ATAC-seq Assay с низкой митохондриальной ДНК загрязнения от первичного человека CD4 + Т-лимфоцитов

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол для выполнения assay для виртуализации (ATAC-seq) активированный человека лимфоцитов CD4 + Транспозаза доступные хроматина. Протокол был изменен для сведения к минимуму загрязнения митохондриальной ДНК читает от 50% до 3% путем введения нового буфера lysis.

Аннотация

ATAC-seq стал широко используется методология в изучении эпигенетики из-за его быстрый и простой подход к картирования генома всей доступной хроматина. В этой статье мы представляем улучшение ATAC-seq протокол, который уменьшает загрязнение митохондриальной ДНК читает. В то время как предыдущие протоколы ATAC-seq боролись с читает в среднем на 50%, загрязняя митохондриальной ДНК, оптимизированный литического буфера, представил в настоящем Протоколе уменьшает загрязнение митохондриальной ДНК в среднем 3%. Это улучшение ATAC-seq протокол обеспечивает около 50% сокращение стоимости последовательности. Мы демонстрируем, как эти библиотеки ATAC-seq высокого качества могут быть получены из активированных CD4 + лимфоцитов, шаг за шагом инструкции от CD4 + лимфоцитов изоляции из цельной крови путем анализа данных. Этот улучшенный протокол ATAC-seq протестирована в широком диапазоне типов клеток и будет немедленно воспользоваться исследователи, изучая хроматина доступности.

Введение

Assay для Транспозаза доступные хроматина виртуализации (ATAC-seq) быстро стал ведущим методом для допроса хроматина архитектуры. ATAC-seq можно определить регионы доступны хроматина через процесс tagmentation, фрагментации и пометки ДНК же ферментом, производить библиотеки, с которыми последовательности можно определить доступность хроматина через весь геном. Этот процесс tagmentation при посредничестве гиперактивный Tn5 Транспозаза, который режет только открытые регионы хроматина из-за nucleosomic их пространственной помех. Как она режет, Tn5 Транспозаза также вставляет последовательность адаптеры, которые позволяют для быстрого библиотека строительство методом ПЦР ....

Протокол

Эта улучшенная протокол предоставляет пошаговые инструкции для выполнения ATAC-seq CD4 + лимфоцитов, от исходного материала цельной крови через анализ данных (рис. 1).

1. изоляция CD4 + Т-клеток из цельной крови

Примечание: Исходным материалом для этого протокола — 15 мл свежей цельной крови, собранных с помощью стандартных процедур, позволяя источник исходного материала должен выбираться на основе требований к исследованиям. Масштаб протокол, при необходимости. Предварительно теплой-фосфатный буфер (PBS) + сыворотка (FCS) 2% плода теленка до комнатной температуры (RT)....

Результаты

От 15 мл свежей цельной крови этот протокол генерирует в среднем 1 миллион клеток CD4 + T. Эти могут быть заморожены для последующей обработки или использовать немедленно. Жизнеспособность клеток CD4 + T, свежие или талой, был последовательно > 95%. Этот метод изоляции клеток CD4 + T позволяет гибкость в время исходного материала и коллекции. Эта улучшенная протокол ATAC-seq производит окончательный библиотека превышает 1 нг/мкл для виртуализации. Контроль качества, с использованием ко.......

Обсуждение

Измененный Протокол ATAC-seq, представленные в этой статье обеспечивает воспроизводимость результатов с минимальными митохондриальной ДНК загрязнения. Протокол была использована для успешно характеризуют хроматина архитектура человека первичного получения¹⁰, человека моноцитов, дендритные клетки мыши (Неизданное), и культивировали меланома клеток линии¹¹. Мы ожидаем, что это улучшение лизис условие имеет потенциал, чтобы работать для других типов клеток, а также. Предполага.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1x PBS, Sterile	Gibco	10010023	Можно использовать другие сопоставимые продукты.
5810/5810  R Swing Bucket Охлаждаемая центрифуга объемом 50 мл, 15 мл и 1,5 мл Tube Buckets	Eppendorf	22625501	Можно использовать другие сопоставимые продукты.
96 Пластина с круглым дном	Thermo Scientific	163320	Можно использовать другие сопоставимые продукты.
Система ленточных станций Agilent 4200	Agilent	G2991AA	рекомендуется для оценки качества.
Cryotubes	Thermo Scientific	374081	может использовать и другие аналогичные продукты.
DMSO	Sigma	D8418	может использовать другие аналогичные продукты.
Dynabeads Т-активатор человека CD3/CD28	Invitrogen Life Technologies	11131D	Критический компонент
Динабисеры Нетронутые Человеческие CD4 Т-клетки Набор	Invitrogen Life Technologies	11346D	Критический компонент
Динамагнет	Invitrogen Life Technologies	12321D Критический	компонент
FCS	Gemini Bio Products	100-500	Можно использовать другие сопоставимые продукция.
Высокочувствительный набор ДНК	Agilent	50674626	рекомендуется для оценки качества.
Хлорид магния, гексагидрат, молекулярная биология Класс	Sigma	M2393	Можно использовать другие сопоставимые продукты.
Набор для очистки ПЦР MinElute (буфер PB, буфер PE, буфер для элюирования)	Qiagen	28004	Критический компонент
Mr. Frosty	Thermo Scientific	5100-0001	Можно использовать другие сопоставимые продукты.
NaCl, Молекулярная биология Класс	Sigma	S3014	Можно использовать другие сопоставимые продукты.
NEBNext High Fidelity 2x PCR Master Mix	New England BioLabs	M0541	Critical Component
Nextera DNA Library Preparation Kit (2x TD буфер, фермент Tn5)	Illumina	FC1211030	Critical Component
Nucleasa Free Sterile dH20	Gibco	10977015	Можно использовать другие сопоставимые продукты.
Polysorbate 20 (Tween20)	Sigma	P9416	Можно использовать другие сопоставимые продукты.
PowerUp SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems	A25780
Прецизионная водяная баня	Thermo Scientific	TSGP02	Можно использовать другие сопоставимые продукты.
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	Critical Component
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen Life Technologies	Q32851	Рекомендуется для оценки качества.
Qubit FlouroMeter	Invitrogen Life Technologies	Q33226	Рекомендуется для оценки качества.
Rosette Sep Human CD4+ Density Medium	Stem Cell Technologies	15705	Critical Component
Rosette Sep Human CD4+ Enrichment Cocktail Stem	Cell Technologies	15022	Critical Component
RPMI-1640	Gibco	11875093	Можно использовать другие сопоставимые продукты.
Стерильный Resevoir	Thermo Scientific	8096-11	Можно использовать и другие сопоставимые продукты.
Термоамплификатор T100 с подогреваемой крышкой	BioRad	1861096	может использовать другие аналогичные продукты.
Tris-HCL	Sigma	T5941	Можно использовать и другие сопоставимые продукты.

с критическим компонентом