Методическая статья

Строительство и использование электрической стимуляции камеры для укрепления Остеогенные дифференцирования мезенхимальных стволовых стромальных клеток In Vitro

DOI:

10.3791/59127

⸱

31 января 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Frankfurt Initiative for Regenerative Medicine, Johann Wolfgang Goethe-University, 2J. Crayton Pruitt Family Department of Biomedical Engineering, University of Florida

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол для строительства палаты культуры клеток, предназначен подвергать клетки различных видов электрической стимуляции и его использование в лечении мезенхимальных стволовых клеток для повышения Остеогенные дифференциации.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для ускорения заживления кости в ткани, инженерные подходы широко использовались мезенхимальных стволовых стромальных клеток (Майкрософт) (MSCs). Электрическая стимуляция (приблиз) продемонстрировал увеличение MSC Остеогенные дифференциации в пробирке и поощрять кости Исцеление в клинических условиях. Здесь мы описываем строительной палаты культуры клеток приблиз и его использование в лечении крыса кости-костного мозга производные MSC активизировать Остеогенные дифференциации. Мы обнаружили, что лечение MSCs с приблиз на 7 дней приводит к значительным увеличением Остеогенные дифференциации, и главное, это про Остеогенные эффект сохраняется долго после того, как прекращается (7 дней) приблиз. Этот подход предварительной обработки MSCs с приблиз активизировать Остеогенные дифференциация может использоваться для оптимизации костной ткани, инженерные результаты лечения и, таким образом, помочь им в достижении их полный терапевтический потенциал. Помимо этого приложения эта палата культуры клеток приблиз и протокол может также использоваться для расследования других приблиз чувствительных клеток поведения, такие как миграция, распространения, апоптоз и насадку леска.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Увеличение травма или заболевание индуцированной костных дефектов проходят лечение с использованием различных сочетаний технологий регенеративной медицины и клеточной терапии. MSCs являются клетки выбора такого лечения, из-за их относительно высокой активности остеогенные, изоляции и расширение эффективности и безопасности1. Для максимизации их Остеогенные активность и, таким образом, оптимизировать их терапевтической эффективности, были введены несколько методов для манипулирования MSCs до их использования в этих методов лечения (как рассмотрено Mauney et al.2). Один из таких методов является приблиз, который был показан для повышения MSC Остеогенные дифференциации в пробирке3 и кости Исцеление в естественных условиях4. Несмотря на растущее количество исследований, посвященных лечении MSCs с приблиз оптимальный режим для максимального приблиз в про Остеогенные эффект еще предстоит определить.

Другие в пробирке методы, с помощью приблиз используют соли мосты, погруженной в среде культуры, которая отделяет клетки от металлических электродов5. Преимуществом этого является, что доставку приблиз через мосты соли устраняет введение химических побочных продуктов (например, коррозии металлических электродов), которые могут быть цитотоксических. Несмотря на это преимущество соль мосты являются обременительными для работы с, и они доставить приблиз отличается от что поставленный в в естественных условиях модели, что делает его трудно соотнести результаты, полученные при использовании двух систем. Установок, которые доставляют приблиз через металлические или углеродных электродов, фиксированной внутри скважины культуры клеток (как рассмотрено Hronik-Тупак и Каплан6) лучше имитировать устройства, используемые в естественных условиях; Однако эти устройства являются трудно очистить/стерилизации между использованиями и ограничено количество клеток, которые могут быть изучены на эксперимент. Мы разработали приблиз камеры, представленные здесь, специально для устранения ограничений этих установок. Хотя большинство из нашего опыта, с помощью этой камеры приблиз с 2D и 3D культур, содержащих костного мозга и жировой ткань производных MSCs3,4, основным преимуществом этой камеры является то, что он универсален и с относительно малой изменения, могут быть адаптированы для изучения других типов клеток под целый ряд различных условий.

