Method Article

Характеризуя гистона столб-поступательные изменения изменения в моделях Neurodegenerative Proteinopathy дрожжей

DOI:

10.3791/59104

⸱

March 24th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Chemistry Department, Brooklyn College, 2Ph.D. Program in Biochemistry, Graduate Center of the City University of New York, 3Ph.D. Program in Chemistry, Graduate Center of the City University of New York, 4Ph.D. Programs in Chemistry, Biochemistry, and Biology, Graduate Center of the City University of New York

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол определяет экспериментальной процедуры характеризовать геном-изменения в уровнях столб-поступательные изменения гистона (ПТМ), возникающих в связи с гиперэкспрессия белков, связанные с ALS и болезни Паркинсона в Saccharomyces cerevisiae модели. После разъединения SDS-PAGE отдельные гистона PTM уровни концентрации обнаружены с модификации специфические антитела через западный blotting.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нейродегенеративные заболевания, такие как боковой амиотрофический склероз (ALS) и болезнь Паркинсона (PD), приводят к потере сотен тысяч жизней каждый год. Хватает эффективного лечения может остановить прогрессирование болезни. Несмотря на обширные последовательности в больших популяциях пациентов в большинстве случаев ALS и PD остаются необъяснимые, генетические мутации в одиночку. Эпигенетики такие механизмы, как столб-поступательные изменения гистона белков, могут быть вовлечены в этиологии нейродегенеративных заболеваний и прогрессии и привести к новые цели для фармацевтических вмешательства. Млекопитающих в vivo и in vitro модели ALS и PD являются дорогостоящими и зачастую требует длительных и трудоемких экспериментальных протоколов. Здесь мы приводим практический, быстрой и экономически подход к определению генома общесистемной изменения гистона модификации уровней с помощью Saccharomyces cerevisiae как модель системы. Этот протокол позволяет для всеобъемлющего расследования эпигеномные изменения, подключенных к нейродегенеративных proteinopathies, что подтверждают ранее сделанные выводы в различных модельных системах значительно расширяя наши знания о нейродегенеративные заболевания epigenome.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нейродегенеративные заболевания являются разрушительных болезней с практически нет доступных вариантов лечения. Среди них особенно страшны боковой амиотрофический склероз (ALS) и болезнь Паркинсона (PD). Примерно в 90% случаев ALS и PD считаются спорадические, происходящие без семейной истории болезни, в то время как оставшиеся дела работать в семьях и как правило связаны с конкретным ген мутации1,2. Интересно, что оба этих заболеваний связаны с белком mislocalization и агрегации3,4,5,6. К примеру, сливается в саркома (FUS) и TAR ДНК-связывающих белков 43 (TDP-43) являются белки, связывающие РНК mislocalize в цитоплазму и объединяют в ALS7,8,9,10, 11,12, в то время как α-synuclein — это компонент принципа белковых агрегатов, называется Леви органов в PD5,13,14,15.

Несмотря на обширные генома всей ассоциации в больших популяциях пациентов подавляющее большинство случаев ALS и PD оставаться необъяснимая генетически. Можно эпигенетики играть определенную роль в нейродегенеративных заболеваний? Эпигенетики включает в себя изменения в экспрессии генов, происходит без изменения базовой последовательности ДНК16. Основные эпигенетический механизм включает столб-поступательные изменения (PTMs) гистоновых белков16. В эукариотических клетках генетический материал плотно завернута в хроматина. Базовой единицей хроматина является нуклеосома, состоящий из 146 пар оснований ДНК, обернутые вокруг гистона octamer, состоящий из четырех пар гистонов (две копии каждого гистонами H2A, H2B, H3 и H4)17. Каждый гистона имеет N-терминальный хвост, который выступает из нуклеосомой и может быть изменена путем добавления различных химических постановление, обычно на остатков лизина и аргинина18. Эти PTMs являются динамическими, что означает, что они могут быть легко добавлены и удалены и включают группы ацетилирования, метилирование и фосфорилирования. PTMs контролировать доступность ДНК транскрипционный анализ техники и тем самым помочь управления ген выражение18. К примеру, ацетилирование гистона уменьшает силы электростатического взаимодействия между очень основные гистона белка и отрицательно заряженной ДНК позвоночника, позволяя гены, Упакованные ацетилированный гистонами быть более доступным и, таким образом высоко выраженная19. Совсем недавно замечательный биологических специфику конкретных гистона PTMs и их комбинаций привела к гистона кода гипотеза20,21 в котором белки, писать, стереть и чтение гистон PTMs все согласованно действовать для модулировать экспрессию генов.

