Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

ATAC-seq Assay с низкой митохондриальной ДНК загрязнения от первичного человека CD4 + Т-лимфоцитов

12.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59120

⸱

22 марта 2019 г.

 ,  , 
1Department of Biology, Boston University, 2Department of Computer Science and Engineering, University of California San Diego, 3Bioinformatics Program, Boston University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол для выполнения assay для виртуализации (ATAC-seq) активированный человека лимфоцитов CD4 + Транспозаза доступные хроматина. Протокол был изменен для сведения к минимуму загрязнения митохондриальной ДНК читает от 50% до 3% путем введения нового буфера lysis.

Аннотация

ATAC-seq стал широко используется методология в изучении эпигенетики из-за его быстрый и простой подход к картирования генома всей доступной хроматина. В этой статье мы представляем улучшение ATAC-seq протокол, который уменьшает загрязнение митохондриальной ДНК читает. В то время как предыдущие протоколы ATAC-seq боролись с читает в среднем на 50%, загрязняя митохондриальной ДНК, оптимизированный литического буфера, представил в настоящем Протоколе уменьшает загрязнение митохондриальной ДНК в среднем 3%. Это улучшение ATAC-seq протокол обеспечивает около 50% сокращение стоимости последовательности. Мы демонстрируем, как эти библиотеки ATAC-seq высокого качества могут быть получены из активированных CD4 + лимфоцитов, шаг за шагом инструкции от CD4 + лимфоцитов изоляции из цельной крови путем анализа данных. Этот улучшенный протокол ATAC-seq протестирована в широком диапазоне типов клеток и будет немедленно воспользоваться исследователи, изучая хроматина доступности.

Введение

Assay для Транспозаза доступные хроматина виртуализации (ATAC-seq) быстро стал ведущим методом для допроса хроматина архитектуры. ATAC-seq можно определить регионы доступны хроматина через процесс tagmentation, фрагментации и пометки ДНК же ферментом, производить библиотеки, с которыми последовательности можно определить доступность хроматина через весь геном. Этот процесс tagmentation при посредничестве гиперактивный Tn5 Транспозаза, который режет только открытые регионы хроматина из-за nucleosomic их пространственной помех. Как она режет, Tn5 Транспозаза также вставляет последовательность адаптеры, которые позволяют для быстрого библиотека строительство методом ПЦР и следующего поколения секвенирования генома всей доступной хроматина1,2.

ATAC-seq стала предпочтительным методом для определения регионов хроматина доступности из-за относительно простой и быстрый протокол, качество и спектр информации, которая может быть определена из его результаты и небольшое количество исходного материала требуется. По сравнению с DNase-seq3 (который также измеряет генома общесистемной хроматина доступность), MNase-seq4 (который определяет нуклеосома позиции в регионах открытых генома), и формальдегида опосредованной Фэр seq5, ATAC-seq быстрее, дешевле и более воспроизводимые1. Это также более чувствительным, работа с исходного материала всего лишь 500 ядер, по сравнению с 50 миллионов ядра, необходимые для DNase-seq3. ATAC-seq также имеет возможность предоставить дополнительные сведения об архитектуре хроматина чем другие методы, включая регионы привязки фактор транскрипции, нуклеосома позиционирования и открытые хроматина регионах1. Эффективный, одноклеточных ATAC-seq протоколы были подтверждены, предоставляя информацию о архитектуры хроматина в одной ячейки уровня6,7.

ATAC-seq используется для характеристики хроматина архитектуры через широкий спектр исследований и клетки типов, включая растения8,9людей и многих других организмов. Это также сыграло важную роль в идентификации эпигеномные регулирование болезни государств7. Однако наиболее широко используемый протокол ATAC-seq включает основным недостатком загрязнения гласит последовательности митохондриальной ДНК. В некоторых наборов данных этот уровень загрязнения может быть выше, чем 60% секвенирования результаты1. В поле, чтобы уменьшить эти загрязняющие митохондриальной читает для обеспечения более эффективного применения ATAC-seq7,10,11есть согласованные усилия. Здесь мы представляем улучшение ATAC-seq протокол, который снижает уровень загрязнения митохондриальной ДНК всего 3%, позволяя сокращение около 50% в последовательности по цене10. Это стало возможным путем упрощения процесса CD4 + лимфоцитов изоляции и активации и улучшение литического буфера, которая имеет решающее значение для сведения к минимуму загрязнения митохондриальной ДНК.