Здесь мы описываем строительство приблиз палаты культуры клеток; Затем мы продемонстрировать его использование в лечении MSCs с различных схем приблиз и измерения результирующий эффект на Остеогенные дифференциации. MSC Остеогенные дифференциация оценивается через отложение кальция, щелочной фосфатазы и остеогенном маркер экспрессии генов. Важно отметить, что в прошлых экспериментов, которые используются этой установки, мы наблюдали что эти про Остеогенные эффекты сохраняются долго после того, как приблиз лечение было прекращено.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Строительство электрической стимуляции клеток культуры камеры

  1. Чтобы построить приблиз камеры, соберите две крышки стандартной ячейки 6-ну культуры пластин; 99,99% платиновой проволоки, 60 см в длину с диаметром 0,5 – 1 мм; серебро покрытием медной проволоки, 70 см в длину с диаметром 0.6 мм; Плиткорезы кусачки; комплект на Паяльники; одна трубка сверхпроводящие клея; один провод клеммы разъем, шесть небольших 2.2 V светодиоды (опционально); одна трубка нержавеющих силиконовый клей покрытие (опционально); один рулон Черный Электроизоляционные ленты; стандарт, гибкие, изолированные медные электрические провода (0,14 мм2), 2 м в длину (таблица материалов).
  2. В 6-ну пластина крышки, Марк и затем просверлить два отверстия (диаметром ~ 1 мм) 25 мм друг от друга, около внешнего края каждого из шести скважин (12 отверстий в целом), как показано на Рисунок 1A, B.
  3. Вырежьте 12 5 см длины провода платины Плиткорезы кусачки. Согнуть каждый из провода вручную в L-образной формы, оставив один конец длиной 3 см и других 2 см. вырезать серебро покрытием проволоки в две длины 35 см.
  4. Вставить больше (3 см) загнутым концом одного провода платины (от внутренности вне) в каждой просверленное отверстие, оставляя 1-2 мм, торчащий из внешней крышкой, согнуть его, используя пинцет. Безопасный платинового провода в крышку отверстия сверхпроводящие клеем и оставьте его для просушки на около 6 ч.
  5. Припой советы всех шести провода платины (которые позднее будут служить катодов, см. Рисунок 1A) выступающие от крышки к одному из серебра покрытием провода. Повторите эту же процедуру, пайка оставшиеся шесть платинового провода (которые позднее будут служить аноды) к другим покрытием серебра проволоки.
    1. Добавьте светодиоды в цепи между каждой из шести пар Платиновый электрод анод катод, для подтверждения функциональности во время экспериментов (необязательно). Поместите кусок черной изоляционной лентой под каждым привело к предотвратить предоставление клетки в культуре пластины для светодиодные (рис. 1 c).
  6. Приклейте разъем провода терминальный блок в верхний левый угол 6-ну пластина крышки и подключите оба серебро покрытием провода на входные клеммы, как показано на рисунке 1 c.
  7. Вырежьте из раздела 20 мм х 20 мм от верхнего левого угла второй 6-ну пластина крышки (рис. 1B, крышка Nr. 2) для размещения разъема терминальный блок на крышке первого. Обложка первого крышкой, оборудованный с электродами, второй крышкой и приклейте их вместе с клейкой лентой.
    1. Для улучшения сцепления двух крышек, используйте силиконовый клей, покрытие (по желанию). Чтобы сделать это, охватывают крышку с серебряными электродами с 3 – 5 мм слоем силиконового клея и накрыть крышкой, позволяя 12 h для клей для просушки.
  8. Подключите один конец два стандартных изолированные медные провода к клеммам выходной разъем провода и другие концы для мужчин разъемы банан (4 мм).
    Примечание: Длина провода зависит от расстояния от шельфа в инкубаторе, где будет храниться клетки, блока питания, за пределами инкубатора (рис. 1 d).
  9. Отрегулируйте дозировку (напряжения) и режим приблиз доставлены клетки путем регулирования питания постоянного тока.
    1. Включите блок питания, нажав на кнопку Включения/выключения на передней панели. Активируйте канал 1, нажав кнопку 1.
    2. Нажмите кнопку Nr. 4 (V-набор) для установки напряжения. Пресс кнопки 2, . и 5 , чтобы задать выходной нагрузки на 2.5 V. Нажмите клавишу Enter.
    3. Убедитесь, что выход нагрузки 2.5 V (2500 МВ) соответствует приблиз 100 МВ/мм, согласно следующим, упрощенный уравнение.
      V Приблиз = figure-protocol-1 ; или
      V = Vприблиз × d
      Здесь, V = напряжение питания выход в милливольтах; d = расстояние между электродами в миллиметрах; V Приблиз = стимуляции напряжения в милливольтах на миллиметр.
      Примечание: Это упрощение применяется только в случае постоянного напряжения постоянного тока. Сопротивление между средой и клетки незначительна, как электроды находятся не в прямой контакт с клетками; Вместо этого клетки через посредство доставляется приблиз.

