Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Расширенный визуализации легких самонаведения человека лимфоцитов в экспериментальной модели Vivo аллергические воспаления, основанный на свет лист микроскопия

7.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59043

⸱

16 апреля 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine 1, University Hospital of Erlangen, 2Department of Medicine 3, University Hospital of Erlangen

В этой статье

Краткое содержание

Здесь представлен протокол позволяет характеристика самонаведения емкости легких первичного человека лимфоцитов в естественных условиях воспалительные условиях. Легких инфильтрации восприимчивую передаваемых человека иммунокомпетентных клеток в мышиной модели аллергические воспаления может образы и количественно микроскопии флуоресцирования свет лист химически очищенной легочной ткани.

Аннотация

Подавляющее ткани накопление высоко активации иммунных клеток представляет отличительной чертой различных хронических воспалительных заболеваний и стала привлекательным терапевтического клинического управления пострадавших пациентов. Для дальнейшей оптимизации стратегии, направленные на терапевтические регулирования инфильтрации патологически несбалансированным ткани про воспалительных иммунных клеток, он будет иметь особое значение для достижения улучшения идеи в конкретных заболеваний и органа самонаведения свойства периферических лимфоцитах. Здесь описаны экспериментальный протокол позволяет отслеживать накопление легкого дневно обозначенные и восприимчивую передаются лимфоцитах человека в контексте папаин индуцированной воспаления легких. В отличие от стандартных анализов в пробирке часто используется для анализа миграции иммунных клеток и хемотаксис параметр теперь введено в естественных условиях учитывает легких специфические аспекты организации ткани и влияние комплекса воспалительных сценарий, происходящие в живом организме мышиных. Кроме того микроскопических изображений трехмерных поперечного сечения флуоресценции свет лист не только представить количественные данные о проникают в клетки иммунной системы, но также изображает шаблон локализации иммунных клеток в воспаление легких. В целом мы в состоянии внедрить инновационные техники высокого значения для иммунологических исследований в области хронических воспалительных легочных заболеваний, которые могут быть легко применены следуя предоставленного шаг за шагом протокол.

Введение

Классический воспалительные заболевания легких, такие как аллергическая астма и хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), хорошо известны управляться путем увеличения найма активированных лимфоцитов в легочной ткани1,2. Лимфоцит выпущена цитокинов (например, Ил-4, Ил-5, IL-9, IL-13, ИФН γ и TNF-α) далее содействовать хемотаксис врожденного и адаптивного иммунных клеток, побудить фиброзных сократимость реконструкции или непосредственно повреждения паренхимы легких2. До настоящего времени основные механизмы, ответственные за патологического накопления лимфоцитов в легочной ткани еще не понял полностью. По аналогии с импринтинг ткани селективный Т-клеток, описанные для кожи и кишки самонаведения, легочной дендритных клеток (DCs) способны очевидно премьер периферийные клетки T для проникновения преференциальных легких, по крайней мере частично через индукции CCR4 выражение на поверхности лимфоцитов3. Помимо CCR4 проникают в дыхательные пути Т-клетки характеризуются особенно увеличение выражение хемокиновых рецепторов CCR5 и CXCR3, по сравнению с Т-клеток в периферической крови1,4,5. В целом, существующих данных в соответствии с концепцией легких самонаведения Т-лимфоцитов при физиологических или воспалительные условиях предполагает целый ряд различных хемокиновых рецепторов и их соответствующих лигандов и таким образом в решающей степени зависит тесно контроль взаимодействия между врожденного и адаптивного иммунные клетки1. Особенно на начальном этапе патогена или аллерген воздействия клетки иммунной системы отвечают стимуляции TLR или IgE опосредованной cross-linking немедленного освобождения различные chemoattractants, как LTB4, CCL1, CCL17, CCL22, CCL20, CXCL10 и ПГД2в1,6,7. Как яркий пример взаимодействие между ПГД2 и хемотаксического рецептора CRTh2 как известно, имеют особое значение для хемотаксис Th2 клетки и таким образом появилась как многообещающие терапевтические цели в клиническому ведению астмы. Действительно у пациентов с умеренной астмы показали улучшение симптомов и значительное увеличение объема принудительного выдоха в одну секунду (ОФВ1) после лечения с селективный антагонист CRTh2, по сравнению с группой плацебо8 ,9. В состоянии более продвинулись воспалительной реакции уже набранных Т-клетки способны далее усиливать легочной лимфоцитов накопления через выпуск Ил-4 и IL-13 как мощные стимулы для легких DCs. Впоследствии эти врожденной клетки миелоидного производный вверх регулируют выражение CCL17 и CCL22 в STAT6-зависимых образом1,10,11.  Хотя сложность описан сценарий по-прежнему препятствует полное понимание Т-клеток легких самонаведения, он предлагает множество молекулярных целей для элемента потенциально оптимизированный лечебный воспалительным или аллергическим легочных заболеваний. Таким образом существует настоятельная необходимость новаторских экспериментальных методов, которые способны далее углублять и дополнить наши знания в области хемотаксис Т-клеток и легких самонаведения.