Этот протокол modifiedATAC-seq протестирована с широкий спектр первичных элементов, включая первичный периферической крови человека мононуклеарных клеток (получения)10, человека первичной моноцитов и дендритные клетки мыши (Неизданное). Он также успешно используется допросить линии клетки меланомы в кластеризованный экране регулярно interspaced короткие палиндром повторяется (ТРИФОСФАТЫ)-кодирования элементы11. Кроме того пакет анализа данных указанных в настоящем Протоколе и на GitHub предоставляет новым и опытным исследователей с инструментами для анализа данных ATAC-seq. ATAC-seq является наиболее эффективным методом для сопоставления хроматина доступность через весь геном, и изменения в существующий протокол, которые будут введены здесь позволит исследователям для производства высококачественных данных с низкой митохондриальной ДНК загрязнения, снижение издержек виртуализации и повышение ATAC-seq пропускную способность.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Эта улучшенная протокол предоставляет пошаговые инструкции для выполнения ATAC-seq CD4 + лимфоцитов, от исходного материала цельной крови через анализ данных (рис. 1).

1. изоляция CD4 + Т-клеток из цельной крови

Примечание: Исходным материалом для этого протокола — 15 мл свежей цельной крови, собранных с помощью стандартных процедур, позволяя источник исходного материала должен выбираться на основе требований к исследованиям. Масштаб протокол, при необходимости. Предварительно теплой-фосфатный буфер (PBS) + сыворотка (FCS) 2% плода теленка до комнатной температуры (RT) и отрегулируйте центрифуги для RT перед началом процедуры обогащения клеток CD4 + T.

  1. 750 мкл человека CD4 + Т-клеток обогащения коктейль по 15 мл цельной крови в 50 мл Конические трубки и осторожно перемешать путем инверсии. Инкубируйте на RT на 20 мин. При завершении инкубации, добавляют 15 мл PBS + 2% FCS к трубе и осторожно перемешать путем инверсии.
  2. Подготовьте свежие 50 мл Конические трубки с 15 мл плотности среды. Тщательно слой разбавленной крови на вершину средней плотности, будучи уверенным, чтобы не нарушить плотность среднего артериального интерфейс, который формирует. Центрифуги для 20 минут 1200 x g и RT с ускорением, равным 1 и нисходящая тормозная OFF.
    Примечание: Важно, чтобы задать ускорение 1 и нисходящие тормозные OFF на центрифуге, чтобы избежать нарушения слоя клеток в средней плотности.
  3. Соберите обогащенного CD4 + Т-клеток от плотности среднего/плазмы интерфейса с помощью пипетки передачи узкие стволовых. Передавать собранные клетки свежие 50 мл Конические трубки. Центрифуга собранных CD4 + Т-клеток для 8 мин в 423 x g и RT.
    Примечание: Убедитесь в том, что возвращение центрифуги ускорение в 9 и нисходящей тормоз в ON для шага 1.3 и все из следующих действий.
  4. Отбросить супернатант и помыть лепешка клетки дважды с 50 мл PBS + 2% FCS, центрифугирование 8 мин в 423 x g и RT. Discard окончательный супернатант мыть и приостановить Пелле мыть ячейки в 2 мл PBS + 2% FCS.
  5. Подсчет количества ячеек с помощью Горяева. Чтобы продолжить ATAC-seq, переходите к шагу 2.3. Чтобы заморозить клетки для последующей обработки, перейдите к пункт 1.6.
  6. Добавьте 1 mL свежих замораживания среды (FCS 90% + 10% диметилсульфоксида) за 1 миллион клеток. Аликвота 1 мл клеток в замораживания среды в криогенных безопасных трубок. Место труб на-80 ° C ночь в контейнере медленного замораживания. Следующий день, передачи трубки для жидкого азота для длительного хранения.
    Примечание: 1 миллион клеток CD4 + T будут изолированы на 2 мл первоначального объема цельной крови. Заморозить 500000 клеток в 1 мл аликвоты замораживания среды. Сделайте свежий замораживания среды при каждом использовании.

