	10.0 (110,7)	11.1 (198.2)
< I/σ(I) >	9.6 (1.3)	7.6 (0,7)
CC1/2 (%)	99,7 (53.9)	99,7 (19,1)
Полнота (%)	99,6 (99,6)	99.5 (98,6)
Кратность	4.5 (4.4)	4.4 (4.2)
Молекулярные замена и уточнение предварительные модели
Группа пространства для постепенного	C2	C2221
Размеры ячейки
а, b, c (Å)	83.74, 42,18, 95.82	42.19, 83.72, 95,82
Α, Β, Γ (°)	90, 90.03, 90	90, 90, 90
Поиск Модель MR (PDB)	3KLR	3KLR
Белковых молекул / ASU	2	1
Остатки белка	250	125
Rработы/rбесплатно (%) после 1-й уточнения	24.3 / 26,5	20.4 / 23.8
Длина RMSD Бонд (Е) после 1 уточнение	0.01	0.01
Угол RMSD Бонд (°) после 1 уточнение	1.2	1.83
Rotamer выброс (%) после 1-й уточнения	1.07	4.29
Рамачандран предпочтение/разрешено/запрещено (%) после 1-й уточнения	95,93 / 4.07 / 0	95.12 / 4.88 / 0

Таблица 1: Статистика сбор, уточнения и проверки данных рентгеновской дифракции. Значения для высоких оболочки резолюции приводятся в скобках.

Рисунок 1: пример анализа до сбора данных. (A) регион, выбранный для сканирования отображается красная рамка. (B) анализ снимков дифракции показано как карту жары. Для сбора данных были отобраны четыре позиции в пределах расположен кристалл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: Visual проверки карт плотности электронов, полученные после уточнения. Карт плотности электронов горизонталями на 2 x уровень r.m.s. вокруг () Trp143, (b) Val66 (Иль в человека GCSH) и (c) Glu98 (Asp в человека GCSH) и карты контурные 1 x r.m.s уровень вокруг (d) Phe149 (Leu на человека GCSH) и (e) Lys125 (Asp в человека GCSH). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Полностью автоматическая излучение обеспечивают автоматизированная характеристика и сбора данных от большого числа макромолекулярных кристаллы без присутствия ученого, либо на излучение или удаленно, требуется. Использование полностью автоматизированных излучение имеет множество преимуществ по сравнению с ручной работы. Для пример, автоматизированных образец центрирование, основанные на сетку рентгеновского и линия сканирует, является более точным, чем выполняемой с человеческим глазом как он не зависит от тепловых или оптические эффекты. Действительно, эти сетки и линии сканирования обеспечивают дополнительные данные (т.е., подробные размеры кристалла и лучших Дифрагирующая региона кристалла), которые имеют важное значение при определении правильного пучка размера использовать для сбора данных, особенно для мелких кристаллов ¹⁸— и часто приводят к повышению качества данных, полученных дифракции. Кроме того воспользовавшись пользовательских параметров в настройке автоматической экспериментов, шаги в определенных рабочих процессов могут быть приспособлены к лучше всего подходят для системы под исследование, таким образом, дальнейшая оптимизация успеха эксперимента.