С тем, что легких самонаведения лимфоцитов в организме человека влияют несколько сотовых, гуморальный и физических параметров1, большинство существующих экспериментальных методов не способны модели всю сложность этой иммунологические процесса. Вместо этого многие стандартные протоколы анализа легких самонаведения выборочно сосредоточиться на конкретном аспекте участвующих в каскад лимфоцитов притяжения, адгезии, миграция и удержание. Помимо чисто описательного определения мРНК белка или выражению интегринов и хемокиновых рецепторов на лимфоцитах периферической или проникают в легких и дополнительные измерения соответствующих хемокиновых уровней в крови, Бронхоальвеолярный лаваж (BAL) или легочной ткани12,13,14,15, установившаяся в пробирке клеток культуры анализы позволяют функциональная характеристика лимфоцитов адгезию и хемотаксис После определенных экспериментальных условиях16,17,18. В принципе статические в пробирке адгезии анализов контролировать связывающая способность культурной лимфоциты эндотелиальной монослоя или стеклянных скольжениях покрытые рекомбинантным эндотелиальной адгезии молекулы (например, MAdCAM-1, VCAM-1), то время как стандарт в пробирке хемотаксис анализов обычно применяются для того, чтобы количественно оценить способность лимфоцитов мигрируют вдоль хемокиновых градиент в системе transwell19. Оба в пробирке параметры позволяют контролируемых перестройки и модуляции экспериментальных условиях, но с другой стороны отсутствуют важные переменные, известный критически воздействия на в-vivo хемотаксис и адгезии лимфоцитов. Преимущественно статические клетки культуры игнорировать влияние сдвига, вызванных постоянным крови поток19 и потенциально пренебрегать участия окружающих иммунологические окружение и взаимодействующих-лимфоцит иммунных клеток, Оба представляют в живом организме. Для того, чтобы преодолеть эти ограничения, интерпретацию результатов, приобретенных в статических в пробирке хемотаксис или присоединение анализы требуют дальнейшего проверки в динамических адгезии экспериментов под поток условий20,21 и в в VIVO модели воспалительных орган патологии19. Действительно важные выводы о регулировании Т-клеток легких самонаведения воспалительным или аллергическим условиях от животных исследования анализа генетически изменены мышей в определенных моделей различных легочных заболеваний3, 22 , 23. количественные сравнения легких, проникнув лимфоцитов между wildtype мышей и мышей с дефицитом для конкретных генов интерес представляет устоявшихся и широко используемый инструмент для определения воздействия конкретных сотовых пути или рецепторов на болезнь управляемый характер распределения Т-клеток. Однако в отличие от к до обсуждения в пробирке клеток культуры анализов, Дизайн исследования, основанные на классических моделях животных не хватает возможности для анализа и мониторинга первичных человеческих клеток T непосредственно вытекает из крови или бал пациентов, страдающих от воспалительных легких болезни. Таким образом она по-прежнему остается сложным функционально проверить ли диагностически указанного легкое заболевание способна запечатлеть лимфоцитах человека для преференциального легких тропизма и насколько клинические параметры могут повлиять на этот сценарий. Недавно очень элегантный подход в естественных условиях была введена в контексте воспалительные заболевания кишечника (IBD), который был в состоянии преодолеть большую часть этих ограничений и открыла новые возможности для передовых исследований трансляционного на кишечные лимфоцитов самонаведения24 . Воспользовавшись протоколов для очистки ткани на основе растворителя, следуют поперечного сечения свет лист флуоресцентной микроскопии как мощный инструмент визуализации, можно было визуализировать проникновения и распространения восприимчивую передаваемых человеческих клеток T в кишечнике colitic иммунодефицитных мышей24. В частности, этот экспериментальный параметр реализованы две главные нововведения: (1) основного человеческого иммунные клетки могут быть проанализированы в экспериментально определенных условиях в естественных условиях; (2) довольно большой площади больного органа (около 1,5 х 1,5 см) может отражаться в высоким разрешением качества, следуют 3D-реконструкции. Кроме того некоторые недавние исследования успешно установлено использование ткани на основе растворителя очистки и микроскопии флуоресцирования свет лист как важные инструменты для передовых легких изображений25,26. Для того, чтобы выгоду от этого технологического прогресса в области легких иммунологии, мы сейчас приняли системы для анализа легких самонаведения.

Здесь представлены протокол предусматривает поэтапное введение как для очистки и дневно этикетке первичной человека T клетки для передачи в мышей с индуцированного легочного воспаления и, Кроме того, подробно описывает процесс последующего света-листа флуоресценции микроскопических изображений, включая подготовку орган и обработки изображений. В целом мы надеемся на поддержку будущих трансляционного исследования в области воспалительным или аллергическим легочных заболеваний путем введения сложных, но тем не менее возможно, Экспериментальная модель для мониторинга самонаведения легких человека лимфоцитов на условиях, в естественных условиях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Эксперименты с участием животных были проведены в соответствии с протоколами, утвержденных соответствующими местными властями в Эрлангене (Regierung фон Унтерфранкен, Вюрцбург, Германия). Мышей были размещены при определенных условиях возбудителя бесплатно. Сбор крови человека был одобрен местной этического Комитета и институциональных Наблюдательный Совет Университета Эрланген-Нюрнберг. Каждый пациент дал письменное информированное согласие.

1. вызвать воспаление аллергические легких у мышей

Примечание: Как описано в предыдущих исследований27, следующая экспериментальная процедура позволяет, вызывая воспаление аллергических дыхательных путей у мышей и, соответственно, вызывает накопление врожденного и адаптивного иммунные клетки в поле Бал. В мышей C57BL/6J был создан описывается протокол, но принятие других стандартных инбредных штаммов должно быть возможным.

Смотрите Рисунок 1A для резюме в естественных условиях экспериментальной процедуры.