Дрожжей является очень полезной моделью для изучения нейродегенеративные. Важно отметить, что многие нейрональных клеточных пути сохраняются из дрожжей для людей22,,2324. Дрожжи пилки цитотоксичность фенотипы и белковых включений по гиперэкспрессии FUS, TDP-43 или α-synuclein22,23,24,25,26. В самом деле Saccharomyces cerevisiae модели ALS были использованы для выявления генетических факторов риска в людей27. Кроме того дрожжи, экспрессирующих человека α-synuclein разрешено для характеристики сети Rsp5 как druggable цель улучшения α-synuclein токсичности в нейроны28,29.

Здесь мы описываем протокол эксплуатации Saccharomyces cerevisiae для выявления генома wide гистонов PTM изменения, связанные с нейродегенеративных proteinopathies (рис. 1). Использование S. cerevisiae весьма привлекательными из-за его простоту использования, низкая стоимость и скорость по сравнению с другими in vitro и животных моделей нейродегенеративные. Использование ранее разработан ALS и PD модели22,23,25,26, мы оверэкспрессировали человека FUS, TDP-43 и α-synuclein в дрожжей и открытые собственный гистона PTM изменения, происходящие в связь с каждой proteinopathy30. Протокол, который мы описываем здесь может быть завершена в менее чем за две недели от преобразования для анализа данных.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. преобразование S. cerevisiae с нейродегенеративных proteinopathy связанные белком конструкции

  1. Расти дикого типа (WT) 303 дрожжи в дрожжевой экстракт Пептон Декстроза (YPD) бульон на ночь с встряхивания (200 об/мин) при 30 ° C.
  2. После 12−16 h роста, развести дрожжи оптической плотности на 600 Нм (600OD) 0.25 с YPD. Как 10 мл жидкой культуры дрожжей будет необходимо для каждого преобразования, подготовьте 50 мл жидкого культуры дрожжей для пяти преобразований, соответствующий FUS, TDP-43, a-synuclein и конструкции вектора только (ccdB), а также преобразования отрицательного контроля без ДНК.
  3. Растут дрожжи с перемешиванием на 30 ° C, пока не будет достигнуто ОД600 между 0,60 и 0,80. Это, как правило, занимает 4−6 h.
  4. Тридцать минут, прежде чем рост дрожжей является полным, линеаризации плазмидные конструкции.
    Примечание: Плазмидные конструкции, используемые здесь должна быть интегрирована непосредственно в геном, и следовательно до преобразования требуется линеаризации.
    1. Вычислить объем запасов плазмида что составляет 1 мкг. вычесть этот объем от 44 мкл для расчета суммы нуклеиназы бесплатно H2O требуется.
    2. Добавление пробки microcentrifuge нуклеиназы бесплатно H2O, 5 мкл 10 x энзима ограничения буфера (Таблица материалов), 1 мкл NheI энзима ограничения (Таблица материалов) и соответствующее количество плазмида (исчисляемый шаг 1.4.1). Тщательно перемешать, закупорить вверх и вниз и инкубировать при 37 ° C 15 мин. Плазмида в настоящее время линеаризованного и готовы к трансформации.
  5. После дрожжи культуры достигает ОД600 0,6-0,8, урожай клетки в 50 мл Конические трубки и спин вниз на 850 x g при 4 ° C на 3 мин удалить супернатант.
  6. Вымойте клетки Пелле в 10 мл стерильной H2O и центрифуги на 850 x g при 4 ° C на 3 мин удалить супернатант. Повторите 3 x для в общей сложности четыре смывки.
  7. В начале третьей стирки оттепель и варить 10 мкл спермы ДНК лосося за преобразование реакции на 5 мин на Отопление блока.
  8. Ресуспензируйте Пелле клеток в 100 мкл dH2O на преобразование и разделить на соответствующее количество трубок microcentrifuge. Для пяти преобразований Ресуспензируйте Пелле в 500 мкл dH2O и равномерно разделена на пять отдельных microcentrifuge трубы.
  9. Центрифуга для 5 мин при 850 x g при комнатной температуре (RT) и удалить все остатки воды.
  10. В следующем порядке, 50 мкл стерильных H2O, 240 мкл 50% полиэтиленгликоля (PEG), 36 мкл 1 М LiAc, 10 мкл спермы лосося ДНК, 20 мкл линеаризованного плазмидной ДНК (или нуклеиназы свободной воды для преобразования управления ДНК). Тщательно перемешать после каждого добавления и вихревой кратко после добавления всех компонентов преобразования.
  11. Инкубируйте преобразования реакции при 42 ° C в течение 20 мин.
    Примечание: Провести этот инкубации в водяной бане для более последовательного контроля температуры.
  12. Центрифуга на 470 x g на RT для 5 минут удалить супернатант и Ресуспензируйте каждой ячейки Пелле в 200 мкл стерильных H2O.
  13. Пластина подвески дрожжей на выборочной СМИ пластины и распространение с прокатки бисером или распределителя. Инкубировать пластины для 2−3 дня при температуре 30 ° C.
    Примечание: Определенные синтетические (SD)-его плиты используются для плазмид, описанных здесь.

