Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Влияние антитела анти c-fms на формирование остеокластов и распространение остеокластов прекурсоров в пробирке

5.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59089

⸱

18 марта 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics, Department of Translational Medicine, Tohoku University Graduate School of Dentistry

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол включает диссекции мышиных длинных костей и костного изоляции, генерировать костного макрофагов и производить остеокласты, используя макрофагальный колонии стимулирующий фактор (M-CSF) и рецепторов активатор ядерного фактора Каппа-B лиганда (RANKL) или фактор некроза опухоли альфа (TNF-α) и их арест антитела анти c-fms, M-CSF рецептора.

Аннотация

Костного ремоделирования представляет собой сложный процесс, и она включает в себя периоды осаждения и резорбции. Костной резорбции представляет собой процесс, в котором кости с разбивкой по остеокласты в ответ на различные стимулы. Остеокластов прекурсоров дифференцироваться в мультипотоковый остеокласты в ответ макрофагальный колонии стимулирующий фактор (M-CSF) и рецепторов активатор ядерного фактора Каппа-B лиганда (RANKL). В патологических условиях Цитокиновый профиль отличается и включает в себя смесь воспалительных цитокинов. Фактор некроза опухоли альфа (TNF-α) является одним из наиболее важных цитокинов, как он найден в больших количествах в областях, связанных с воспалительным остеолиза. Цель настоящего Протокола заключается в предоставляют метод, по которому мышиных костного изолирован для создания остеокласты через индукции с M-CSF и RANKL или ФНО α, который будет впоследствии тормозится путем увеличения доз антител анти c-fms, рецептор для M-CSF. Этот эксперимент свидетельствует терапевтическую ценность антитела анти c-fms при заболеваниях воспалительного костную резорбцию.

Введение

Остеокласты являются высоко специализированные клетки, и они дифференцируют от гемопоэтических стволовых клеток через слияние нескольких остеокластов прекурсоров. Они имеют важное значение для здорового костного ремоделирования и способствовать патологического костной резорбции, связанных с воспалительными заболеваниями литического как ревматоидный артрит и пародонта1.

Функции Osteoclastogenesis и остеокластов опосредовано двумя ключевыми факторами; макрофагальный колонии стимулирующий фактор (M-CSF) и рецепторов активатор ядерного фактора Каппа B лиганда (RANKL). M-CSF и RANKL имеют важное значение для дифференциации остеокластов2. Еще одним фактором, который было показано, чтобы побудить остеокластов формирования от костного макрофагов в пробирке является фактор некроза опухоли альфа (TNF-α)3,4,5. ФНО α опосредованной остеокластов формирования было показано, быть критическим для остеолиза в разрушительной костных заболеваний, таких как ревматоидный артрит6, заболевания пародонта7и постменопаузальный остеопороз8.

C-ФМС это мембранных рецепторов M-CSF и опосредует его действий. Роль c-fms хорошо документированы в литературе, как это было продемонстрировано, что администрация антитело против c-fms (антитела анти c ГПС) полностью арестован osteoclastogenesis в модели артрита, а также в ФНО α индуцированной кости эрозий при osteoclastogenesis отдаленные от воспаление сустава был по-прежнему надежный9. Администрация антитела анти c-fms тормозится остеокластов формирования и костной резорбции, вызванных липополисахарида (LPS) в мыши calvariae10 также как периодонтит LPS-индуцированной модели11. Кроме того антитела анти c-fms препятствует резорбции механические стресс индуцированного корень во время ортодонтического зуб движения12, а также движение ортодонтического зуб и костной резорбции, связанные с ортодонтического зуб движения13.

M-CSF сообщило иметь другие функции, которые необходимы для иммунного ответа. Отсутствие M-CSF в op/ОП мышей с бактериальной пневмонии приведет к увеличение бактериальной нагрузки и бактериальных распространения в печень с некроз печени14. Таким образом M-CSF имеет важное значение для иммунологической реакции в защите от инфекции.