2. активировать и очистить CD4 + Т-клеток

Примечание: Этот быстрый протокол для активации и очистки CD4 + Т-клеток только требует 48 h и результаты в 95% жизнеспособным, активированный CD4 + Т-клеток. Прохладный центрифуге до 4 ° C перед началом протокол.

  1. Размораживание 1 флакон (500 000) CD4 + Т-клеток в ванну воды 37 ° C, до тех пор, пока просто растаял лед. Аккуратно перенести 15 мл Конические трубки, содержащих 9 мл подогретым СМИ Розуэлл парк Мемориальный институт-1640 (RPMI 1640), дополнены 10% FCS, именуемый в дальнейшем полный RPMI клетки.
    Примечание: Не позволяйте клетки таять полностью избежать воздействия ДМСО.
  2. Центрифуги для 6 мин на 1500 x g и 4 ° C. Отменить супернатант и осторожно приостановить гранулы в 2 мл полной RPMI. Повторите спин вниз, удалить супернатант и осторожно приостановить клетки в 0,5 мл полной RPMI.
  3. Подсчет количества ячеек с помощью Горяева. Регулировка плотности суспензии клеток с полным RPMI для пластины 50 000 ячеек в 200 мкл на хорошо раунд 96-луночных нижней плиты.
    Примечание: Из одной замороженные трубы 500K CD4 + Т-клеток, лунках 10 50000 CD4 + Т-клеток в 200 мкл в колодец.
  4. Подготовьте магнитные бусы, конъюгированных с человеческих антител анти CD3 и анти CD28 T-активатор.
    1. Аликвота 12,5 мкл человека T-активатор CD3/CD28 бусы на сэмпл ATAC-seq для 1.5 мл. Вымойте бусины с 1 мл раствора 1 x PBS и поместить трубку на магнит за 1 мин.
    2. Тщательно удалить отменить ясно супернатанта, извлеките трубку от магнита и приостановить бисер в 13 мкл завершить RPMI на ATAC-seq сэмпл.
      Примечание: Вычислить количество бисера необходимые основанные на количество выборок ATAC-seq, обрабатывается. Этот протокол требует 12,5 мкл CD3/CD28 бусы на 500000 клеток, которая представляет собой один ATAC-seq образца.
  5. Активируйте CD4 + Т-клеток. Сбор 500 000 клеток в 2.1 мл полного среднего RPMI в 15 мл Конические трубки и 12,5 мкл предварительно выстиранные человека T-активатор бусины. Смешайте нежно инвертирование трубки.
  6. Осторожно передать стерильные водохранилище и плита 200 мкл клеток с бисером в хорошо раунд 96-луночных днище с помощью многоканальных дозаторов клетки с бисером. Проинкубируйте 48 ч при 37 ° C, 5% CO2 инкубатора.
  7. После инкубации, центрифуга 96-луночных пластина для 8 мин в 423 x g и RT. удалить 100 мкл среды на колодец из 96-луночных пластины, собирая его коническая труба прежде чем выбросить для обеспечения без потери шарик. Ресуспензируйте Пелле ячейки в остальные 100 мкл и собирать все в 1,5 мл.
    Примечание: 10 скважин активированные Т-клеток будут собраны в томе 1 мл.
  8. Выполните CD4 + изоляции. Добавьте 50 мкл предварительно выстиранные CD4 конъюгированных бусины 500000 клеток в 1 мл полной RPMI. Объединить бусы и клетки, пипетки. Проинкубируйте втечение 20 мин при температуре 4 ° C в холодильнике. Агитируйте бусы и ячейку смесь каждые 6 минут.
    Примечание: Этот протокол должен использоваться для одного образца 500000 клеток. Внести необходимые коррективы для двух или более образцов 500 000.
  9. При завершении инкубации, место трубки на магните для 2 мин снимите и выбросьте супернатанта, когда ясно. Вымойте шарик прыгните клетки путем удаления трубки из магнита, приостановив шарик прыгните клеток в 1 мл PBS + 2% FCS, замена трубки на магните за 1 мин и отбрасывая ясно супернатант. Повторите этот процесс для в общей сложности 3 стирок.
    Примечание: Будьте осторожны, чтобы не отказаться от любой бисер во время мойки.
  10. После окончательного вымыть поместить трубку на магните для 1 мин удалить и удалить супернатант и место гранулы на льду. Перейдите к разделу 3 (ATAC-seq).