  1. Анестезировать мышей внутрибрюшинной инъекцией кетамина/Ксилазина.
    Примечание:     использовать только мышей C57BL/6J старше 6 недель и массой тела по крайней мере 16 g.
    1. Подготовка раствора кетамина/Ксилазина в PBS (12 мг/мл кетамина; Ксилазина 1,6 мг/мл) и определить точный вес мышей.
    2. Придать первая мышь с 8 мкл/г веса раствора кетамина/Ксилазина внутрибрюшинно и подтвердите глубокой анестезии через отсутствие рефлекс щепотку лапы прежде чем приступить к шаг 1.3.
  2. Свеже Подготовьте 5 мг/мл папаин в PBS. Медленно Пипетка 10 мкл (50 мкг) папаин раствора в ноздрю. Тщательно контролировать мышь до пробуждения.
  3. Повторите шаги с 1.1 и 1.2 для всех мышей, включены в эксперимент. Выполните шаги 1.1 – 1.3 на три дня подряд.

2. очистить и дневно обозначить человека периферической крови CD4 клеток T+

Примечание: Процесс клетки в стерильных условиях.

  1. Сбор 18 мл крови полного человека от периферических вен. Чтобы выбрать часть мононуклеаров периферической крови (КСДОР) выполните Ficoll-Hypaque градиентного центрифугирования.
    Примечание: Сбор и анализ первичного человеческого материала должны быть утверждены местными властями этические. Только человек с адекватной медицинской квалификации разрешено собирать кровь от периферических вен.
    1. Сбор крови в Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)-содержащих monovettes (1,6 мг ЭДТА/мл крови) для того, чтобы избежать коагуляции.
      Факультативного: Используйте Баффи пальто крови, побочный продукт донорства крови, обогащенный в лейкоцитах, вместо полного венозной крови.
    2. Передача крови в конической 50 мл трубки и разбавить 1:2 в-фосфатный буфер (PBS). Аккуратно добавить 10 мл Ficoll-среды (плотность 1,077 г/мл) как нижний слой под разбавленной крови. Центрифугуйте образцы (800 x g 15 мин при комнатной температуре без тормозов).
    3. Осторожно извлеките трубку из центрифуги и передачи КСДОР содержащих интерфаза в новые конические 50 мл трубки. Отказаться от верхнего и нижнего слоя. Заполните КСДОР содержащих трубки с PBS и центрифуги (300 x g 10 мин при температуре 4 ° C). Удалите супернатант.
      Примечание: При необходимости при необходимости, выполните лизис оставшихся эритроцитов. Аккуратно добавьте 3 мл буфера lysis (ACP) аммония хлорид калия (хлорид аммония 155 мм; 19 мм калия водорода карбонат и 0.68 мм ЭДТА рН 7.27) Пелле ресуспензированы клеток и вихревой образца. Встряхните трубы 3 мин. Чтобы удалить буфер lysis ACP, добавьте 40 мл PBS и центрифуги (300 x g 10 мин при температуре 4 ° C). Выбросите супернатант.
  2. Очистить CD4 клеток+ T через микрошарики CD4.
    Примечание: В общем, есть несколько дистрибьюторов магнитных микрошарики для очистки человека CD4+ клетки, которые должны привести к сопоставимые уровни чистоты клеток. Выбор продукта должны основываться на индивидуальных предпочтений. Следующие действия протокола (2.2.2–2.2.7) настраиваются для определенного продукта microbead CD4 и соответствующего разделения столбцов как далее указано в Таблица материалов. Некоторые модификации протокола может потребоваться в случае, что выбран альтернативный продукт microbead CD4.
    1. Ресуспензируйте КСДОР Пелле в минимум 80 мкл PBS, содержащий 0,5% плода бычьим сывороточным (ФБС) и 2 мм ЭДТА (PBS/FBS/ЭДТА буфер) на 107 КСДОР. Использование начального населения около 30 х 106 КСДОР для конца вверх с приблизительно6 3 x 10-6 x 106 очищенного человека CD4+ T клетки.
    2. 20 мкл CD4 микрошарики на 107 КСДОР, осторожно перемешать и проинкубируйте втечение 20 мин при 4 ° C. Заполните трубу с PBS/FBS/ЭДТА буфера (охлаждением до 4 ° C) и центрифуги (300 x g 10 мин при температуре 4 ° C). Удалите супернатант.
    3. Поместите разделения столбца в магнитном поле. Промойте столбец с 3 мл PBS/FBS/ЭДТА-буфера. Ресуспензируйте Пелле клеток в 500 мкл PBS/FBS/ЭДТА буфера (охлаждением до 4 ° C) и передачи суспензию клеток на столбце промыть разделения внутри магнитного поля.
    4. Промойте разделения столбцов три раза с 3 мл PBS/FBS/ЭДТА-буфера (охлаждением до 4 ° C) и отменить очищенные сточные воды.
    5. Удалите столбец разделение из магнитного поля и поместите его в 15 мл. Элюировать CD4+ часть клеток в 5 мл PBS/FBS/ЭДТА буфера с помощью плунжера.
    6. Заполните трубу с PBS и центрифуги (300 x g 10 мин при температуре 4 ° C). Удалите супернатант. Повторите этот шаг Стиральная дважды.
    7. Определите количество приносят клетки стандартным методом выбора (например, Нойбауэр палата).
  3. Ярлык CD4 клеток+ T с распространением краска люминесцентные клеток.
    1. Ресуспензируйте CD4+ T-клеток в PBS (вплоть до 107 кл/мл; не используйте меньше, чем 500 мкл PBS).
    2. Приготовляют раствор 6 мкм пролиферации красный свет возбудимых клеток красителя (см. Таблицу материалы) в PBS (предварительно разогретую до комнатной температуры). Смешайте это решение 1:2 с до подготовил суспензию клеток и вихревой тщательно (3 мкм конечная концентрация).
    3. Проинкубируйте втечение 10 мин при 37 ° C (защищенный от света). После этого, добавьте пять томов RPMI среды, содержащие 10% FBS и инкубировать в течение 5 минут на льду (защищенный от света).
    4. Мыть помечены клетки три раза в RPMI средних с 10% FBS (центрифуги на 300 x g 10 мин при температуре 4 ° C). Ресуспензируйте помечены клетки в PBS, хранить на льду и защищать от света до использования.
      Примечание: Длительное хранение клеток (> 60 мин) может отрицательно сказаться на выживание клетки.
      Факультативного: Определить чистоту CD4+ сотовый дроби и эффективность процедуры маркировки подачей cytometry. Ресуспензируйте 0,5 x 106 до 1 x 10-6 CD4+ клеток в 100 мкл буфера (1% FBS, 2 мм ЭДТА в PBS) и добавить антитело против человека CD4 в сочетании с Люминесцентная краска выбора. Инкубируйте 30 мин при 4 ° C. Добавьте 1 мл буфера и центрифуги (300 x g 10 мин при температуре 4 ° C). Выбросите супернатант. Продолжить с измерением потока гранулярных образца (представитель результат изображен на рисунке 1B, C).