Это исследование демонстрирует эффект анти c-fms антитела на M-CSF и RANKL или ФНО α индуцированной остеокластов формирования в пробирке и M-CSF вызванного распространением прекурсоров остеокластов. Этот протокол демонстрирует изоляции клеток костного мозга мышиных от длинных костей и шаги для создания костного макрофагов (BMM), которые рассматриваются в качестве прекурсоров остеокластов и побудить дифференцировка BMM на мультипотоковый остеокласты двумя методы; RANKL или ФНО α. Протокол также сравнивает арест osteoclastogenesis в обоих методах, с помощью антител анти c-fms.

Этот процесс, по которому костного извлекается и затем используется для создания остеокластов прекурсоров является надежным в производстве большого количества чистой остеокластов культуры, которые могут использоваться в нескольких приложениях течению например тестирования на наркотики. Использование RANKL или ФНО α, чтобы побудить osteoclastogenesis в этом протоколе отличает osteoclastogenesis как физиологический процесс (RANKL) от osteoclastogenesis как патологический процесс (TNF-α), который в свою очередь обеспечивает две альтернативные процедуры для руководства решение, из которых один улучшенный с точки зрения реагентов, которые будут использоваться в нисходящие приложения. Этот протокол также предоставляет метод, который мы можем определить подходящие концентрации антител анти c-fms, который может безопасно использоваться для более поздних исследований участвующих в костную резорбцию и литического заболеваний.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все животные процедуры и уход за животными были выполнены согласно Университет Тохоку правил и положений.

1. мышиных задних конечностей диссекции и обработка

  1. До вскрытия заполнить тарелку с приблизительно 50 мл α-мкм в зависимости от размера контейнера и поместите его на льду. Это будет служить как контейнер для коллекции, до завершения вскрытие всех костей. Для этого и последующих экспериментов, используйте α-MEM содержащий 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), пенициллин G 100 МЕ/мл и 100 мкг/мл стрептомицина.
  2. Усыпить C57Bl/6J мыши при вдыхании передозировки изофлюрановая 5%.
  3. Исправьте мышь в лежачем положении, с помощью булавки, пронзили через ладони и ступни и спрей тщательно с 70% этиловом спирте.
  4. Сделать разрез кожи, используя стерильные хирургические ножницы и щипчики на уровне тазобедренного сустава и продлить его до подвергая мышцы ног.
  5. Вырежьте сухожилие, придавая четырехглавой мышцы и сухожилия, придавая мышцы подколенного сухожилия кости. Удаляйте мышцы, подвергая тазобедренного и коленного суставов. Обнаружение этих сухожилий облегчит освобождая обе мышцы от их вложений не выходя из мягких тканей Теги. Не нарезать кости.
  6. Поместите ножницы между головку бедренной кости и суставной щели и нарезать его освобождение бедренной кости, но сохранении кости. Это позволит отряд костей без риска предоставления костного мозга.
  7. Аналогичным образом отрежьте мышцы, придавая голени. Вырежьте свободной от своей привязанности голени на голеностопный сустав, сохраняя кости нетронутыми, чтобы избежать загрязнения.
  8. Очистите любые оставшиеся мягких тканей от бедра и голени, используя ножницы пилы и kimwipe и поместите его в тарелку с α-MEM на льду.