2. мезенхимальных стволовых клеток культуры в остеогенном среднего

  1. Покупка и хранения MSCs коммерчески доступных крыса (смотрите Таблицу материалы) в жидком азоте до дня проведения эксперимента. Кроме того изолировать MSCs от других животных согласно протоколов опубликованы в другом месте8 7,в соответствии с местной институциональные правила для использования экспериментальных животных.
  2. В день эксперимента удалить один флакон (1 х 106 клеток) MSCs из хранения жидкого азота и быстро (в течение 1 мин) размораживать клетки на водяной бане, разогретую до 37 ° C.
    1. В стерильных условиях в Ламинарный шкаф Пипетка содержимое флакона в 50 мл трубки сокола и добавить 9 мл обычной среды (Нм) разогретую до 37 ° C, состоящий из среднего Дульбекко изменение орла (DMEM; 1 x) с 10% тепло инактивированная плода бычьим сывороточным (ФБС) и 1% раствора пенициллина/стрептомицина. Пелле клетки для 5 мин центрифугированием при 300 x g.
    2. Ламинарный шкаф удалить супернатант и тщательно Ресуспензируйте Пелле клеток в 12 мл Нм подогретую до 37 ° C. Ресуспензированы клетки перехода к колбе культуры клеток T-75.
  3. Культура клетки при 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 до тех пор, пока они достигают слияния 80 – 90% (после приблизительно 3-5 дней).
  4. Проход клетки.
    Примечание: Все операции за исключением центрифугирования и инкубации в стерильных условиях в Ламинарный шкаф.
    1. После достижения 80 – 90% слияния, получить клетки клетки отряд раствором. Аспирационная среднего культуры клеток, мыть 2 x 1 x фосфат амортизированное saline (PBS), добавить 5 мл 1 x мобильный отряд решение и вернуть клетки для инкубатора для 5 мин.
    2. После того, как отдельные клетки, добавьте равное количество питательной среды для инактивации отряд решение. Собрать клетки в 50 мл трубки сокола и спина их на 300 x g за 5 мин.
    3. Отказаться от среднего и Ресуспензируйте клеток в 1 мл свежей нормальной среды. Оцените количество жизнеспособных клеток с Трипановый синий пятно.
    4. Семена, 1 x 106 клеток в новой T-75 колбу с 12 мл подогретую Нм. Культура клетки при 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 до тех пор, пока они достигают слияния 80 – 90%.
      Примечание: Клетки пассированый (шаги 2.4.1–2.4.4) может повторяться несколько раз до тех пор, пока получено необходимое количество клеток. Не используйте старше проход 8 клеток.
  5. 4 клетки семян 9 x 10 в 3 мл Нм (10% тепло инактивированная плода бычьим сывороточным, пенициллин 1% / стрептомицина, DMEM) в каждой скважине пластины 6-ну культуры. Инкубируйте 1 день при 37 ° C, 5% CO2, 5% O2клетки.
  6. На следующий день, аспирационная питательной среды и применить 3 мл Остеогенные дифференциации среднего (ом; нормальный средний с 10-7 M дексаметазон, 10 мм β-метронидазол и 0,05 мм аскорбиновой кислоты-2-фосфат).
  7. Место пластину 6-колодец с ячейками в инкубаторе и инкубировать и при 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 на ночь.