3. ATAC-seq

Примечание: В этом шаге ядер изолированы от активированных клеток CD4 + T для ATAC-seq. Буфер lysis, используемые в настоящем протоколе была улучшена быть мягче на ядрах, что приводит к более эффективным пищеварение и более качественных результатов. Выполняются все действия центрифугирования в разделе 3 с фиксированным углом центрифуги, поддерживается на 4 ° C. Прохладный центрифуги перед началом протокол.

  1. Выполняйте ядер изоляции. Ресуспензируйте бусы и клетки с холодной литического буфера (10 мм трис-HCl, рН 7,4, 10 мм NaCl, 3 MgCl2, полисорбат 20 0,03%). Центрифуга сразу на 500 x g 10 мин при 4 ° C. Снимите и выбросьте супернатант.
  2. Выполните Транспозаза реакции. Приостановить действие отдельных ядер лепешка с 50 мкл Tn5 Транспозаза смеси (Таблица 1). Инкубируйте в Термоциклер на 30 минут при 37 ° C 40 ° C крышкой, держа на 4 ° C при полной.
  3. После thermocycling немедленно выполнить быстрый настольная центрифуга спин вниз и поместить трубку на магните за 1 мин для удаления бусы из продукта.
  4. Передавать четкое супернатант из трубки на магните столбец очистки ДНК. Промойте колонку с 250 мкл буфера PB и дважды с 750 мкл буфера PE. Элюировать образца в 10 мкл буфера. Перейти непосредственно к шагу 3.5.
    Примечание: Этот шаг усиливает фрагментов ДНК с перевязаны адаптеров, здесь называют ATAC-seq библиотеки. Чтобы Мультиплекс нескольких библиотек ATAC-seq для запуска на одном NGS Лейн, используйте неиндексированные грунтовка 1 для всех образцов и различные индексированные 2 праймера для отдельных образцов (Таблица 2). Праймеры используются в рабочей концентрации 1,25 мкм.
  5. Настройка первоначального реакции амплификации PCR в свободной от нуклеиназы ПЦР-пробирку, объединяя компоненты в порядке и объеме, указанных в Таблица 3. Уложите Термоциклер ПЦР-пробирку и запустите программу амплификации PCR с велосипедного условия, указанные в таблице 4.
  6. Отслеживать реакция, ПЦР. Настройка реакции ПЦР в свободной от нуклеиназы ПЦР-пробирку, объединяя компоненты в порядке и сумме, указанной в таблице 5. Место в машину ПЦР и цикл как указано в таблице 6.
    1. Чтобы определить, что оптимальное количество дополнительного усиления циклов для остальных 45 мкл реакции, создайте участок с номером цикла на оси x и относительной флуоресцирования (РФС) на оси y. Оптимальное количество дополнительного усиления циклов — одну треть количество циклов, которые он принимает для реакции ПЦР для достижения плато.
      Примечание: Мониторинг реакции ПЦР позволяет для определения оптимального числа циклов PCR, требуемой для получения оптимального библиотека фрагмент амплификации при сведении к минимуму GC содержание и размер смещения.
  7. Завершите окончательный амплификации PCR оставшиеся 45 мкл реакции PCR. Место ПЦР-пробирку с усиление реакции от шаг 3.5 обратно в Термоциклер и запустить программу, как описано в таблице 7.
    Примечание: Для образцов, обрабатываются как описано в настоящем Протоколе оптимальное общее количество циклов амплификации PCR преисполнена решимости быть 12.
  8. После завершения амплификации очищайте библиотеки, используя набор для очистки ПЦР после производителя протокол, элюирующие в 25 мкл буфера.
    Примечание: Усиленные библиотек можно хранить при 4 ° C до 48 ч или замороженные при температуре-20 ° C для длительного хранения.

