Изоляции и приемных передачи высоких соли лечить антиген представляя дендритные клетки

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол изолировать дендритные клетки из мышиных селезенки магнитные ячейку Сортировка и последующих приемных передачи в наивной мышей. Чтобы объяснить шаг за шагом процедуры приемных передачи и проточной цитометрии была выбрана модель высоким соли активированные дендритных клеток.

Аннотация

Избыток соли рацион способствует воспаление и играет жизненно важную роль в развитии артериальной гипертензии. Ранее мы обнаружили, что антиген представляя дендритных клеток (DCs) может смысле повышенных внеклеточного натрия приводит к активации NADPH оксидаза и формирование isolevuglandin (IsoLG)-аддуктов протеин. Эти IsoLG белка аддукты реагируют с self белки и поощрения государственных аутоиммунных как и гипертонии. Мы разработали и оптимизированы-современных методов для изучения функции DC в гипертензии. Здесь, мы предоставляем подробный протокол для изоляции, в vitro лечение с повышенными натрия и приемных передачи мышиных селезеночной CD11c⁺ клеток в получателей мышей, чтобы изучить их роль в гипертензии.

Введение

Избыток пищевой соли является одним из основных факторов риска гипертонии. ^{1 , 2} американской ассоциации сердца рекомендует более 2300 миллиграммов (мг) потребления натрия (Na⁺) в день, однако; менее 10% населения США отмечает эту рекомендацию. ^{3 , 4} скромные сокращения потребления Na⁺ снизить кровяное давление и уменьшить ежегодный новых случаев ишемической болезни сердца и инсульта в США на 20%. ⁵ основная проблема избыточного потребления поваренной соли является, что 50% из населенности гипертонической exhibits соли чувствительность, определяется как 10 мм ртутного столба, увеличение артериального давления после загрузки Na⁺ или же падение артериального давления после Na⁺ ограничения и диурез. ⁶ соли чувствительность также происходит в 25% нормотензивной лиц и является независимым предиктором смерти и сердечно-сосудистых событий. ^{7 , 8} соли зондирования механизмов с участием почечной гипертонии хорошо изучены; Однако последние исследования показывают, что иммунные клетки могут смысле Na⁺. ^{9 , 10}

Последние данные свидетельствуют о том, что изменения в экстра почечной Na⁺ обработка может вызвать накопление Na⁺ в интерстиции и содействовать воспаления. ^{11 , 12} нашей лаборатории и другие показали, что клетки врожденная и адаптивного иммунитета способствовать обострению гипертонии. ^{9 , 13 , 14 , 15} различных гипертонической стимулы, включая ангиотензина II, норадреналина и соли причиной макрофагов, моноцитов и лимфоцитов T для проникновения в почках и сосудистую и поощрения удержания Na⁺ , сужение сосудов, кровяное давление Высота над уровнем моря и конец орган ущерб. ^{9 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20} в предыдущих исследований, мы обнаружили, что DCs накапливать isolevuglandin (IsoLG)-белок аддукты в ответ на различные стимулы гипертонический, включая ангиотензина II и дока соль гипертонии. ¹⁴ IsoLGs Высокореактивная продуктов перекисного окисления липидов, которые быстро и ковалентно аддукт с lysines белков и их накопление связан с активацией DC. ¹⁴ недавно мы установили, что повышенные Na⁺ является мощным стимулом для IsoLG белка аддукт формирования в мышиных, которую DCs.⁹ Na⁺ вступления в DCs опосредуется через Амилорид чувствительных перевозчиков. Na⁺ затем обменять на кальция (Ca^{2 +}) через ЦС^{2 +} обменник Na⁺. CA^{2 +} активирует протеинкиназы C (PKC) который активирует NADPH оксидаза, ведущих к увеличению супероксида (O₂^{· -}) и IsoLG белка аддукт формирования. ⁹ приемных передачи соли облученных DCs воспламеняет гипертензии в ответ к югу прессорных доза ангиотензина II. ⁹

Выявление CD11c⁺ РС из тканей ограничивалась ранее иммуногистохимии и RT-PCR и изоляции РС была ограничена ячейку Сортировка по проточной цитометрии. Хотя поток цитометрии сортировки клеток является мощный метод для изоляции иммунных клеток, он является дорогостоящим, требует много времени и приводит к низкой доходности жизнеспособных клеток. Таким образом, мы оптимизировали протокол шаг за шагом ткани пищеварение, в пробирке стимуляции и приемных передачи CD11c⁺ DCs для изучения гипертонии.