3. восприимчивую передачи человека CD4+ T-клеток в папаин облученных получателя Mmice

Примечание: Смотрите Рисунок 1A для резюме в естественных условиях выполнена экспериментальная процедура. Переноса клеток через один день после последнего интраназального введения папаин.

  1. Отрегулируйте подвеска дневно обозначенные человека CD4+ T клетки (шаг 2.3.4) к концентрации 1 x 107 кл/мл в PBS. Заполнить 100 мкл суспензии клеток в 1 мл/30 G-шприц.
  2. Осторожно поместите первый папаин облученных C57BL/6J мышь (шаги 1.1 – 1.3) в удерживающего устройства для инъекции Вену хвост. Используйте подготовленный шприц (шаг 3.1) для прокола Вены хвост и медленно залить 100 мкл суспензии клеток, содержащих 1 х 106 ярлык человека CD4+ клеток. Сразу не вытащить иглу, после инъекции, но ждать еще 5 секунд для того, чтобы предотвратить сброс суспензию клеток.
  3. Отпустите кнопку мыши из удерживающего устройства и приступить к следующему животного. Сохраните по крайней мере один папаин облученных животных, которые не проходят передачи с дневно обозначенные клетки в качестве отрицательного контроля для микроскопии флуоресцирования свет лист.

4. Подготовьте легочной ткани для микроскопии флуоресцирования свет лист

Примечание: Следующие шаги выполняются 3 ч после передачи дневно помечены клетки человека (шаг 3.2). Описанные экспериментальной процедуры, включая заготовки из легочной ткани, фиксации и ткани на основе растворителя очистки были адаптированы в настоящее время описано протоколы24,28.

  1. Пожертвуйте мыши вдыханием двуокиси углерода (C02).
  2. Perfuse легких на месте с PBS, содержащих 5 мм ЭДТА.
    1. Откройте грудной клетки через разрезания вдоль грудины подвергать сердце. Пунктата правого желудочка с 21 G канюля подключен к катетер.
    2. Откройте левого желудочка, резки и тем самым позволит кровь и перфузии жидкость для выхода. Медленно perfuse легких с 20 мл ледяной PBS, содержащих 5 мм ЭДТА через катетер.
  3. Чтобы выполнить на месте крепления легких, не удалить катетер из правого желудочка. Медленно perfuse легких с 2 мл ледяной параформальдегида 4% (PFA) решена в PBS. Удаление катетера и канюли.
    Примечание: PFA-основанные на месте крепления легочной ткани представляет устоявшихся техника для того, чтобы подготовить мышиных легочной ткани для последующего анализа микроскопических29,30.
    ОСТОРОЖНОСТЬЮ: PFA токсичных и обрабатываться под капотом с осторожностью.
  4. Заполните легких с 0,75% агарозном на месте.
    1. Подготовить 0,75% агарозы в PBS и держать его твердых при 50 ° C в термо шейкер до использования. Удаление слюнные железы мыши, вырезать sternohyoid мышц и разоблачить трахеи, двигая щипцы под.
    2. Перемежать подвергаются трахеи с иглой 30 G и заменить его катетером тупым 30 G для предотвращения дальнейших повреждений трахеи, что приводит к нежелательной утечки агарозы. Уплотнение стыке вставить катетер и трахеи, применением иглодержателя.
      Факультативного: Комбинат, здесь описывается процедура с бал коллекции для анализа проникли клетки человека в бал, как недавно описана в деталях31 (см. Рисунок 2E для представителя результаты).
    3. Тщательно заполните дыхательных путей с 0,75% агарозном (охлаждается до температуры тела) через катетер до полного разворачивается легких; ждать до полного затвердевания агарозы. Удаление катетера и тщательно урожай легких потемнело 2-мл пробирку, заполнены с 4% PFA.
  5. Для дополнительной фиксации инкубации образца в 4%, PFA решена в PBS в течение 2 ч при температуре 4 ° C под непрерывной ротации (31/мин).
  6. Обезвоживания тканей, впоследствии инкубации образца под непрерывной ротации (31/мин) при 4 ° C 50% этанола (рН 9), 70% этанола (рН 9) и 100% этанола; Каждый шаг по крайней мере 4 часа. В конце выполните второй инкубации в свежих 100% этанола за 4 ч.
  7. Выполните на основе растворителя очистки ткани с помощью этилового метилэкгоина (ECi). Таким образом передача образца в ECi. Инкубируйте на ночь при комнатной температуре (под постоянной ротации), до тех пор, пока ткань появляется полупрозрачный (см. рис. 1D для представителя изображений).
    Примечание: Образцы, хранящиеся в ECi при комнатной температуре (защищенный от света) являются стабильными в течение нескольких недель до месяцев.