4. ATAC-seq библиотека анализ качества

Примечание: Важно проверить качество и количество библиотек ATAC-seq до следующего поколения последовательности. Качество и количество библиотек должны оцениваться с использованием коммерчески доступные наборы (см. Таблицу материалы).

  1. Оценить качество и количество библиотек ATAC-seq, используя микрофлюидика-платформа для калибровки, количественной оценки и контроля качества ДНК. Смотрите Рисунок 2 представителя качества оценки результатов.
    Примечание: Концентрация ATAC-seq библиотек должна быть > 1 нг/мкл для получения качественных результатов секвенирования. На среднем, 30 Нм в 25 мкл был получен.

5. последовательность и анализ данных

Примечание: Этот анализ конвейер позволяет пользователям контролировать качество чтения карт процедуры, изменить координаты для экспериментального дизайна и призываем пиков течению анализа. Ниже приведены команды линии и объяснение исполнения. Пакет анализа данных доступен в (https://github.com/s18692001/bulk_ATAC_seq).

  1. Последовательность подготовленный библиотек на следующего поколения секвенсор для чтения средняя глубина 42 миллиона чтений на сэмпл.
  2. Оцените качество чтения последовательности, проверяя файлы, созданные FastQC12 программного пакета с помощью команды:
    fastqc -o < каталог с выходными данными >< fastq_file >
  3. Трим основы читает Trimmomatic13 программного обеспечения, при необходимости, как определено FastQC проверки качества, используя команду (для пары закончился):
    Java-jar < путь к trimmomatic jar-файл > PE < input1 >< input2 >< парных output1 >< непарных output1 >< паре вып.2 >< непарных вып.2 > HEADCROP: < культур баз >
  4. Выровняйте читает генома человека ссылки (hg38), Bowtie214 программного обеспечения:
    bowtie2 - x < ссылка геном > -1 < входной пары 1 >< входного пара 2 > -S < выходной SAM файл >
    Примечание: Аргумент - x для базовое имя индекса для ведения генома, и -S для вывода формата Сэм.
  5. Проверите thequality, сопоставленных с помощью пакета flagstat Samtools15 гласит:
    SAMtools flagstat < BAM файл >
  6. Сортировать сопоставленных читает файл и удалить дубликаты, с помощью инструмента16 Picard:
    Java-jar picard.jar SortSam ввода = < имя входного файла SAM > вывода = < имя файла вывода отсортированы BAM > SORT_ORDER = координат» и «java-jar picard.jar MarkDuplicates ввода = < отсортированных BAM файл > вывода = < BAM выходной файл без дубликатов > REMOVE_DUPLICATES = TRUE
  7. Файл индекса BAM, обрезать неиспользуемые хромосома читает и сдвиг координаты для экспериментальной причине ATAC-seq17:
    Java-jar picard.jar BuildBamIndex ввода = < BAM файл >
    SAMtools idxstats < Input BAM файл > | вырезать -f 1 | grep - v chrY | grep - v ЦПЧМ | grep - v chrUn | xargs samtools посмотреть -b < Input BAM файл >>< вывод обрезается BAM файл >
    bedtools bamtobed -i < Input подстриженные BAM файл >>< вывод обрезается кровать файл >
    awk ' начать {OFS = «\t»}; {Если ($6 == «+») печать $1, $2 + 4, $3 + 4, $4, $5, $6; напечатать еще $1, $2-5, 3-5 $, $4, $5, $6}' < Input подстриженные кровать файл >< Trimmed смещается кровать файл >
  8. Удаление чтений, которые сдвигаются, чтобы негативные координации:
    awk «{если ($2 > 0) напечатать «\t» $2 «\t» $3 «\t» $4 «\t» $5 $1 «\t» $6}» < Input кровать файл >< файл кровать координации non отрицательного вывода >.
  9. Преобразуйте файл кровати BAM файл для следующих DiffBind18 анализа:
    bedtools bedtobam -i < Input кровать файл > -g < ссылкой генома >< BAM выходной файл >
  10. Выполнить вызов пик DiffBind18 программного пакета:
    macs2 callpeak -t < Input BAM файл > -f BAM -g hs - nomodel--nolambda--держать dup все--вызов саммиты--outdir < путь к каталогу выходных > - n < имя > -B - q 0,01--БДГ--сдвиг -100--extsize 200
    Примечание: После фильтрации, ожидать, что медиана 37 миллионов чтений на сэмпл. Митохондриальная ДНК загрязнение будет варьироваться от 0,30% – 5,39% (1,96% в среднем). Там будет низкий уровень умножить сопоставленных гласит (6,7% – 56%, 19% в среднем), и относительно высокий процент использования ядерных читает (60% – 92%, 79% в среднем).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