Протокол

Университет Вандербильта институциональный уход животных и использование Комитета утвердили описываемые процедуры. Мышей размещены и заботу в соответствии с руководство по уходу и использованию лабораторных животных (национальных академий пресс. Пересмотренный 2010).

1. изоляция селезенки от мышей

1. Подготовить 1640 RPMI: 10% FBS, 0.10 мм HEPES, пируват натрия 1 мм, 50 мкм β-меркаптоэтанол и 1% пенициллина/стрептомицина.
2. Усыпить 10 – 12 недель-старых самцов мышей C57bl/6 вдыханием CO₂ . Спрей с груди и стороны мыши с 70% этиловом спирте. На левой стороне осторожно откройте брюшной полости подвергать селезенки и кожи.
3. С помощью небольших щипцы, осторожно переместить в кишечнике и печени к левой стороне мыши и тонкой ножницами аккуратно акцизных селезенки.
   Примечание: Этот шаг должен выполняться очень внимательно, как повреждение желудочно-кишечного тракта могут вызвать загрязнение.
4. Место каждого вырезан селезенки в обозначенные 15 мл конические трубка, содержащая 3 мл RPMI 1640 среды.

2. поколение одной клеточных суспензий из селезенки

Примечание: Селезенка может отделить в одну ячейку подвеска путем сочетания механических диссоциации плюс ферментативного пищеварения.

1. Приготовляют раствор переваривания селезенки, добавив коллагеназы D (1 мг/мл; 0,29 U/мг лиофилизованный препарат) и DNase I (0,1 мг/мл) подготовил RPMI 1640 среднего (см. шаг 1.1)
2. Используйте щипцы для передачи селезенки в C трубку (диссоциация трубка) содержащий 3 мл раствора переваривания селезенки.
3. Выполните механические диссоциации с использованием полуавтоматического гомогенизатор согласно инструкциям производителя.
   1. Место C трубу на полуавтоматических гомогенизатор, обеспечивая, что C трубка плотно помещается на вращающейся рукоятки. После установки C трубку, нажмите кнопку Пуск на полуавтоматических гомогенизатор для запуска селезенки 04.01 протокол для 60 s.
      Примечание: Механические диссоциации может также выполняться путем размещения 40 мкм фильтр на вершине 50 мл Конические трубки и аккуратно шлифовка селезенки через фильтр. После шлифования селезенки, через промойте фильтр 40 мкм с 10 мл RPMI средств массовой информации.
4. После механической диссоциации отсоедините трубку от гомогенизатор и выполнять ферментативного пищеварения. Проинкубируйте образцы для 15 минут при 37 ° C под непрерывного вращения (20 мин).
5. Перенести решение, дозирование в 50 мл Конические трубки после фильтрации через стрейнер 40 мкм. Промойте фильтр 40 мкм, с 10 мл Дульбекко в PBS (dPBS). Центрифуга клетки на 300 x g 10 мин при 4 ° C.
6. После центрифугирования аспирационная супернатант полностью и помыть лепешка, resuspending в 10 мл dPBS. Центрифуга на 300 x g 10 мин при 4 ° C.

3. изоляция CD11c⁺ РС от селезеночной одноклеточного подвеска

1. Ресуспензируйте Пелле клеток в 5 мл dPBS и подсчитать количество ячеек с помощью Горяева и Трипановый синий исключения.
2. Пелле клетки центрифугированием при 300 x g, 10 мин при 4 ° C.
3. Полностью удалить супернатант и Ресуспензируйте Пелле в 400 мкл магнитно-активируемые сортировки клеток (ПДК) буфера.
4. 100 мкл CD11c микрошарики (см. Таблицу материалы) за 1 x 10-⁸ клеток.
5. Вихревой суспензию клеток и проинкубируйте втечение 10 мин в холодильник на 4 ° C.
6. Добавьте 10 мл буфера MACs для мытья клетки. Центрифуга на 300 x g 10 мин при 4 ° C.
7. Полностью удалить супернатант и Ресуспензируйте в 500 мкл буфера MACs.