2. мышиных задних конечностей костного изоляции

  1. Заполните шприц иглой 30 G с α-MEM.
  2. Отсоедините голени и бедра от коленного сустава.
  3. Отрежьте концы длинных костей с обеих сторон с помощью ножниц.
  4. Держите кости от вала с помощью пинцета, вставить иглу в пространстве костного мозга костей и медленно флеш содержание костного мозга в 6 см культуры блюдо. Кость появится белый, указывающее извлечения содержания костного мозга. Повторите для всех костей.
  5. Штамм костного извлечь с помощью стрейнер клеток нейлон 40 мкм в Тюбик 50 мл конические центрифуги и центрифуги на 300 x g за 5 мин.
  6. Отменить супернатанта, мыть с 5 мл α-MEM и центрифуги на 300 x g 5 мин повторить мыть для в общей сложности 2 раза.
  7. Ресуспензируйте гранулы в 10 мл α-MEM и выполнить подсчет клеток с помощью Горяева следующим:
    1. Делать 1:1 Разведение суспензии клеток путем добавления 10 мкл суспензии клеток 10 мкл 0,4% Трипановый синий в 1,5 мл трубку и Пипетка один раз.
    2. Накрыть крышкой слайд камеры Горяева и переноса красителя подвеска Горяева. Важно, чтобы не переполняйте или недолива палата и позволяют подвеска для заполнения палата капиллярных действий.
    3. Место Горяева на микроскопа. С помощью 10 x цель, сосредоточиться на площади центра. Граф все клетки связаны 3 линии. Чтобы убедиться, что клетки не учитываются дважды, граф верхний и правый углы каждого квадрата. Мертвые клетки появится синий, они исключаются из числа.
  8. В зависимости от вниз по течению семян клетки в сосуд соответствующей культуры. Для этого конкретного эксперимента следуйте раздел 3.

3. поколение BMM

  1. Семян 1 x 107 клеток/10 мл в 10 см культуры блюдо и добавить M-CSF 100 нг/мл. Конечная концентрация M-CSF является 100 нг/мл питательной среды. Инкубируйте культуры при 37 ° C, 5% CO2 на 3 дня.
  2. После 3 дней удалите питательной среды, вымыть клетки активно с 10 мл-фосфатный буфер (PBS) дважды, чтобы удалить не сторонник клетки, добавить 5 мл 0,02% комнатной температуре трипсина-ЭДТА в PBS и инкубировать при 37 ° C, 5% CO2 на 5 мин.
  3. Отсоедините клетки, тщательно закупорить. Убедитесь, что клетки была отсоединена, наблюдая за культуру под микроскопом (клетки должны появиться округлые и плавающие в СМИ). Если клетки остаются присоединенными, повторите тщательно закупорить их отсоединения. При отсоединении клетки добавьте 5 мл α-MEM для инактивации реакции.
  4. Собирать клетки в 50 мл Конические трубки и центрифуги на 300 x g 5 мин удалить супернатант и мыть с 5 мл α-MEM.
  5. Центрифуга на 300 x g 5 мин и Ресуспензируйте гранулы в 10 мл α-MEM.
  6. Выполните число ячеек, как описано в шаге 2.7.1.
  7. Семян 1 x 106 клеток/10 мл в 10 см культуры блюдо и добавить M-CSF 100 нг/мл. Конечная концентрация M-CSF является 100 нг/мл питательной среды. Инкубируйте культуры при 37 ° C, 5% CO2 на 3 дня.

4. поколение остеокласты от BMM как остеокластов прекурсоров

  1. После 3 дней урожай прилагаемый клетки, которые представляют BMM как остеокластов прекурсоров, следующие шаги 3,2-3,7.
  2. Семя BMM в 5 х 104 клетки/200 мкл α-MEM в 96 пластины хорошо. Добавьте RANKL для окончательного концентрации 50 нг/мл или ФНО α для конечной концентрации 100 нг/мл. Добавьте M-CSF для конечной концентрации 100 нг/мл в каждую лунку.
  3. Добавить антитела анти c-fms (окончательный концентрации 0, 1, 10, 100, 1000 нг/мл) для каждой скважины.
  4. Инкубируйте при 37 ° C, 5% CO2 на 4 дня. Изменения средств массовой информации каждый день в течение 4 дней.

5. тартрата устойчивостью кислой фосфатазы (ловушка) пятно

  1. После 4 дней инкубации аккуратно аспирационная питательной среды каждой скважины. Мыть каждый раз хорошо с 200 мкл комнатной температуре ПБС.
  2. Добавить 200 мкл формалина 10% в каждой скважине для фиксации и инкубировать 1 час при комнатной температуре. Аспирационная формалином и промойте деионизованной воды каждый хорошо 3 раза.
  3. Добавьте 200 мкл 0,2% Тритон X-100 в PBS каждому хорошо для permeabilization и инкубировать 1 час при комнатной температуре. Аспирационная Тритон X-100 и промойте деионизованной воды каждый хорошо 3 раза.
  4. Добавьте 200 мкл раствора ЛОВУШКУ пятно в каждой скважине. Визуализируйте пятно под микроскопом. Это займет от 10-30 мин на пятно, чтобы правильно развиваться.
  5. Аспирационная пятно и мыть каждый хорошо с дейонизированной воды 3 раза, а воздух сухой. Храните при комнатной температуре для использования в дальнейших наблюдений.