5. Выполните микроскопии флуоресцирования свет лист Wwhole мышиных долей легких

Примечание: Пожалуйста, смотрите Таблицу материалов для деталей на свет лист флуоресцентным микроскопом и соответствующее программное обеспечение, на которых основаны следующие шаги. Сопоставимых систем других производителей, однако, может использоваться также с изменениями конкретного разработчика следующих протокола. Прежде чем начать, ознакомьтесь с Микроскоп конкретные инструкции по эксплуатации и следуйте инструкциям технических ответственным лицом на сайте.

  1. Настройка Микроскоп свет лист.
    1. Включите свет лист микроскоп и откройте соответствующий изображений на компьютере. Заполнить образец камеры с отфильтрованной ECi (100 мкм фильтр) и поместите его в своей позиции между лазерных лучей.
    2. Используйте небольшое падение органических растворителей stable клея придерживаться легких для держателя образца. Чтобы сохранить как можно меньше глубина необходимые проникновения света-листов, установите доли легких вертикально. Далее Поместите держатель образца в своей камере.
    3. При использовании ECi как очистка реагент, установите преломления цели до 3,5.
  2. Настройте параметры на Микроскоп свет лист для выявления клеток человека в контексте всего органа.
    1. Выберите требуемый лазеры (Фильтр для измерения > активировать флажки требуется лазеров) и выбрать соответствующие интенсивностей в программное обеспечение управления (лазерной передачи управления > Используйте ползунок, чтобы установить лазерного света > применить). Используйте возбуждения волны 488 нм (525/50 фильтр) для обнаружения autofluorescent легочной ткани и 640 Нм (680/30 фильтр) для возбуждения клеток человека обозначено с Флюорофор, излучающих в красной области спектра.
    2. Сосредоточиться на образце возбужденных в 488 нм и адаптировать фокус через инструмент «хроматической коррекции» на возбуждения волны 640 Нм (Используйте ползунок, чтобы задать хроматической коррекции > применить).
    3. Выберите соответствующий масштаб; Используйте малое увеличение обзор (например, 6.3 x) чтобы определить общее распределение помеченных клеток в легочной ткани и увеличенного изображения (например, 32 x) для подробного локализации.
    4. Выберите ширину листа равномерно выяснения весь орган или конкретный раздел интереса (Оптика > Используйте ползунок, чтобы задать ширину листа; обычно между 20-40%). Определить числовой апертуры листа (NA) с выше NA, создавая более четкие изображения (Оптика > Используйте ползунок, чтобы установить лист NA; для мышиных легких доли, расширил ее физиологической размера NA 0,025% часто может быть использован).
    5. Выберите количество света листов для использования под «дополнительные измерения параметров». В случае двунаправленной освещения, слияние левой и правой свет листы для создания образа содержанием однородно подсветкой (Дополнительно > слияния lightsheets > выберите режим наложения > использовать ползунки для определения совпадения обоих свет листы).
      Примечание: Рекомендуется воспользоваться двунаправленный освещение образца с тремя свет листов каждый.
      Факультативного: Для дальнейшего повышения качества изображения, используйте операцию динамического фокуса. Это позволяет переместить фокус в x направлении во время захвата изображений.
    6. Определите начальное и конечное положение z стек, чтобы быть измерены и задать размер шага до 5 мкм (xyz таблицы Z > Сканировать диапазон).
      Примечание: Начальную и конечную позиции z-стека зависят от размера и позиционирования доли легких в зале образца. Однако около 300 – 800 z стеки обычно приобретаются для одного легкого лепестка (размер шага 5 мкм).
    7. Сохранение файлов с помощью «Автосохранение настройки» и начать измерения для захвата изображения. После окончания сбора данных Очистите держатель ECi загрязненных образцов и камеры под проточной водой.
      Примечание: Используйте те же параметры для изображения несколько легких лопастями, которые должны сопоставляться потом.

6. пост обработка изображений и количественная оценка накопленных легкого клеток человека

Примечание: Пожалуйста, смотрите Таблицу материалов для деталей после обработки изображений программное обеспечение для 3D анализа, на которых основаны следующие шаги. Однако также могут использоваться альтернативные после визуализации программного обеспечения.