3. Лечение MSCs с приблиз

  1. На следующий день клетки лечат приблиз стерилизуйте электродов в 70% этанола раствор для 30 мин; затем высушите их под ультрафиолетовым светом в безопасности кабинета для дополнительных 30 мин.
  2. В Ламинарный шкаф, крышка 6-ну содержащие культивировали MSCs с крышкой, с электродами, убедившись, что электроды полностью погружены в среде (если необходимо, добавьте среднего). Передать инкубатора покрыты пластины 6-ну (приблиз камеры) с клетками и подключите его провода к источнику питания.
  3. Установите блок питания 2,5 В выходной нагрузки и лечить клетки с приблиз для 1 h3,9.
  4. После стимуляции отключите блок питания и снимите камеру приблиз из инкубатора. В стерильных условиях обменять крышку с электродами с крышкой стандартной 6-ну пластины.
  5. Возвращение клетки в инкубаторе и оставить их на ночь. Очистите электроды, сначала с PBS и затем с 70% этанола раствор. Чистота продуктов накопленной коррозии от поверхности электрода с тонкой наждачной бумагой.
  6. Повторите шаги 3.1-3.5 для 6 дней подряд. День 4, перед применением приблиз и в стерильных условиях измените питательной среды, аспирационных 1,5 мл среды и заменив его с 1,5 мл подогретую свежие РЭ.
  7. После применения приблиз 7 дней подряд, сохранить клетки в культуре еще 7 дней, обмена носитель каждые 3 – 4 дня.

4. Остеогенные дифференциация измерения

  1. Анализ изменения морфологии клеток под микроскопом.
  2. Чтобы оценить влияние приблиз на Остеогенные дифференциация MSC, отложение кальция в меру, активность щелочной фосфатазы и остеогенном маркер экспрессии генов, как описано в других разделах3,9.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы оценить эффект 100 МВ/мм приблиз на Остеогенные дифференциация MSCs, клетках, обработанных с приблиз на 3, 7 и 14 дней или nontreated (управления) были проанализированы на 14 день культивирования путем оценки морфологических изменений и отложение кальция (Рисунок 2 ). Это было сделано путем визуализации ячейки, используя яркие поля микроскопии (морфология изменения) или фиксации клетки в параформальдегида 4% раствор, окрашивание их с 0,02% раствора ализ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем строительной палаты и метод для лечения мезенхимальных стволовых клеток с приблиз, что приводит к расширенной Остеогенные дифференциации.

Приблиз установки представлены не требует специального оборудования/знаний и могут выполняться в лаборатории стандартного стволовых клеток биологии/Биохимия младших исследователей. Однако когда построение и использование камеры приблиз, особое внимание следует несколько важных шагов. При обработке платиновыми электродами, осторожность долж...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа частично поддержали АО Фонд пособия (S-14-03 H) и Фонд Friedrichsheim (Stiftung Friedrichsheim), базирующийся в Франкфурт-на-Майне, Германия.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Estim fabrication
Banana connector/Jack адаптерPoppstars10085542 шт.
Плоскогубцы для резкиKnipex78 03 125
DC Power Power (0-30 В/0-3 А)B& K PrecisionModel 9130BМожно использовать любую симулярную модель
Изолированные гибкие провода (0,14 мм2)Conrad Electronic International604794, 6040932 штуки
Нержавеющий силиконовый каучукDow Corning3140 RTV*можно приобрести во многих магазинах
Платиновый провод (999,5/1000; 1мм ø)Junker Edelmetalle00D-30100,6 м требуется для 1 камеры Estim
70% раствор этанолалюбойСтерилизация камеры Estim
Медная проволока с серебряным покрытием (0,6 мм ø)Конрад Электроник Интернэшнл409334 - 62≈ 70 см необходимо для 1 прибора Estim
Паяльник НаборConrad Electronic International1611410 - 62Любая симулярная модель может быть использована
TPP 6-луночная пластина крышкаSigma-AldrichZ707759-126EA2 крышки для камеры Estim
2,2 В проводные круглые светодиодыConrad Electronic International599525 - 626 штук
UHU Super glueUHU GmbH & Co. KGн/д*можно приобрести во многих магазинах
MSC culture
β-Глицерофосфат динатриевая соль гидратSigma-AldrichG9422остеогенная клеточная культура
DMEM, низкий уровень глюкозы, добавка GlutaMAX, пируватThermo-Fischer Scientific21885025клеточная культура
DPBS, без кальция, без магнияThermo-Fischer Научная14190144клеточная культура
ДексаметазонSigma-AldrichD4902остеогенная клеточная культура
Фетальная бычья сывороткаThermo-Fischer Научная10500064клеточная культура
50 мл Falcon TubeSarstedt62,547,004клеточная культура
L-аскорбиновая кислотаSigma-AldrichA4544остеогенная клеточная культура
Пенициллин/стрептомицинThermo-Fischer Научная15140122клеточная культура
Sprague-Dawley (SD) крысиные мезенхимальные стволовые клетки, костный мозг происхождениеCyagenRASMX-01001клеточная культура
Thermo-Fischer ScientificA1110501клеточная культура, клеточная отслойка
TC Flask, T75Sarstedt833911302клеточная культура
ТПП 6-луночные планшетыSigma-AldrichZ707759-126EAклеточная культура
Trypan Blue Dye, 0,4% растворBio-Rad1450021количество клеток