6. распространение Assay

  1. Семя BMM как остеокластов прекурсоров на 5 x 103 клеток/200 мкл α-MEM в 96 пластины хорошо. Добавьте M-CSF для конечной концентрации 100 нг/мл в каждую лунку.
  2. Добавить антитела анти c-fms (окончательный концентрации 0, 1, 10, 100, 1000 нг/мл) и инкубировать при 37 ° C, 5% CO2 в течение 3 дней без среднего изменения.
  3. После 3 дней Вымойте клетки с ПБС. Добавьте 100 мкл α-MEM каждой скважины.
  4. Добавить 10 мкл клеток подсчета комплект решения и инкубировать при 37 ° C, 5% CO2 на 2 ч и определения поглощения каждой скважины на 450 Нм, используя Считыватель микропланшетов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Целью настоящего Протокола является оценить эффект анти c-fms антитела на формирование остеокластов присутствии RANKL или ФНО α и определить воздействие M-CSF на распространение прекурсоров остеокластов. В этом протоколе мы обеспечили надежный процесс, по которому генерируются большие количества чистой остеокластов культур. Мы также предоставили способ проверить подходит концентрация антител анти c ФМС для ингибирования остеокластов формирования в условиях иной культуры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом исследовании мы исследовали эффект анти c-fms антитела на формирование RANKL-индуцированной остеокластов, ФНО α-индуцированной остеокластов формирование и распространение прекурсоров M-CSF-индуцированной остеокластов. Мы обнаружили, что эффективное количество антител анти c ФМС для ингибирования osteoclastogenesis среди RANKL-индуцированной остеокластов формирования, ФНО α индуцированной остеокластов формирования и M-CSF-индуцированной распространения прекурсоров остеокластов отличается.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа частично поддержали JSP-страницы KAKENHI грант от японского общества для содействия развитию науки (№ 16K 11776 Х.к., № 17K 17306 K. S., № 16K 20637 K. K., № 16K 20636 М.с., № 18K 09862 I. м.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Анти-c-Fms антителоAFS98, крысиное моноклональное, антимышиное, c-Fms антитело (IgG2a)
TNF-αРекомбинантный мышиный TNF-&alpha получен в нашей лаборатории. TNF-α фрагмент кДНК, клонированный с помощью ОТ-ПЦР и клонированный в pGEX-6P-I (Amersham Biosciences, Пискатауэй, Нью-Джерси) для получения белка-слияния GST. GST-TNF-α экспрессировался в клетках Escherichia coli BL21 (Stratagene, La Jolla, CA). Клетки лизировали в условиях неденатурации и GST-TNF-α очищался над глутатион-сефарозным столбиком. GST был отщеплен с помощью PreScission Protease (Amersham Biosciences) от производителя и был удален с помощью глутатион-сефарозного столбика.
RANKLPEPROTECH315-11Рекомбинантный мышиный лиганд sRANK, Источник: E. coli
M-CSFРекомбинантный человеческий M-CSF. 1/10 тома CMG14– 12 супернатант культур клеточной линии в 5x106  клетки в 10-сантиметровой суспензионной чашке для культивирования.
α-MEMWakoс L-глютамином и феноловым красным
Фетальная бычья сывороткаBiowests1820-500Фетальная бычья сыворотка Французское происхождение
Культура Блюдо для культурыCorning100 мм x 20 мм Тарелка
на 96 лунокТермофишер Научнаямонахиня клон Дельта поверхность
Набор для подсчета клеток-8Додзиндо, Кумамото, Япония
Считыватель микропланшетовSunrise REMOTE; Tekan Japan, Kawasaki, Japan
Cell sitherCorning40 μ m Нейлоновая
центрифужная пробиркаCorning50 мл CentriStar cap
Triton X-100WakoПолиоксиэтилен (10) Октифениловый эфир