  1. Загрузить первое изображение z-стека (активировать кнопку surpass, файл > Открыть > выберите изображение) для того, чтобы инициировать открытие всех других изображений выбранного z стека и их автоматическая 3D реконструкции.
  2. Чтобы обеспечить правильное отображение x, y и z измерения, проверьте voxel размеров и корректировать их в случае необходимости (Редактировать > Свойства изображения > вручную ввести voxel размер). Для размера voxel z введите выбранный размер шага между двумя изображениями (здесь 5 мкм).
  3. Отображение каждого канала в собственный цвет (Редактировать > Показать настройку экрана). Нажмите на каждый канал, один за другим, чтобы определить цвет по выбору (в рисунке 2A, B, C, D аутофлюоресценция сигнал отображается в сером цвете и помечены человека CD4+ клеток в красном).
  4. Регулировка интенсивности, уровень черного и контрастности для каждого канала (Редактировать > Показать настройку экрана) с использованием треугольников в Швеллер или введя точные цифры в настройках канала. Для регулировки интенсивности используйте прямоугольный треугольник. Для черный регулировка уровня используйте левый треугольник и для регулировки контраста, используйте среднего треугольника.
    Примечание: Использование легких производным от мышь управления без передачи (шаг 3.3) ячейки для различения конкретных человеческих клеток, полученных сигналов и неспецифическим фон.
  5. Для количественного определения помеченных клеток в легочной ткани использовать «добавить новые пятна» в панели инструментов и выберите пропустить автоматическое создание, редактирование вручную для ручной клеток подсчета.
    Примечание:     в качестве альтернативы используйте автоматическое ячейку подсчета инструмент под «места». Однако ручной подсчет позволяет различать сигналы конкретные и неспецифическим более точно.
    1. Чтобы сравнить накопления клеток человека через различные образцы, определить куб легких с определенного тома с использованием 3D режущего инструмента (Редактировать > обрезать 3D) (здесь 813 мкм x 813 мкм x 1,000 мкм).
    2. Для подсчета накопленных ячейки выберите 640 Нм канала и определить «радиус шкалы» 10 мкм. Затем нажмите на «редактировать», проверьте «выберите» в меню указатель и Марк каждой ячейки с точкой через shift клик с левой кнопкой мыши. Найти общее количество подсчитанных клеток, отображается в статистике.
      Примечание: Настоятельно рекомендуется рассчитывать несколько кубов за доли легких (здесь пять) для обеспечения достоверности результатов и компенсации отбора ученый зависимых подсчитанных легких тома (количественная оценка стратегии и представитель результаты изображены в Рисунок 2D).
  6. Захват изображения с помощью инструмента «снимок» и/или принимать видео с помощью инструмента «анимация». Сохранить файлы как файлы .ims скорректированы (Файл > Экспорт).
    Примечание: Для представителя целей Показать или скрыть рамку, установив или сняв кадр на панели инструментов. Кроме того, дисплей фото либо как проекция максимальной интенсивности (ПМС) (инструментов > Громкость > режим > проверить MIP) или использовать «поверхности режим» (инструментов > Добавить новые поверхности). «Поверхности режим» должно быть активировано отдельно для каждого канала, чтобы выделить ткани архитектуры и/или клеток органов (представитель изображения показаны на рис. 2C).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Представленные протокол описывает экспериментально мыши модель, которая позволяет мониторинга и количественной оценки накопления восприимчивую передаваемых человеческий Т-лимфоцитов в легких через свет лист флуоресцентной микроскопии. Рисунок 1 A обеспечивает Схематический обзор в естественных условиях шагов экспериментальный график. Для того чтобы гарантировать надежные результаты, это существенное значение для обеспечения хорошего качества из изолированных и дневно помечен...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь описаны экспериментальной установки обеспечивает возможность контролировать самонаведения емкости легких первичных человеческих иммунных клеток при воспалительных процессов в естественных условиях и таким образом уместно дополняет классическом исполнении в пробирке адгезию и хемотаксис анализов. Принимать во внимание особенности конкретных анатомический орган легкя, важные аспекты иммунных клеток, самонаведения (включая хемотаксис и клеток распределения в рамках органа-мишени), а также ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

М.ф. Нейрат были служил советником для Pentax, Джулиани, MSD, Abbvie, Янссен, Такэда и Boehringer. Остальные авторы не раскрывают любого конфликта.

Благодарности

Авторы с благодарностью признаем, финансирование DFG совместных научно-исследовательских центров SFB 1181 и TRR 241. Оптических изображений центра Эрлангена (ОНИС) и в частности Ральф Палмисано, Филипп Tripal и Тина Fraaß (проект Z2 DFG CRC 1181) признал экспертов техническую поддержку для света лист флуоресценции микроскопических изображений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Agarose NEEO UltraCarl Roth GmbH + Co. KG, Карлсруэ, Германия2267.4
AlexaFlour594 антитело к человеку CD45BioLegend, Сан-Диего, США304060
Хлорид аммонияCarl Roth GmbH + Co. KG, Карлсруэ, ГерманияK2981
Канюля 21 гBecton, Dickinson and Company, Франклин Лейкс, США301300
Клеточный пролиферационный краситель eflour670eBioscience Inc., Сан-Диего, США65-0840-85
CD4 MicroBeads, человекMiltenyi Biotech GmbH, Бергиш-Гладбах, Германия130-045-101
ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота)Carl Roth GmbH + Co. KG, Карлсруэ, Германия8043.1
Пробирка для сбора крови калий-ЭДТА, 9 млSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Германия21066001
Ethly cinnamate (ECi)Sigma-Aldrich, Steinheim, Германия112372-100G
Этанол > 99.5% (EtOH)Carl Roth GmbH + Co. KG, Карлсруэ, Германия5054.3
FBS (фетальная бычья сыворотка) Good FortePAN-Biotech GmbH, Айденбах, ГерманияP40-47500
Filter 100 µ М VWR International Germany GmbH, Дармштадт, Германия732-2758
Imaris Image Analysis Software 9.0.2Bitplane AG, Цюрих, Швейцарияn.a.ImspectorPro
softwareAbberior Instruments GmbH, Gö ttingen, Германияn.a.Ketamin
 Inresa Arzneimittel GmbH, Фрайбург, Германия3617KET-V
LaVision UltraMicroscope IILaVision BioTec GmbH, Билефельд, Германияn.a.MACS
MultiStandMiltenyi Biotech GmbH, Бергиш-Гладбах, Германия130-042-303
Канюля Multifly 20 GSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Германия851638035
игла 30 G B. Braun Melsungen AG, Мельзунген, Гессен, Германия9161502
счетная камера NeubauerneoLab Migge GmbH, Гейдельберг, ГерманияC-1003
Pattex GlueHenkel AG & Co, Dü ссельдорф, ГерманияPSK1C
LS колонкаMiltenyi Biotech GmbH, Бергиш-Гладбах, Германия130-042-401
Среда для разделения лимфоцитов (плотность 1,077 г/мл)anprotecAC-AF-0018
PapainMerck1,071,440,025
PBS Dulbecco (фосфатно-солевой буфер)Biochrom GmbH, Берлин, ГерманияL182-10
PerCP/Cy5.5 античеловеческий CD4BioLegend, Сан-Диего, США 317428
PerCP/Cy5.5 мышь IgG2b, κ изотип CtrlBioLegend, Сан-Диего, США400337
PFA (параформальдегид)Carl Roth GmbH + Co. KG, Карлсруэ, Германия0335.1
Гидрокарбонат калияCarl Roth GmbH + Co. KG, Карлсруэ, ГерманияP7481
Серологическая пипетка 10 млSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Германия86.1254.001 
Шприц 1 млB. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Германия9166017V
Шприц 5 млBecton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, США260067
Шприц 20 млBecton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, США260069
Tube 1,5 млSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Германия72,706,400
Tube 2 млSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Германия72.695.400 
Тюбик 2 мл, коричневыйSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Германия72,695,001
Tube 15 mLSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Германия62.554.502 
Тюбик 50 млSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Германия62.547.254 
Сепаратор QuadroMACSMiltenyi Biotech GmbH, Бергиш-Гладбах, Германия130-090-976
Ксилазин (Ромпун 2%)Bayer Vital GmbH, Леверкузен, ГерманияKPOBD32