4. Магнитное разделение CD11c⁺ РСУ

Примечание: Магнитная сепарация делается вручную с магнитным сепаратором (см. Таблицу материалы) оснащен LS столбцы. Магнитная сепарация также может быть сделано автоматически с автоматизированной магнитный сепаратор. (см. Таблицу материалы).

1. Место столбце LS в магнитном поле Маков сепаратор и 15 мл Конические трубки под каждого столбца для сбора потока через.
2. Промойте LS столбца с 3 мл буфера.
3. Место суспензию клеток на каждый столбец LS и собирать потока через содержащих немеченого клетки.
4. Промойте колонку LS с 3 мл буфера MACs, собирая немеченого клетки, которые проходят через. Промойте колонку LS 2 раза.
5. Удалите столбец LS из магнитного сепаратора. Добавить 5 мл MACs буфера для каждого столбца и немедленно промыть магнитно помечены клетки, твердо погружаясь LS столбца в чистой 15 мл Конические трубки.
   Примечание: Это важно для выполнения двойной изоляции CD11c клеток для получения суспензии клеток высокой чистоты. Таким образом повторите шаги 3.1 через 4.5. и ссылку на Рисунок 4 для стандартов чистоты. Этот шаг улучшает чистоту CD11c⁺ клетки к 90 – 95%.
6. Определить CD11c⁺ DC номер на Горяева, с помощью исключения Трипановый синий. Разбавьте образец клеток в разведении 1:1 в 0,4% раствор Трипановый синий.
   Примечание: Non жизнеспособных клеток будет окрашенных синий, в то время как жизнеспособных клеток будет оставаться незапятнанной.
   1. Чтобы сделать это, тщательно заполнить Горяева с 10 мкл ячейки выборки разрежения и инкубировать в течение 1 минуты.
   2. Подсчитать ячейки в 4 квадратов 1 x 1 мм² в палате, которая была загружена для определения числа жизнеспособных клеток.

5. в Vitro высокой соль лечения CD11c⁺ РСУ

1. Подготовить DC питательной среды путем добавления 10% FBS, 0,1 мм HEPES, пируват натрия 1 мм, 50 мкм β-меркаптоэтанол и 1% пенициллина/стрептомицина 500 mL 1640 RPMI.
2. Подготовка 10 x DC высокой соли клетки культуры СМИ (400 мм), весом, 1,17 г NaCl и поместив его в стерильных 50 мл трубки сокола. Добавьте 50 мл стерильной DC клеток культуральных сред (подготовленных на шаге 5.1) 50 мл трубки сокола и вихревой пока NaCl в растворе.
3. Сразу же фильтр высоких соли DC культуры средств массовой информации с использованием вакуумной фильтрации через фильтр 0.2 мкм в капюшоне культуры клеток.
4. Центрифуга для каждой ячейки подвеска из селезенки в 300 x g 10 мин на 4ºС. Ресуспензируйте каждой ячейки Пелле в DC культуры средств массовой информации в концентрации 1 х 10⁶ клеток/мл.
5. Пипетка 900 мкл (приблизительно 1 х 10⁶ клеток) DC подвески в 24-ну плоское дно Falcon пластины. Добавьте 100 мкл высокой соли DC культуры средств массовой информации в каждой скважины для окончательного натрия концентрации 190 мм. Ярлык пластину и место в 37 ° C гумифицированный CO₂ инкубатора для 48 ч.