Ссылки

  1. Crotti, T. N., Dharmapatni, A. A., Alias, E., Haynes, D. R. Osteoimmunology: Major and Costimulatory Pathway Expression Associated with Chronic Inflammatory Induced Bone Loss. Journal of Immunology Research. 2015, 281287(2015).
  2. Teitelbaum, S. L. Bone resorption by osteoclasts. Science. 289 (5484), 1504-1508 (2000).
  3. Azuma, Y., Kaji, K., Katogi, R., Takeshita, S., Kudo, A. Tumor necrosis factor-alpha induces differentiation of and bone resorption by osteoclasts. Journal of Biological Chemistry. 275 (7), 4858-4864 (2000).
  4. Kobayashi, K., et al. Tumor necrosis factor alpha stimulates osteoclast differentiation by a mechanism independent of the ODF/RANKL-RANK interaction. Journal of Experimental Medicine. 191 (2), 275-286 (2000).
  5. Kim, N., et al. Osteoclast differentiation independent of the TRANCE-RANK-TRAF6 axis. Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 589-595 (2005).
  6. Redlich, K., et al. Osteoclasts are essential for TNF-alpha-mediated joint destruction. Journal of Clinical Investestigation. 110 (10), 1419-1427 (2002).
  7. Abu-Amer, Y., Ross, F. P., Edwards, J., Teitelbaum, S. L. Lipopolysaccharide-stimulated osteoclastogenesis is mediated by tumor necrosis factor via its P55 receptor. Journal of Clinical Investestigation. 100 (6), 1557-1565 (1997).
  8. Zha, L., et al. TNF-alpha contributes to postmenopausal osteoporosis by synergistically promoting RANKL-induced osteoclast formation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 102, 369-374 (2018).
  9. Kitaura, H., et al. M-CSF mediates TNF-induced inflammatory osteolysis. Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3418-3427 (2005).
  10. Kimura, K., Kitaura, H., Fujii, T., Hakami, Z. W., Takano-Yamamoto, T. Anti-c-Fms antibody inhibits lipopolysaccharide-induced osteoclastogenesis in vivo. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 64 (2), 219-227 (2012).
  11. Kimura, K., et al. An anti-c-Fms antibody inhibits osteoclastogenesis in a mouse periodontitis model. Oral Diseases. 20 (3), 319-324 (2014).
  12. Kitaura, H., et al. An M-CSF receptor c-Fms antibody inhibits mechanical stress-induced root resorption during orthodontic tooth movement in mice. Angle Orthodontist. 79 (5), 835-841 (2009).
  13. Kitaura, H., et al. An anti-c-Fms antibody inhibits orthodontic tooth movement. Journal of Dental Research. 87 (4), 396-400 (2008).
  14. Bettina, A., et al. M-CSF Mediates Host Defense during Bacterial Pneumonia by Promoting the Survival of Lung and Liver Mononuclear Phagocytes. Journal of Immunology. 196 (12), 5047-5055 (2016).
  15. Dougall, W. C., et al. RANK is essential for osteoclast and lymph node development. Genes & Develpoment. 13 (18), 2412-2424 (1999).
  16. Wiktor-Jedrzejczak, W., et al. Total absence of colony-stimulating factor 1 in the macrophage-deficient osteopetrotic (op/op) mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (12), 4828-4832 (1990).
  17. Yang, P. T., et al. Increased expression of macrophage colony-stimulating factor in ankylosing spondylitis and rheumatoid arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 65 (12), 1671-1672 (2006).
  18. Takei, I., et al. High macrophage-colony stimulating factor levels in synovial fluid of loose artificial hip joints. The Journal of Rheumatology. 27 (4), 894-899 (2000).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Выделение костного мозгаобработка M-CSFстимуляция RANKLФНО-альфаанализ остеокластогенезапролиферация клетоквоспалительное поражение костей
Влияние антитела анти c-fms на формирование остеокластов и распространение остеокластов прекурсоров в пробирке
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.