2. съемка подавления роста колонии и хранения в запасах глицерина

  1. Прививок одной колонии от преобразования пластины в 5 мл селективного СМИ, дополнена Рафиноза 2%. Растут на шейкер на 30 ° C на ночь. Выберите по крайней мере 12 колоний за преобразования.
    Примечание: Не колоний ожидаются в пластину управления преобразования «нет ДНК».
  2. Стерилизуйте контактный frogger с этанолом, следуют пылающий.
  3. Для каждой культуры, аликвота 100 мкл суспензии насыщенных клеток в первой строке 96-луночных плиты. Добавьте 200 мкл стерильных H2O на всех скважинах хорошо смежных столбцов. Для 1:5 серийных разведений добавьте 50 мкл из первого столбца в соседнем столбце позади с многоканальные пипетки. Тщательно перемешать, закупорить. Затем добавьте 50 мкл из второго столбца в третьей колонке и микс, закупорить. Повторите это для остальной части пластины.
  4. Пластина дрожжей, поместив frogger в 96-луночных пластине и затем штамповки аккуратно и равномерно нажимая вниз на выборочный СМИ пластины с и без галактозы. Инкубируйте 2−3 дня при температуре 30 ° С.
    Примечание: SD-его и SGal-его плиты используются для плазмид, описанных здесь.
  5. FUS, TDP-43 и а-synuclein преобразований определите колонии, отображение наиболее подавления роста присутствии галактозы. Выберите этот колонии от SD-его пластины и инокуляции в 10 мл селективного СМИ с 2% Рафиноза ночь роста. Для контроля переносчиков выберите отображение не подавление роста присутствии галактозы колонии.
  6. Подготовить глицерин запасов, объедините 0,5 мл насыщенной жидкости культуры с 0,5 мл 50% глицерина. Смешать, закупорить вверх и вниз и заморозить при температуре-80 ° C.
    Примечание: Глицерин запасов может храниться до года-80 ° c.

3. гиперэкспрессия нейродегенеративных proteinopathy связанных белков в S. cerevisiae

  1. Из замороженных глицерин запасов, повторно испещрять дрожжей на гистидина, 2% глюкозы агар селективного СМИ пластины и проинкубируйте 2−3 дня при температуре 30 ° C.
  2. Для каждой из моделей гиперэкспрессия и контроля в 5 мл гистидина селективного жидких сред с 2% Рафиноза инокуляции одной колонии. Расти с встряхивания (200 об/мин) при 30 ° C на ночь.
  3. Расти 100 мл жидкого культуры для каждой из моделей гиперэкспрессия и контроль (FUS, TDP-43 и Векторный контроль;-synuclein и вектор управления).
    1. Подготовка 100 мл культуры в выборочной СМИ с 2% галактозы.
    2. Измерить ОД600 ночь культур и рассчитать количество ночь культуры, необходимые для визуализации гиперэкспрессия культур начала ОД600 0,3. Как правило на ночь культуры достигнет ОД600 0.9−10, требует около 5 мл на ночь культуры начать 100 мл свежего культуры.
    3. Побудить гиперэкспрессия белка путем выращивания дрожжей на СМИ галактозу (см. шаг 3.3.1) для 5 h (FUS и TDP-43) или 8 h (a-synuclein) с тряску при 30 ° C.
  4. Мера ОД600 каждой культуры в конце периода индукции. Стандартизация всех клеток с наименьшим значением600 ОД. Урожай в 50 мл трубки культуры центрифугированием при 850 x g 5 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
    Примечание: Если ОД600 , измеренные в конце индукции 0.654 и 0,984, соответственно, 100 мл-synuclein культуры и 100 мл культуры управления, урожай 95 мл-synuclein культуры и 67,1 мл культуры управления.
  5. Ресуспензируйте Пелле в 1 мл стерильного dH2O для каждые 10 мл культуры выросли. Равномерно разделить гранулы, aliquoting 1 мл клеток ресуспендирования в microcentrifuge трубы. Например если начиная с 100 мл культуры, Ресуспензируйте Пелле в 10 мл стерильной dH2O и разделить его на 10 microcentrifuge трубы.
  6. Центрифуга на 850 x g 5 минут при температуре 4 ° C, а затем удалить супернатант. Оснастки замораживание клеток окатышей в жидком азоте и хранить при температуре-80 ° C.
    Примечание: Клетки гранулы могут храниться при температуре-80 ° C на срок до одного года.