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Oryan, A., Kamali, A., Moshiri, A., Baghaban Eslaminejad, M. Role of Mesenchymal Stem Cells in Bone Regenerative Medicine: What Is the Evidence? Cells, Tissues, Organs. 204 (2), 59-83 (2017).
  2. Mauney, J. R., Volloch, V., Kaplan, D. L. Role of Adult Mesenchymal Stem Cells in Bone Tissue Engineering Applications: Current Status and Future Prospects. Tissue Engineering. 11 (5-6), 787-802 (2005).
  3. Mobini, S., Leppik, L., Thottakkattumana Parameswaran, V., Barker, J. H. In vitro effect of direct current electrical stimulation on rat mesenchymal stem cells. PeerJ. 5, e2821(2017).
  4. Leppik, L., et al. Combining electrical stimulation and tissue engineering to treat large bone defects in a rat model. Scientific Reports. 8 (1), S1(2018).
  5. Song, B., et al. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nature Protocols. 2 (6), 1479-1489 (2007).
  6. Hronik-Tupaj, M., Kaplan, D. L. A review of the responses of two- and three-dimensional engineered tissues to electric fields. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 18 (3), 167-180 (2012).
  7. Huang, S., et al. An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. Journal of Orthopaedic Translation. 3 (1), 26-33 (2015).
  8. Nau, C., et al. Tissue engineered vascularized periosteal flap enriched with MSC/EPCs for the treatment of large bone defects in rats. International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 907-917 (2017).
  9. Eischen-Loges, M., Oliveira, K. M. C., Bhavsar, M. B., Barker, J. H., Leppik, L. Pretreating mesenchymal stem cells with electrical stimulation causes sustained long-lasting pro-osteogenic effects. PeerJ. 6, 4959(2018).
  10. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), San Diego, CA. 402-408 (2001).
  11. Curtis, K. M., et al. EF1alpha and RPL13a represent normalization genes suitable for RT-qPCR analysis of bone marrow derived mesenchymal stem cells. BMC Molecular Biology. 11, 61(2010).
  12. Wang, L., Li, Z. -y, Wang, Y. -p, Wu, Z. -h, Yu, B. Dynamic Expression Profiles of Marker Genes in Osteogenic Differentiation of Human Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells. Chinese Medical Sciences Journal (Chung-kuo i hsueh k'o hsueh tsa chih). 30 (2), 108-113 (2015).
  13. Kim, H. B., Ahn, S., Jang, H. J., Sim, S. B., Kim, K. W. Evaluation of corrosion behaviors and surface profiles of platinum-coated electrodes by electrochemistry and complementary microscopy: biomedical implications for anticancer therapy. Micron. 38 (7), Oxford, UK. 747-753 (2007).
  14. Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer. Molecular Biology of the Cell. , mbcE18010077(2018).
  15. Tai, G., Tai, M., Zhao, M. Electrically stimulated cell migration and its contribution to wound healing. Burns & Trauma. 6, 20(2018).
  16. Love, M. R., Palee, S., Chattipakorn, S. C., Chattipakorn, N. Effects of electrical stimulation on cell proliferation and apoptosis. Journal of Cellular Physiology. 233 (3), 1860-1876 (2018).
  17. Adams, D. S., Levin, M. General principles for measuring resting membrane potential and ion concentration using fluorescent bioelectricity reporters. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 385-397 (2012).
  18. Jin, G., Li, K. The electrically conductive scaffold as the skeleton of stem cell niche in regenerative medicine. Materials Science & Engineering. C, Materials for Biological Applications. 45, 671-681 (2014).
  19. Hronik-Tupaj, M., Rice, W. L., Cronin-Golomb, M., Kaplan, D. L., Georgakoudi, I. Osteoblastic differentiation and stress response of human mesenchymal stem cells exposed to alternating current electric fields. Biomedical Engineering Online. 10, 9(2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

RunX2Osterix

Похожие статьи