Ссылки

  1. Medoff, B. D., Thomas, S. Y., Luster, A. D. T cell trafficking in allergic asthma: the ins and outs. Annual Review of Immunology. 26, 205-232 (2008).
  2. Baraldo, S., Lokar Oliani, K., Turato, G., Zuin, R., Saetta, M. The Role of Lymphocytes in the Pathogenesis of Asthma and COPD. Current Medicinal Chemistry. 14 (21), 2250-2256 (2007).
  3. Mikhak, Z., Strassner, J. P., Luster, A. D. Lung dendritic cells imprint T cell lung homing and promote lung immunity through the chemokine receptor CCR4. Journal of Experimental Medicine. 210 (9), 1855-1869 (2013).
  4. Thomas, S. Y., Banerji, A., Medoff, B. D., Lilly, C. M., Luster, A. D. Multiple chemokine receptors, including CCR6 and CXCR3, regulate antigen-induced T cell homing to the human asthmatic airway. Journal of Immunology. 179 (3), 1901-1912 (2007).
  5. Katchar, K., Eklund, A., Grunewald, J. Expression of Th1 markers by lung accumulated T cells in pulmonary sarcoidosis. Journal of Internal Medicine. 254 (6), 564-571 (2003).
  6. Wu, Z., et al. Mast cell FcepsilonRI-induced early growth response 2 regulates CC chemokine ligand 1-dependent CD4+ T cell migration. Journal of Immunology. 190 (9), 4500-4507 (2013).
  7. Hart, P. H. Regulation of the inflammatory response in asthma by mast cell products. Immunology, Cell Biology. 79 (2), 149-153 (2001).
  8. Bice, J. B., Leechawengwongs, E., Montanaro, A. Biologic targeted therapy in allergic asthma. Annals of Allergy & Asthma & Immunology. 112 (2), 108-115 (2014).
  9. Barnes, N., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled study of the CRTH2 antagonist OC000459 in moderate persistent asthma. Clinical & Experimental Allergy. 42 (1), 38-48 (2012).
  10. Medoff, B. D., et al. CD11b+ myeloid cells are the key mediators of Th2 cell homing into the airway in allergic inflammation. Journal of Immunology. 182 (1), 623-635 (2009).
  11. Oeser, K., Maxeiner, J., Symowski, C., Stassen, M., Voehringer, D. T. T cells are the critical source of IL-4/IL-13 in a mouse model of allergic asthma. Allergy. 70 (11), 1440-1449 (2015).
  12. Freeman, C. M., Curtis, J. L., Chensue, S. W. CC chemokine receptor 5 and CXC chemokine receptor 6 expression by lung CD8+ cells correlates with chronic obstructive pulmonary disease severity. The American Journal of Pathology. 171 (3), 767-776 (2007).
  13. Kallinich, T., et al. Chemokine-receptor expression on T cells in lung compartments of challenged asthmatic patients. Clinical & Experimental Allergy. 35 (1), 26-33 (2005).
  14. Vasakova, M., et al. Bronchoalveolar lavage fluid cellular characteristics, functional parameters and cytokine and chemokine levels in interstitial lung diseases. Scandinavian Journal of Immunology. 69 (3), 268-274 (2009).
  15. Campbell, J. J., et al. Expression of chemokine receptors by lung T cells from normal and asthmatic subjects. Journal of Immunology. 166 (4), 2842-2848 (2001).
  16. Halwani, R., et al. IL-17 Enhances Chemotaxis of Primary Human B Cells during Asthma. PLoS One. 9 (12), 114604(2014).
  17. Agostini, C., et al. Cxcr3 and its ligand CXCL10 are expressed by inflammatory cells infiltrating lung allografts and mediate chemotaxis of T cells at sites of rejection. The American Journal of Pathology. 158 (5), 1703-1711 (2001).
  18. Ainslie, M. P., McNulty, C. A., Huynh, T., Symon, F. A., Wardlaw, A. J. Characterisation of adhesion receptors mediating lymphocyte adhesion to bronchial endothelium provides evidence for a distinct lung homing pathway. Thorax. 57 (12), 1054-1059 (2002).
  19. Radeke, H. H., Ludwig, R. J., Boehncke, W. H. Experimental approaches to lymphocyte migration in dermatology in vitro and in vivo. Experimental Dermatology. 14 (9), 641-666 (2005).
  20. Miles, A., Liaskou, E., Eksteen, B., Lalor, P. F., Adams, D. H. CCL25 and CCL28 promote alpha4 beta7-integrin-dependent adhesion of lymphocytes to MAdCAM-1 under shear flow. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 294 (5), 1257-1267 (2008).
  21. Zundler, S., et al. The alpha4beta1 Homing Pathway Is Essential for Ileal Homing of Crohn's Disease Effector T Cells In vivo. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 379-391 (2017).
  22. Verbist, K. C., Cole, C. J., Field, M. B., Klonowski, K. D. A role for IL-15 in the migration of effector CD8 T cells to the lung airways following influenza infection. Journal of Immunology. 186 (1), 174-182 (2011).
  23. Kopf, M., Abel, B., Gallimore, A., Carroll, M., Bachmann, M. F. Complement component C3 promotes T-cell priming and lung migration to control acute influenza virus infection. Nature Medicine. 8 (4), 373-378 (2002).