4. клетки лизис и Западный blotting для обнаружения столб-поступательные изменения гистона

  1. Лизис клеток
    1. Оттепель дрожжевых клеток окатышей на льду и Ресуспензируйте клеток окатышей в 100 мкл dH2O.
    2. Для ячейки взмучивания добавьте 0,2 М NaOH 300 мкл и 20 мкл 2-меркаптоэтанол. Ресуспензируйте, закупорить вверх и вниз.
    3. Инкубировать клетки на льду за 10 мин и затем центрифуги на 3200 x g на настольная центрифуга для 30 s на RT. удалить супернатант.
    4. Ресуспензируйте Пелле клеток в 100 мкл 1 x загрузки красителя и варить 10 мин на Отопление блока.
      Примечание: Рецепт для 6 x загрузки краситель можно найти в Таблице материалов.
  2. Электрофорез геля полиакриламида додецилового сульфата натрия и мембраны передачи
    1. Подготовьте камеру гель, поставив два гели в гель держатель и заполнение внутренней камере на вершину с управлением буфера и заполнение вне камеры до отметки 2 гель линии.
    2. Загрузите 15 мкл пример из шага 4.1.4 за хорошо в геле полиакриламида 12% 10-хорошо. Для белка лестница Лейн нагрузка 5 мкл.
    3. Побегите гель для приблизительно 45 мин, 150 V, или до тех пор, пока загрузка краситель фронта достигает нижней части геля.
    4. Пока выполняется гель, подготовка к передаче мембраны путем замачивания волоконно колодки (два на гель) в буфер передачи (Таблица материалов) и замачивания винилидена фторида (PVDF) мембраны в метаноле. Промойте мембрану в буфер передачи перед передачей.
      Примечание: PVDF мембрану должны быть сокращены к размеру геля и использовать один из PVDF мембраны для каждого гель переводится.
    5. Монтаж на полусухой передачи аппарат клеток, передача «сэндвич»: от нижней электрода, место (1) замоченный волоконно колодки, (2) замоченный и промыть PVDF мембрану, (3) гель от шага 4.2.3 и (4) второй замоченный волоконно колодки.
      Примечание: Убедитесь избежать воздушных пузырей в передаче «сэндвич». Аккуратно ролл «сэндвич» с Серологические Пипетки вытеснить пузыри. После того, как гель был сделан на вершине PDVF мембраны, убедитесь, что не для того переместить его.
    6. Осуществлять передачи белка, установив пакет мощность до 150 мА на 1 ч (для одного «сэндвич»).
  3. Обнаружение гистона PTMs с модификации специфические антитела
    1. Удаление мембраны из передачи аппарат. Промойте кратко dH2O.
      1. При необходимости проверьте Перенос белков с пятно Пуансо, поливая достаточно Пуансо пятно покрытие мембраны в пластиковую коробочку и инкубации на RT с нежно тряска для 30−60 s. Удалите Пуансо пятно и промойте dH2O до тех пор, пока пятно фон исчезает и белка полосы видны невооруженным глазом. Продолжать промыть dH2O до тех пор, пока все пятно удаляется из мембраны.
    2. Блокировать мембраны, инкубации помарку для 1 h на RT с плавное покачивание с трис-буфер солевой (TBS) блокирующий буфер (Таблица материалов) в небольшой коробке окрашивание. Используйте достаточно блокирующий буфер для покрытия помаркой.
      Примечание: Будьте осторожны, чтобы место мембраны вертикально в поле окрашивания, так что стороной мембраны, на котором белки лежат не обращены вниз.
    3. Инкубировать пятно в поле окрашивания на ночь с гистонов модификации специфические антитела реактивной к дрожжей на 4 ° C. Разбавьте антитела в блокирующем буфере TBS согласно спецификации производителя. Также включать элемент управления надлежащего ядерного загрузки, такие как анти всего H3, поднятые в различных принимающих видов от модификации специфические антитела. Например если зондирование для H3S10ph с антитела анти H3S10ph, вырос в кролика, используйте антитело против всего H3, вырос в мыши как элемент загрузки. Повторите это для каждого блот при необходимости.
      Примечание: Разбавления антитела могут быть использованы для в общей сложности три раза в течение одного месяца. Хранить их при 4 ° C.
    4. Промойте мембрану 4 x в дом сделал TBS + 0.1% Полисорбат 20 (TBST) за 5 мин с качания на RT.
    5. Инкубировать пятно с флуоресцентные вторичные антитела на указанный производителем разведений (осел анти кролик 680 и осел анти мышь) за 1 ч на RT.
      Примечание: Флуоресцентные вторичные антитела должны быть защищены от света во время хранения и использования. Осуществлять инкубации в темные пластмассовые ящики или накрыть алюминиевой фольгой.
    6. Промойте мембрану 4 x с TBST за 5 минут и промыть TBS 5 минут во время раскачивания на RT.
    7. Визуализация пятно на флуоресцентные западную помарку изображений системы за 2 мин визуализировать анти кролик 680 и вторичные антитела анти мыши 800 в 800 Нм, 700 Нм каналов и соответственно.
      Примечание: Реплицирует независимо проводятся начиная с раздела 1. Необходимо убедиться, что сигнал реакции антитела находится в пределах диапазона, над которой сигнал ответа является линейным для интерпретации соответствующих данных в этих экспериментах.

