Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Извлечение внеклеточного Vesicles из цельной ткани

15.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59143

⸱

7 февраля 2019 г.

 ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Florida State University College of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы предоставляем подробный протокол для изоляции малых внеклеточного везикулы (EVs) от всего тканей, в том числе мозга и опухоли образцов. Этот метод предлагает воспроизводимый метод для извлечения EVs из прочной ткани для дополнительного анализа, ниже по течению.

Аннотация

Циркулирующего и интерстициальный малых мембраны прыгните внеклеточного пузырьков (EVs) представляют собой перспективные "мишени" для разработки новых диагностических и прогностических биомаркер анализов и скорее всего служат важными игроками в прогрессировании широкий спектр заболевания. Текущие исследования уделяется характеристике везикулы, выделяется из нескольких клеток и типы тканей для того, чтобы лучше понять роль EVs в патогенезе условий, включая нейродегенеративные, воспаление и рак. Однако глобально последовательную и воспроизводимые методы, чтобы изолировать и очистить везикулы остаются в прогресс. Кроме того едва описаны методы извлечения EVs из прочной ткани ex vivo . Здесь мы предоставляем подробный протокол для извлечения мелких EVs интереса от совершенно свежие или замороженные тканей, в том числе мозга и опухоли образцов, для дальнейшей характеризации. Мы продемонстрировать технологичность этого метода для несколько ниже по течению анализов, включая электронной микроскопии и иммунофенотипических характеристика везикулы, а также количественного масс-спектрометрии белков EV.

Введение

Малые внеклеточного везикулы (EVs) включают в себя от англ производные exosomes и малых мембраны сарай микровезикулы, которые представляют широкий интерес биомедицинских. Небольшие EVs состоят из гетерогенных населения 50-250 Нм мембраны прыгните везикулы, содержащие биологически активные белки, липиды и нуклеиновых кислот, которые коллективно считается играть важную роль в множество процессов болезни. Продвижение исследований особенно причастны эти пузырьки в нейродегенеративных и прионы расстройств, инфекционные процессы, аутоиммунных или воспалительные условий и роста опухоли и метастазов1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. быстро растущих биомедицинских исследований в значении EVs в патогенезе заболевания параллельных интерес в развитии воспроизводимость и строгие методы для очистки этих пузырьков и изоляции.

Исторической и текущей задачей в EV характеристика была неспособность полностью отделить малых субпопуляций EV. Эта задача во многом из-за нашего ограниченного понимания различных молекулярных механизмов, регулирующих биогенеза отдельных пузырьков. Перекрывающиеся размер, плотность и биологические грузов между субпопуляциями далее convolutes эти различия. Частью этой задачи был также использование широко различные методы обогащения, предоставляя непоследовательность в течению анализе изолированных везикулы лаборатории и подрывает глобальные усилия для освещения категориальной EV населения.

Стоит отметить, что большинство EV характеристика была выполнена в пробирке коллекции клеточной культуры супернатанта, с более недавние исследования в естественных условиях, описывающих методы, чтобы изолировать везикулы из животных или человека жидкости организма, включая плазмы, мочи и слюна. В то время как EVs присутствуют в больших количествах в обращении, она также признала, что эти пузырьки играют важную роль в событиях в ячейке коммуникации и присутствуют в интерстиции клеточных тканей. В контексте рака интерстициальный EVs могут быть особенно важную роль в модуляции микроокружения опухоли раковых клеток посева и метастатический рост14,15. Следовательно есть значение в разработке и оптимизации методов для извлечения пузырьки из прочной ткани образцов. Эти методы будут предоставлять средства непосредственно изучать орган - или опухоль - производные EVs, добываемых из клинических образцов, включая небольшие биопсии и орган полной или частичной резекции.

В этом исследовании и в предыдущем докладе, опубликованном в нашей лаборатории16, мы стремимся решить несколько основных текущих проблем в EV обогащения методологии: 1) для описания воспроизводимый технику, чтобы изолировать и очищают EVs по самым высоким стандартам в настоящее время принятые в этой области; 2) для попытки изолировать малых субпопуляций EV, высоко обогащенный от англ производные exosomes; и 3) представить протокол для извлечения этих везикулы от твердых тканей образцов с целью дальнейшего характеристика.

Недавно Ковал и коллегами описал градиент плотности относительно небольших iodixanol для разделения и очистки EV субпопуляции более эффективно, чем сопоставимые сахарозы плотности градиенты17. В исследовании, цитируется в дендритных клеток, полученных EVs, захвачен в сравнительно малая плотность фракции, в соответствии с плотностью 1,1 г/мл, были высокообогащенного в белки от англ, считается наиболее последовательно с высокой долей exosomes в этом фракция. По мнению авторов эти «bona fide» exosomal белки включены опухоли восприимчивость ген 101 (TSG101), syntenin-1, CD81, ADAM10, EHD4 и несколько annexin белков17. Позже мы адаптировали эту технику для достижения успеха метода ткани диссоциации описал Перес Гонсалес et al18 и последующих дифференциального центрифугирования протокол изолировать весь мозг производные EVs16. Мы также продемонстрировали полезность этого метода в характеристике EV протеомов, объединяя последовательный протокол по течению количественное и сравнительного масс-спектрометрии везикулярного белка, ранее описанных в нашей лаборатории19. Эта работа параллельно, что от холма лаборатории, в которой EVs обогатились от лобной коры мозга20.