  24. Zundler, S., et al. Three-Dimensional Cross-Sectional Light-Sheet Microscopy Imaging of the Inflamed Mouse Gut. Gastroenterology. 153 (4), 898-900 (2017).
  25. Mzinza, D. T., et al. Application of light sheet microscopy for qualitative and quantitative analysis of bronchus-associated lymphoid tissue in mice. Cellular & Molecular Immunology. , (2018).
  26. Erturk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. Journal of Visualized Experiments. (89), 51382(2014).
  27. Morita, H., et al. An Interleukin-33-Mast Cell-Interleukin-2 Axis Suppresses Papain-Induced Allergic Inflammation by Promoting Regulatory T Cell Numbers. Immunity. 43 (1), 175-186 (2015).
  28. Mann, L., Klingberg, A., Gunzer, M., Hasenberg, M. Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (123), 55450(2017).
  29. Mercer, R. R., et al. Extrapulmonary transport of MWCNT following inhalation exposure. Particle and Fibre Toxicology. 10, 38(2013).
  30. Minton, C., et al. Demonstration of microvessel networks and endothelial cell phenotypes in the normal murine lung. Journal of Nippon Medical School. 72 (6), 314-315 (2005).
  31. Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), 55398(2017).
  32. Fischer, A., et al. Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
  33. Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunology. 7 (2), 118-130 (2007).
  34. Brehm, M. A., Jouvet, N., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Humanized mice for the study of infectious diseases. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 428-435 (2013).
  35. Wege, A. K. Humanized Mouse Models for the Preclinical Assessment of Cancer Immunotherapy. BioDrugs. , (2018).
  36. Jespersen, H., et al. Clinical responses to adoptive T-cell transfer can be modeled in an autologous immune-humanized mouse model. Nature Communications. 8 (1), 707(2017).
  37. Schloder, J., Berges, C., Luessi, F., Jonuleit, H. Dimethyl Fumarate Therapy Significantly Improves the Responsiveness of T Cells in Multiple Sclerosis Patients for Immunoregulation by Regulatory T Cells. International Journal of Molecular Sciences. 18 (2), (2017).
  38. Murdoch, C., Finn, A. Chemokine receptors and their role in inflammation and infectious diseases. Blood. 95 (10), 3032-3043 (2000).
  39. Rivera-Nieves, J., Gorfu, G., Ley, K. Leukocyte adhesion molecules in animal models of inflammatory bowel disease. Inflammatory Bowel Diseases. 14 (12), 1715-1735 (2008).
  40. Zundler, S., Neurath, M. F. Novel Insights into the Mechanisms of Gut Homing and Antiadhesion Therapies in Inflammatory Bowel Diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (4), 617-627 (2017).
  41. Halim, T. Y., Krauss, R. H., Sun, A. C., Takei, F. Lung natural helper cells are a critical source of Th2 cell-type cytokines in protease allergen-induced airway inflammation. Immunity. 36 (3), 451-463 (2012).
  42. Kamijo, S., et al. IL-33-mediated innate response and adaptive immune cells contribute to maximum responses of protease allergen-induced allergic airway inflammation. Journal of Immunology. 190 (9), 4489-4499 (2013).
  43. Milne, J., Brand, S. Occupational asthma after inhalation of dust of the proteolytic enzyme, papain. British Journal of Industrial Medicine. 32 (4), 302-307 (1975).
  44. Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
  45. Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. The International Journal of Biochemistry, Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
  46. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  47. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
  48. Looney, M. R., Bhattacharya, J. Live imaging of the lung. Annual Review of Physiology. 76, 431-445 (2014).
  49. Lefrancais, E., et al. The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors. Nature. 544 (7648), 105-109 (2017).
  50. Headley, M. B., et al. Visualization of immediate immune responses to pioneer metastatic cells in the lung. Nature. 531 (7595), 513-517 (2016).
  51. Hammad, H., et al. House dust mite allergen induces asthma via Toll-like receptor 4 triggering of airway structural cells. Nature Medicine. 15 (4), 410-416 (2009).
  52. Bose, O., et al. Mast cells present protrusions into blood vessels upon tracheal allergen challenge in mice. PLoS One. 10 (3), 0118513(2015).
  53. Galkina, E., et al. Preferential migration of effector CD8+ T cells into the interstitium of the normal lung. Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3473-3483 (2005).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

CD43D
Расширенный визуализации легких самонаведения человека лимфоцитов в экспериментальной модели Vivo аллергические воспаления, основанный на свет лист микроскопия
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.