6. приемные передачи высоких соли лечить CD11c⁺ РСУ

1. После экстракорпорального стимуляции для 48 ч удалить пластину от 37 ° C гумифицированный CO₂ инкубатора.
2. Пипетка клетки культуры СМИ вверх и вниз Ресуспензируйте CD11c⁺ РСУ. пипетки все CD11c⁺ DC подвеска в соответствующей пометкой 1,6 мл трубки. Повторите этот шаг для каждого человека хорошо покрытием.
3. Центрифуга для каждого CD11c⁺ DC подвеска на 300 x g 10 мин при 4 ° C. Аспирационная супернатант. Ресуспензируйте DC лепешка с 100 мкл стерильные dPBS.
4. Ничья DC подвеска в 1 мл шприц с иглой 27 G ½ дюйма.
5. Место наивно 10 недельных C57bl/6 мышей-самцов под 2% изофлюрановая для достижения стабильного хирургические плоскости. Проверьте уровень анестезии с отсутствием педалей рефлекс. После того, как достигается стабильное хирургические плоскости, медленно и осторожно ввести иглу в ретро орбиталь пространство на угол около 30°.
   Примечание: Скос иглы 27 G должен быть направлен вниз, от глаз, чтобы предотвратить глазные повреждения.
6. Медленно и плавно придать CD11c⁺ DC подвеска (приблизительно 1 х 10⁶ клеток). После инъекции, осторожно удалите иглу для ретро орбитального пространства, сознавая не повредить глаза.
   Примечание: После инъекции должно быть мало или нет кровотечения. Приемных передачи CD11c⁺ DCs также могут быть выполнены с использованием метода и.в. инъекции (например, хвост вен). Мышь управления получают CD11c⁺ РСУ, которые были культивировали в обычной соли СМИ.
7. Удаление мышей из носовой конус и контролировать их приблизительно 30 мин при восстановлении от анестезии.

7. подготовка 14 день низкодозированные ангиотензин II (140 нг/кг/мин)

1. Подготовьте буфере ангиотензина II, добавив 500 мкл 5 М NaCl и 300 мкл уксусной кислоты. Квантовая Satis (QS) до 30 мл дейонизированной H₂0.
2. Растворите ангиотензина II до 5 мг/мл Стоковый раствор с буфером ангиотензина II. Разбавьте ангиотензина II Стоковый раствор с дополнительного буфера для достижения конечной концентрации, таким образом, что осмотические minipump будет доставлять ангиотензина II в размере 140 нг/кг/мин в зависимости от веса каждой мыши.
   Примечание: Основные ангиотензин II (мг) = (мышь, вес (г) x 0.2 мг / день x 14 дней) / 1000
   Подготовлено ангиотензин II (мг) = (основные ангиотензина II x 260 мкл) / насос скорость (0,25 мкл/hr)
   Объем запасов ангиотензин II (мкл) = подготовленных ангиотензина II / фондовый концентрации (5 мг/мл) x 1,000
   Разбавляют объем (мкл) = 270 - ангиотензин II объем запасов
3. Добавить ангиотензина II объем запасов в разбавленной (ангиотензина II буфер) на основе томов, рассчитанные на шаге 7.2.
4. Под капотом культуры стерильных клеток откройте осмотические minipump.
5. Добавьте разбавленные ангиотензина II решения и изгнать воздух из шприца и иглы. Вставьте предоставленный иглы в нижней части осмотические minipump и медленно вводить ангиотензина II решения во время медленно и осторожно втягивания иглу из мочевого пузыря.
6. Вставьте головку осмотические minipump осмотического мочевого пузыря полностью, обращая внимание, чтобы не получить любой воздух в мочевом пузыре.

8. Имплантация 14 день низкодозированные ангиотензина II осмотического Minipumps

1. Через десять дней после приемных передачи CD11c⁺ РСУ, место мышей в изофлюрановая камере начать анестезии и затем переместить мышь на носовой конус непрерывно получать 2% изофлюрановая для достижения и поддержания надлежащих хирургических плоскости.
2. Удаление мех вдоль спинной стороне шеи с Клипперс подготовить хирургической сайта. Чистота области побрился с 70% этиловом спирте, следуют Бетадин 7,5% до начала операции.
3. Создайте небольшой разрез (примерно 1,5 см) в коже. Вставьте hemostats в разрез для создания подкожной карман для размещения осмотические minipump.
4. Вставьте minipump в подкожной карман. Закройте кожи раны с 2-3 хирургические скобы и применить другое приложение 7,5% Бетадин в рану и скобы для предотвращения инфекции.
5. Контроль мышей за 30 – 60 мин во время восстановления от анестезии перед возвращением их в их клетках.
   Примечание: Мышь необходимо контролировать до 3 – 4 дня после имплантации осмотические minipump.