5. анализ данных и статистика

  1. Открыть изображение пятно в изображений программное обеспечение (Таблица материалов). Приобрести объемная плотность образцов изменения конкретных групп в вектор управления, TDP-43 и фу (или переносчиками и a-synuclein), нарисовав прямоугольник, кадры группы в режиме анализа.
  2. Повторите шаг 5.1 для загрузки элемента управления ленты.
    Примечание: Там будет загрузки контролировать изменения конкретных диапазонах в каждом образце и.
  3. Вычислить относительную плотность изменения конкретных групп путем деления каждой группы плотность соответствующей группы в образце векторного управления. Это нормализует данные с переносчиками.
  4. Вычислить относительную плотность нагрузки группы управления путем деления каждой группы плотность загрузки соответствующего управления полоса в образце векторного управления.
  5. Вычисления скорректированного относительная плотность каждой группы путем деления относительная плотность модификации конкретные группы над относительной плотности нагрузки группы управления для каждого образца. Теперь данные могут быть визуализированы в форме гистограммы.
    Примечание: Для удобства обработки, шаги 5.3-5.5 может быть сделано в электронной таблице (Дополнительный файл).
  6. После нескольких независимых реплицирует, выполнения Уэлч T-тесты между двумя контрольными образцами и соответствующие proteinopathy модели (элементы управления против FUS, управления по сравнению с TDP-43 и по сравнению с a-synuclein) с p = 0,05 как отсечки для значение .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для иллюстрации этого метода, мы будем использовать недавно опубликованные результаты30. WT человека FUS и TDP-43 были оверэкспрессировали за 5 ч, в то время как WT α-synuclein был оверэкспрессировали за 8 ч. Конструкция ccdB был использован как элемент отрицательный вектор. Рисунок 2 показывает подавления роста в твердых и жидких культур. Дрожжей было собрано как описано и Западный blotting с модификации специфические антитела была вы...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол, описанные здесь обеспечивает простой, целесообразным и экономически эффективным способом изменения генома wide гистонов ПТМ, коррелирует с нейродегенеративных proteinopathies классификации. Хотя есть другие модели ALS и PD, например в vitro линий клеток человека и мышиным модели32, S. cerevisiae остается привлекательным из-за своей простоты использования. К примеру дрожжи модели не требуют использования стерильных капот, ни они требуют, что интенсивное обучение, которое...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Royena Tanaz, Юсуф Худа и Sadiqa Taasen для получения технической помощи. Мы очень благодарны профессор Джеймс короче за щедрое предоставление реагентов и интеллектуальной помощи в разработке сахарозы настройки экспериментов. Плазмиды дрожжи были щедрый подарок от профессор Аарон Gitler (включая 303 Гал-Фу; Плазмиды # 29614 Addgene). Бруклинский колледж и расширенный научно исследовательский центр (КЮНИ), а также низ NINDS Advanced докторской перехода награду (K22NS09131401) поддержал M.P.T.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
-Его добавкаDO Clontech630415
10x Running BufferMix: 141,65 г глицина (ThermoFisher BP381-1), 30,3 г основания Tizma (Sigma-Aldrich T6066), 10 г додецилсульфата натрия (Sigma-Aldrich L3771) и 1 л деионизированной воды, pH 8,8.
12% полиакриламидные гелиBIO-RAD456-1041
2-меркаптоэтанолSigma-AldrichM3148
Антиацетил-гистон H3 (Lys14) Первичное антителоMilliporeSigma07-353 (Лот No 2762291)Разведение: 1/1000
Антиацетил-гистон H4 (Lys 16) Первичное антителоAbcamab109463 (Лот No. GR187780)Разведение: 1/2000
Антиацетил-гистон H4 (Lys12) Первичное антителоAbcamab46983 (Лот No. GR71882)Разведение: 1/5000
Анти-диметил-гистон H3 (Lys36) Первичное антителоAbcamab9049 (Лот No. GR266894, GR3236147)Разведение: 1/1000