От 15 мл свежей цельной крови этот протокол генерирует в среднем 1 миллион клеток CD4 + T. Эти могут быть заморожены для последующей обработки или использовать немедленно. Жизнеспособность клеток CD4 + T, свежие или талой, был последовательно > 95%. Этот метод изоляции клеток CD4 + T позволяет гибкость в время исходного материала и коллекции. Эта улучшенная протокол ATAC-seq производит окончательный библиотека превышает 1 нг/мкл для виртуализации. Контроль качества, с использованием ко...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Измененный Протокол ATAC-seq, представленные в этой статье обеспечивает воспроизводимость результатов с минимальными митохондриальной ДНК загрязнения. Протокол была использована для успешно характеризуют хроматина архитектура человека первичного получения10, человека моноцитов, дендритные клетки мыши (Неизданное), и культивировали меланома клеток линии11. Мы ожидаем, что это улучшение лизис условие имеет потенциал, чтобы работать для других типов клеток, а также. Предполага...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы благодарим Атседе Siba для технической поддержки. ЦСК поддерживается 1R61DA047032 гранта NIH.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1x PBS, SterileGibco10010023Можно использовать другие сопоставимые продукты.
5810/5810  R Swing Bucket Охлаждаемая центрифуга объемом 50 мл, 15 мл и 1,5 мл Tube BucketsEppendorf22625501Можно использовать другие сопоставимые продукты.
96 Пластина с круглым дномThermo Scientific163320Можно использовать другие сопоставимые продукты.
Система ленточных станций Agilent 4200AgilentG2991AAрекомендуется для оценки качества.
CryotubesThermo Scientific374081может использовать и другие аналогичные продукты.
DMSOSigmaD8418может использовать другие аналогичные продукты.
Dynabeads Т-активатор человека CD3/CD28Invitrogen Life Technologies11131DКритический компонент
Динабисеры Нетронутые Человеческие CD4 Т-клетки НаборInvitrogen Life Technologies11346DКритический компонент
ДинамагнетInvitrogen Life Technologies12321D Критическийкомпонент
FCSGemini Bio Products100-500Можно использовать другие сопоставимые продукция.
Высокочувствительный набор ДНКAgilent50674626рекомендуется для оценки качества.
Хлорид магния, гексагидрат, молекулярная биология КлассSigmaM2393Можно использовать другие сопоставимые продукты.
Набор для очистки ПЦР MinElute (буфер PB, буфер PE, буфер для элюирования)Qiagen28004Критический компонент
Mr. FrostyThermo Scientific5100-0001Можно использовать другие сопоставимые продукты.
NaCl, Молекулярная биология КлассSigmaS3014Можно использовать другие сопоставимые продукты.
NEBNext High Fidelity 2x PCR Master MixNew England BioLabsM0541Critical Component
Nextera DNA Library Preparation Kit (2x TD буфер, фермент Tn5)IlluminaFC1211030Critical Component
Nucleasa Free Sterile dH20Gibco10977015Можно использовать другие сопоставимые продукты.
Polysorbate 20 (Tween20)SigmaP9416Можно использовать другие сопоставимые продукты.
PowerUp SYBR Green Master MixApplied BiosystemsA25780
Прецизионная водяная баняThermo ScientificTSGP02Можно использовать другие сопоставимые продукты.
QIAquick PCR Purification KitQiagen28104Critical Component
Qubit dsDNA HS Assay KitInvitrogen Life TechnologiesQ32851Рекомендуется для оценки качества.
Qubit FlouroMeterInvitrogen Life TechnologiesQ33226Рекомендуется для оценки качества.
Rosette Sep Human CD4+ Density MediumStem Cell Technologies15705Critical Component
Rosette Sep Human CD4+ Enrichment Cocktail StemCell Technologies15022Critical Component
RPMI-1640Gibco11875093Можно использовать другие сопоставимые продукты.
Стерильный ResevoirThermo Scientific8096-11Можно использовать и другие сопоставимые продукты.
Термоамплификатор T100 с подогреваемой крышкойBioRad1861096может использовать другие аналогичные продукты.
Tris-HCLSigmaT5941Можно использовать и другие сопоставимые продукты.
с критическим компонентом