9. изоляция селезенки мышей получателей для анализа потока гранулярных

1. После того, как 14 дней низкодозированные ангиотензина II настоя, изолировать селезенки от мышей, получение в пробирке высокой соли лечить DCs приемных переводом. Следуйте точные шаги, перечисленные выше (шаги 1 и 2).

10. поверхностные окрашивания

1. Передача splenocytes, высокомобильна в ПБС в полистирол СУИМ трубки и центрифуги на 350 x g 8 мин при 4 ° C. Аспирационная надосадке после центрифугирования. Мыть дважды с 1 мл буфера MACs и центрифугирования (350 x g, 8 мин, 4 ° C).
   1. Разделите splenocytes одинаково на разных полистирола СУИМ труб, основанный на количество потока гранулярных панелей желаемого.
2. Чтобы выполнить Live/мертвые клетки жизнеспособности окрашивание, вымойте клетки с ПБС и центрифуги (350 x g, 8 мин, 4 ° C). Ресуспензируйте в 1 мл ПБС и 1 мкл жизнеспособность клеток пятна (см. таблицу материалов). Инкубируйте 15 мин при температуре 4 ° C (холодильник или на льду) покрыты пленкой для защиты от света.
3. Во время инкубации пятно жизнеспособность клеток приготовит коктейль антител на поверхности клеток, пятнать в соответствующий объем буфера MACS.
4. Вымыть клетки с 1 мл раствора MACS буфера, центрифуги (350 x g, 8 мин., 4 ° C) и Ресуспензируйте Пелле каждой ячейки с 100 мкл антител коктейль. Инкубировать защищенный от света за 30 мин при 4 ° C.
   Примечание: Каждое антитело цитометрии потока является уникальным, и весьма полезным и рекомендуется определить оптимальное количество антител, необходимых, выполняя кривой титрования дозы для каждого конкретного антитела.
5. Вымыть клетки дважды с 1 мл буфера MACS и Ресуспензируйте splenocytes в соответствующее количество MACS буфера для потока гранулярных анализа.

Результаты

Рисунок 1 представляет собой схематическое изображение описанные выше меры. Изолированные мышиных селезенки сортируются для CD11c⁺ РСУ, магнитные ячейку Сортировка и покрытием в обычной соли СМИ (NS; 150 ммоль NaCl) или высокой соли СМИ (HS; 190 ммоль NaCl) за 48 ч. CD11c⁺ РСУ восприимчивую затем передаются ретро орбитального инъекции для наивного получателей мышей. Десять дней спустя, мышей имплантируются с осмотическим minipumps инфузи...

Обсуждение

В текущем протоколе, мы оптимизировали процедуры изолировать CD11c⁺ РС из селезенки мышей и восприимчивую перенести их в наивной животных для изучения роли контроллеров домена в Солт индуцированной гипертонии. Этот протокол может быть адаптирована для изоляции и восприимчивую передачи поднаборов другие иммунные клетки, макрофаги, моноцитов и адаптивной иммунных клеток, включая лимфоцитов T и B. Мы оптимизировали процесс переваривания селезенки для достижения адекватного ячейку выживания и стабильности DC повер...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
APC/Cy7 антимышь CD11c	Biolegend	117324
бегущий буфер autoMACS	Miltenyi Biotec	130-091-221
CD11c Микрогранулы Ultrapure	Miltenyi Biotec	130-108-338
Коллагеназа D	Roche	11088866001
DNase I	Roche	10104159001
DPBS без кальция и магния	Corning	21-031-CV
FcR Блокирующий реагент	Miltenyi Biotec	130-092-575
FITC анти-мышь CD45	Biolegend	103108
GentleMACS C tube	Miltenyi Biotec	130-096-334
Диссоциатор GentleMACS	Miltenyi Biotec	130-093-235	Протокол использования: Селезенка 04.01
LIVE/DEAD фиксируемый набор для окрашивания фиолетовыми мертвыми клетками	Invitrogen	L34964
LS Колонки	Miltenyi Biotec	130-042-401
Сепаратор QuadroMAC	Miltenyi Biotec	130-090-976
RPMI 1640 средний	Gibco	11835-030