Первичное антитело против гистонов H3 Abcamab24834 (Лот No. GR236539, GR174196, GR3194335)Контроль за ядерной нагрузкой; Разведение: 1/2000
Антифосфо-гистон H2B (Thr129) Первичное антителоAbcamab188292 (Лот No. GR211874)Разведение: 1/1000
Антифосфо-гистон H3 (Ser10) Первичное антителоAbcamab5176 (Лот No. GR264582, GR192662, GR3217296)Разведение: 1/1000
BioPhotometer D30Eppendorf6133000010
Чашка для клеточных культур (100 x 20 мм)Eppendorf30702118
Cell Culture Plate, 96 лунокEppendorf30730011
центрифуга 5804/5804 R/5810/5810 REppendorf22625501
Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CWLI-COR926-32212 (Лот No C60301-05, C61116-02, C80108-05)Разведение: 1/5000
Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RDLI-COR926-68073 (Лот No C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07)Разведение: 1/2500
ЭтанолSigma-AldrichE7023
Сверхплотная бумага-клякса (фильтровальная бумага)BIO-RAD1703968
ГалактозаSigma-AldrichG0750Приготовьте 20% массовый раствор.
ГлюкозаSigma-AldrichG8270Приготовьте 20% массовый раствор.
ГлицеринSigma-AldrichG5516Приготовьте 50 % мас.в. раствор.
Передаточные мембраны Immobilon-FLMilliporeSigmaIPFL00010
дигидрат ацетата лития (LiAc)Sigma-AldrichL4158Приготовьте 1 М раствор.
Смесь красителей: 1,2 г додецилсульфата натрия, 6 мг бромофенолового синего (Sigma-Aldrich B8026), 4,7 мл глицерина, 1,2 мл 0,5 М основания Тризмы pH 6,8, 0,93 г DL-дитиотреитола (Sigma-Aldrich D0632) и 2,1 мл деионизированной воды.
МетанолThermoFisherA412-4
Mini-PROTEAN Tetra Вертикальная электрофорезная ячейкаBIO-RAD1658004
многоканальная пипеткаEppendorf2231300045
NEB Restriction Enzyme Buffer 2.1, 10xNew England Bio Labs102855-152
nhe I Restriction EnzymeNew England Bio Labs101228-710
Вода без нуклеазыQiagen129114
Система визуализации Odyssey FcLI-COR Biosciences2800-03
OmniTray Культура клеток обработана с крышкой стерильная, PS (86 x 128 мм)ThermoFisher165218
pAG303GAL-a-synuclein-GFPПодарок от A. Gitler
pAG303GAL-ccdBAddgene14133
pAG303Gal-FUSAddgene29614
pAG303GAL-TDP-43Подарок от А. Гитлера
Поли(этиленгликоль) (ПЭГ)Сигма-ОлдричP4338Приготовьте 50% в/в раствор.
Ponceau S StainSigma-AldrichP3504Mix: 0,5 г 0,1% по мас. красителя Ponceau S, 5 мл 1% по сравнению с уксусной кислотой (Sigma-Aldrich 320099) и 500 мл деионизированной воды.
Базовый блок питания PowerPacBIO-RAD164-5050
Пентагидрат рафинозыSigma-AldrichR7630Приготовьте 10% массовый раствор.
Сперма лосося DNAAgilent Tech201190
SD-His ПластиныСмесь: 20 г агара (Sigma-Aldrich A1296), 0,77 г добавки -HIS DO, 6,7 г дрожжевого азотного основания без аминокислот (ThermoFisher 291920) и 900 мл деионизированной воды.
SGal-His: 20 г агара, 0,77 г добавки РК -His, 6,7 г азотистой основы дрожжей без аминокислот, 100 мл раствора галактозы и 900 мл деионизированной воды.
для загрузки додецилсульфата натрияпри -20 oC. 6X, Смесь: 1,2 г додецилсульфата натрия, 6 мг бромофенола синего, 0,93 г DL-дитиотреитола, 2,1 мл деионизированной воды, 4,7 мл глицерина и 1,2 мл 0,5 М основания тризмы, pH 6,8.
Гидроксид натрияСигма-Олдрич221465Приготовить 0,2 М раствора.
СахарозаSigma-Aldrich84097Приготовьте 20% массовый раствор.
TBS + 0,1% Tween 20 (TBST)Смесь: 100 мл 10X TBS, 1 мл Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949) и 900 мл деионизированной воды.
TBS Блокирующий буферLI-COR927-5000
Trans-Blot SD Полусухая электрофоретическая передаточная ячейкаBIO-RAD170-3940
Передаточная буфернаясмесь: 22,5 г глицина, 4,84 г основания Tizma, 400 мл метанола, 1 г додецилсульфата натрия и 1,6 л деионизированной воды.
Трис-буферный физиологический раствор (TBS)10X, 7,6 pH, Раствор: Смешайте 24 г основания Тризмы и 88 г хлорида натрия (Sigma-Aldrich S7653). Наполните до 1 л деионизированной водой.
WT 303 S. cerevisiae дрожжиПодарок от J. Short
Дрожжевой экстракт пептона декстрозы (YPD)Sigma-AldrichY1375
Смесь пластин Буфер