Ссылки

  1. Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  2. Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide. Current Protocols in Molecular Biology. 21, 1-29 (2015).
  3. Song, L., Crawford, G. E. DNase-seq: a high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells. Cold Spring Harbor Protocols. (2), (2010).
  4. Pajoro, A., Muiño, J. M., Angenent, G. C., Kaufmann, K. Profiling Nucleosome Occupancy by MNase-seq: Experimental Protocol and Computational Analysis. Methods in Molecular Biology. 1675, 167-181 (2018).
  5. Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).
  6. Rosenberg, A. B., et al. Single-cell profiling of the developing mouse brain and spinal cord with split-pool barcoding. Science. 360 (6385), 176-182 (2018).
  7. Corces, M. R., et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution. Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).
  8. Lu, Z., Hofmeister, B. T., Vollmers, C., DuBois, R. M., Schmitz, R. J. Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes. Nucleic Acids Research. 45 (6), e41(2017).
  9. Lara-Astiaso, D., et al. Chromatin state dynamics during blood formation. Science. 345 (6199), 943-949 (2014).
  10. Gate, R. E., et al. Genetic determinants of co-accessible chromatin regions in activated T cells across humans. Nature Genetics. , (2018).
  11. Sanjana, N. E., et al. High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome. Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).
  12. Andrews, S. FastQC A Quality Control tool for High Throughput Sequence Data. Babraham Bioinformatics. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc (2018).
  13. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  14. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  15. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  16. Broad Institute. Picard Tools. , Available from: http://broadinstitute.github.io/picard/ (2018).
  17. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  18. Stark, R., Brown, G. DiffBind: Differential Binding Analysis of ChIP-Seq Peak Data. , Available from: http://bioconductor.org/packages/devel/bioc/vignettes/DiffBind/inst/doc/DiffBind.pdf (2018).
  19. Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
  20. Wu, J., et al. The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos. Nature. 534 (7609), 652-657 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

ATAC seqTn5
ATAC-seq Assay с низкой митохондриальной ДНК загрязнения от первичного человека CD4 + Т-лимфоцитов
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.