Вместе, принимая надежность рабочих процессов, доступных, прямой доступ к излучение (пользователи самостоятельно планировать, используя календарь [см. выше]) и полностью автоматизированный подход массив-1 обеспечивает строгий, высокой пропускной способности и экономия времени альтернатива классической практических экспериментов MX и потенциал для реализации более сложных процедур и приложений в автоматические процессы. В ближайшем будущем кристалл картографии в 3D¹⁹ будет осуществляться для повышения точности рентгеновского центрирования, в то время как более сложные протоколы, такие как кристалл обезвоживания эксперименты²⁰, будет автоматизирован. Ожидается, что сбор полностью автономных данных станет стандартным методом в MX, обеспечивая высокое качество данных для экранов мелкомолекулярных фрагмент, оптимизация скрининг большого числа плохо Дифрагирующая кристаллов и автоматически предоставляя фаза Информация для решения кристалл структур de novo. В сочетании с событиями в автоматизированного сбора кристаллов²¹возможность решения структуры кристалла белка как автоматизированный сервис вполне может стать реальностью.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beamline MASSIF-1	ESRF
BL21DE3	New England Biolabs	C2527I
хлорамфеникол	Roth	3886.1
Концентраторы: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K	Merck Millipore	UFC803024
Dialyzing Membrane	Spectrumlabs	132655
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Dnase	Roche	11284932001
DTT	Euromedex	EU0006-B
EDTA- ингибиторы протеазы без протеазы	Roche	4,693,159,001
глицерин	VWR Chemicals Prolabo	14388.29T
His-trap HP	GE healthcare	17-5247-01
имидазол	Sigma-Aldrich	56750-500G
IPTG	Euromedex	EU0008-B
LB средний	Sigma-Aldrich	L3022
липоевая кислота	Sigma-Aldrich	T5625
петля	Hampton Research	HR8-124
лизоцим	Roche	10 837 059 001
MonoQ 5/50 GL	GE здравоохранение	17-5166-01
NaCl	Fisher Chemical	S/3160/60
Акустическая вибрационная ячейка 75/15	SONICS
SPINE шайбы	MiTeGen	Артикул: M-CSM003-0001A
Трис база	Euromedex	26-128-3094-B
Формиат натрия	Sigma-Aldrich	1064430500
GCSH буфер для очистки	20 мМ TRIS pH 8, 200 мМ NaCl
GCSH криозащитный буфер	0,25 М Формиат натрия pH 4, 30% глицерин
Программы:
MxCube		Gabadinho, J. et al. MxCuBE : среда управления синхротронным пучком, адаптированная для экспериментов по кристаллографии макромолекул. Журнал синхротронного излучения. 17 (5), 700-707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010)	местная разработка
ISPyB	ESRF	Solange Delageniè re, Патрис Бреншеро, Людовик Лаунер, Алан В. Эштон, Рикардо Леаль, Sté Фани Вейриер, José Габадиньо, Элспет Дж. Гордон, Сэмюэл Д. Джонс, Карл Эрик Левик, Seá n М. МакСвини, Sté Фани Монако, Макс Нанао, Даррен Спрус, Улоф Свенссон, Мартин А. Уолш, Гордон А. Леонард; ISPyB: информационная система управления для синхротронной макромолекулярной кристаллографии, Биоинформатика, том 27, выпуск 22, 15 ноября 2011 г., страницы 3186-3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535	локальная разработка
MXCube2	ESRF	Gabadinho, J. et al. MxCuBE : среда управления синхротронным лучом, адаптированная для экспериментов по кристаллографии макромолекул. Journal of Synchrotron Радиация. 17 (5), 700-707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone,Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19), 24-226 (2014).	Местное развитие
	рабочих процессов BES	Brockhauser, S. et al. Использование рабочих процессов при планировании и проведении сложных экспериментов в высокомолекулярной кристаллографии. Acta Crystallographica, раздел D: Биологическая кристаллография. 68 (8), 975-984, doi: 10.1107/S090744491201863X (2012).
DOZOR	ESRF	Буренков и Попов, неопубликованная	локальная разработка
BLISS beamline control		Guijarro, M. et al. BLISS - Управление экспериментами для ESRF EBS Beamlines. Труды 16-й Международной конференции по ускорителям и большим экспериментальным системам управления, ICALEPCS2017, Барселона, Испания. DOI: 10.18429/jacow-icalepcs2017-webpl05 (2018).	Местное развитие
AUTO обработка изображений		Monaco, S. et al. Автоматическая обработка данных рентгеновской дифракции высокомолекулярной кристаллографии в ESRF. Журнал прикладной кристаллографии. 46 (3), 804-810, doi: 10.1107/S0021889813006195 (2013)	местное развитие
BEST и EDNA		Incardona, M.-F., Bourenkov, G.P., Levik, K., Pieritz, R.A., Popov, A.N., Svensson, O. EDNA : фреймворк для приложений на основе плагинов, применяемых для онлайн-анализа данных рентгеновского эксперимента. Журнал синхротронного излучения. 16 (6), 872-879, doi: 10.1107/S0909049509036681 (2009).	Местное развитие
CCP4		Winn, M.D. et al. Обзор набора CCP 4 и текущих разработок. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 235-242, doi: 10.1107/S0907444910045749 (2011).
Phaser MR		McCoy, A.J., Grosse-Kunstleve, R.W., Adams, P.D., Winn, M.D., Storoni, L.C., Read, R.J. Phaser кристаллографическое программное обеспечение. Journal of Applied Crystallography. 40 (4), 658-674, doi: 10.1107/S0021889807021206 (2007).
Coot		Emsley, P., Cowtan, K. Coot: инструменты построения моделей для молекулярной графики. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60, 2126-32 (2004).
refmac5		Муршудов, Г.Н., Вагин, А.А., Додсон, Э.Д. Уточнение макромолекулярных структур методом максимального правдоподобия. Acta Crystallographica Section D. 53, 240--255 (1997).
Мэтьюз		Мэтьюз Б.В. Содержание растворителей в кристаллах белка. Журнал молекулярной биологии. 33 (2), 491-497 (1968).