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Landgrave-Gómez, J., Mercado-Gómez, O., Guevara-Guzmán, R. Epigenetic mechanisms in neurological and neurodegenerative diseases. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 58(2015).
  2. Paez-Colasante, X., Figueroa-Romero, C., Sakowski, S. A., Goutman, S. A., Feldman, E. L. Amyotrophic lateral sclerosis: mechanisms and therapeutics in the epigenomic era. Nature Reviews Neurology. 11 (5), 266-279 (2015).
  3. Beitz, J. M. Parkinson's Disease: a Review. Frontiers in Bioscience. 6, 65-74 (2014).
  4. Kim, H. J., et al. Mutations in prion-like domains in hnRNPA2B1 and hnRNPA1 cause multisystem proteinopathy and ALS. Nature. 495 (7442), 467-473 (2013).
  5. Poewe, W., et al. Parkinson disease. Nature Reviews Disease Primers. 3, https://www.nature.com/articles/nrdp201713 - supplementary-information 17013(2017).
  6. Robberecht, W., Philips, T. The changing scene of amyotrophic lateral sclerosis. Nature Reviews Neuroscience. 14 (4), https://www.nature.com/articles/nrn3430 - supplementary-information 248-264 (2013).
  7. Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).
  8. Couthouis, J., et al. A yeast functional screen predicts new candidate ALS disease genes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (52), 20881-20890 (2011).
  9. Da Cruz, S., Cleveland, D. W. Understanding the role of TDP-43 and FUS/TLS in ALS and beyond. Current Opinion in Neurobiology. 21 (6), 904-919 (2011).
  10. King, O. D., Gitler, A. D., Shorter, J. The tip of the iceberg: RNA-binding proteins with prion-like domains in neurodegenerative disease. Brain Research. 1462, 61-80 (2012).
  11. Neumann, M., et al. FET proteins TAF15 and EWS are selective markers that distinguish FTLD with FUS pathology from amyotrophic lateral sclerosis with FUS mutations. Brain. 134 (9), 2595-2609 (2011).
  12. Neumann, M., et al. Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis. Science. 314 (5796), 130-133 (2006).
  13. Baba, M., et al. Aggregation of alpha-synuclein in Lewy bodies of sporadic Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies. The American Journal of Pathology. 152 (4), 879-884 (1998).
  14. Lotharius, J., Brundin, P. Pathogenesis of parkinson's disease: dopamine, vesicles and α-synuclein. Nature Reviews Neuroscience. 3 (12), 932-942 (2002).
  15. Spillantini, M. G., et al. α-Synuclein in Lewy bodies. Nature. 388 (6645), 839-840 (1997).
  16. Probst, A. V., Dunleavy, E., Almouzni, G. Epigenetic inheritance during the cell cycle. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (3), 192-206 (2009).
  17. Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
  18. Mazzio, E. A., Soliman, K. F. A. Basic concepts of epigenetics. Epigenetics. 7 (2), 119-130 (2012).
  19. Struhl, K. Histone acetylation and transcriptional regulatory. Genes & Development. 12 (5), 599-606 (1998).
  20. Garcia, B. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. Characterization of histones and their post-translational modifications by mass spectrometry. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (1), 66-73 (2007).
  21. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
  22. Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).
  23. Sanchez, Y., Lindquist, S. L. HSP104 required for induced thermotolerance. Science. 248 (4959), 1112(1990).
  24. Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast Cells Provide Insight into Alpha-Synuclein Biology and Pathobiology. Science. 302 (5651), 1772(2003).
  25. Johnson, B. S., et al. TDP-43 Is Intrinsically Aggregation-prone, and Amyotrophic Lateral Sclerosis-linked Mutations Accelerate Aggregation and Increase Toxicity. Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20329(2009).
  26. Sun, Z., et al. Molecular Determinants and Genetic Modifiers of Aggregation and Toxicity for the ALS Disease Protein FUS/TLS. PLOS Biology. 9 (4), e1000614(2011).
  27. Elden, A. C., et al. Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS. Nature. 466 (7310), https://www.nature.com/articles/nature09320 - supplementary-information 1069-1075 (2010).
  28. Wijayanti, I., Watanabe, D., Oshiro, S., Takagi, H. Isolation and functional analysis of yeast ubiquitin ligase Rsp5 variants that alleviate the toxicity of human α-synuclein. The Journal of Biochemistry. 157 (4), 251-260 (2015).
  29. Tardiff, D. F., et al. Yeast Reveal a “Druggable” Rsp5/Nedd4 Network that Ameliorates α-Synuclein Toxicity in Neurons. Science. 342 (6161), 979(2013).
  30. Chen, K., et al. Neurodegenerative Disease Proteinopathies Are Connected to Distinct Histone Post-translational Modification Landscapes. ACS Chemical Neuroscience. 9 (4), 838-848 (2018).
  31. Flick, J. S., Johnston, M. Two systems of glucose repression of the GAL1 promoter in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 10 (9), 4757(1990).
  32. Fernandez-Santiago, R., Ezquerra, M. Epigenetic Research of Neurodegenerative Disorders Using Patient iPSC-Based Models. Stem Cells International. 2016, 9464591(2016).
  33. Armakola, M., et al. Inhibition of RNA lariat debranching enzyme suppresses TDP-43 toxicity in ALS disease models. Nature Genetics. 44 (12), 1302-1309 (2012).
  34. Tibshirani, M., et al. Cytoplasmic sequestration of FUS/TLS associated with ALS alters histone marks through loss of nuclear protein arginine methyltransferase 1. Human Molecular Genetics. 24 (3), 773-786 (2015).
  35. Masala, A., et al. Epigenetic Changes Associated with the Expression of Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) Causing Genes. Neuroscience. 390, 1-11 (2018).
  36. Eryilmaz, I. E., et al. Epigenetic approach to early-onset Parkinson’s disease: low methylation status of SNCA and PARK2 promoter regions. Neurological Research. 39 (11), 965-972 (2017).
  37. Daniele, S., et al. Epigenetic Modifications of the α-Synuclein Gene and Relative Protein Content Are Affected by Ageing and Physical Exercise in Blood from Healthy Subjects. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 3740345(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Histone ModificationYeast ModelNeurodegenerative DiseaseWestern BlotProtein OverexpressionHistone AcetylationEpigenetic AnalysisSaccharomyces CerevisiaeALS PD ModelsPost translational Modification

Related Articles