В этом исследовании мы подробно останавливаться на эту технику и расширить сферу применения протокола, недавно опубликовала от нашей лаборатории для изоляции EVs от опухоли легких твердых. Насколько нам известно это первое исследование, чтобы описать протокол обогатить EVs от ex vivo опухоли образцов. С учетом широкого интереса к EVs как Роман диагностических биомаркеров и их роль в tumorigenesis, этот метод скорее всего окажется ценным для растущего числа научных исследователей. С клинической точки зрения интерстициальный EVs могут гавани диагностики большое значение, особенно в образцах, где ограничена гистологических оценки. Мы надеемся, что метод конспектированный здесь обеспечит основу для воспроизводимых технику урожай EVs из свежих или замороженных животных или человека хирургической образцов, в почву для будущей работы раскрыть существенную роль в патогенезе заболеваний этих малых пузырьки могут играть.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Весь мозг были получены с согласия от правомерного использования животных и уход Комитет (IACUC) государственного университета Флориды. В общей сложности двенадцать мозг мыши (3 мозги из каждой возрастной группы: 2, 4, 6 и 8 месяцев) от C57BL/6 J фона использовались для извлечения EV, как описано выше16. Образцы опухоли легких были щедро подарены д-р Mandip Сачдева под номером официального утверждения Флорида сельскохозяйственных и механических IACUC университета. Опухоли легких были получены от линии клеток человеческого аденокарциномы H1975, выращенных в иммунодефицитных Balb/c ню/ню обнаженная мышей. Данные из двух представительных опухоли реплицирует, выделены в настоящем исследовании.

Примечание: Схематический обзор метода очистки и изоляции везикул приводится на рисунке 1.

1. ткань диссоциации и дифференциального центрифугирования

  1. Подготовка 10 мл буфера диссоциации (10 мг папаин; 5,5 мм L-цистеин; 67 мкм 2-меркаптоэтанол 1.1 мм ЭДТА) в среде Hibernate-E за примерно 0,4-1,0 г ткани. Обратите внимание, что все решения, используемые для очистки и обогащения EV следует разбавить в сверхчистого фильтрованной воды.
  2. Добавить все свежие или замороженные ткани диссоциации буфер в 50 мл Конические трубки и инкубировать в теплой воде Ванна при 37 ° C 20 мин ткани могут быть сокращены на более мелкие фрагменты до инкубации при необходимости.
  3. После инкубации добавьте ингибиторы протеазы и фосфатазы для окончательного 1 x концентрации диссоциации буфер, содержащий ткань.
  4. Залейте раствор, содержащий ткань в гомогенизатор Dounce свободную подходит и аккуратно отделить ткани, используя около 30 медленно штрихи на сэмпл. Количество ударов может быть скорректирована основе согласованности ткани.
  5. Передача в отрыве ткани в буфере в 50 мл Конические трубки и центрифуги на 500 x g 5 мин при 4 ° C для пеллет клетки и сплоченной или фиброзной ткани остатки.
  6. Передать супернатант чистой 50 мл Конические трубки и центрифуги на 2000 x g 10 мин при 4 ° C окатышей и отказаться от большой сотовой мусора.
  7. Передать супернатант снова чистой 50 мл Конические трубки и центрифуги на 10000 x g 40 мин при 4 ° C для пеллет нежелательных большие пузырьки или небольших apoptotic тела.
    Примечание: Это гранулы могут быть сохранены для дополнительного изучения крупных пузырьков при желании.
  8. Декант супернатант через фильтр 0,45 мкм в чистой 12 мл ultracentrifugation.
    Примечание: Образцы плотно фиброзных тканей могут быть отфильтрованы не легко. Эти образцы можно фильтруют через стрейнер клеток 40 мкм, а затем прошли через поочередно небольшие иглы (18 G, 20 G, 22 G) до фильтрации через 0.45 мкм фильтром.
  9. Ультрацентрифуги образца на 100,000 x g за 2 ч при 4 ° C до Пелле малых EVs.
  10. Декант супернатант и оставить ultracentrifugation трубы, Перевернутый для 5-10 мин, часто разговоров для удаления остатков жидкости по бокам трубы. Остаточная жидкость может также быть придыхательным с использованием аспирационных вакуумной пипетки.
  11. Вновь приостановите EV Пелле в 1,5 мл 0,25 М сахарозы буфера (10 мм трис, рН 7,4). Важно обеспечить полное ресуспендирования гранул в этом шаге. Чтобы сделать это, покрывают трубки с парафина до vortexing EVs в раствор. Рок ультрацентрифуга трубы для 15-20 минут при комнатной температуре до окончательного вихревой микс.
  12. Кратко центрифуга трубы на скорости не более чем 1000 x g восстановить жидкой суспензии в нижней части трубки.
  13. Перейти к градиента очистки шагов ниже, или при необходимости хранить EV подвеска на 4 ° C на ночь.

2. плотность градиента очистки

  1. Добавьте 1,5 мл 60% iodixanol (Стоковый раствор в воде) 1,5 мл сахарозы/трис буфер, содержащий EVs для создания окончательного решения, содержащий 30% iodixanol. Пипетка вверх и вниз несколько раз, чтобы тщательно перемешать раствор. Будьте осторожны, чтобы избежать потери раствора в наконечник пипетки, как концентрация высокой iodixanol довольно вязкой.
  2. Передача iodixanol 30% буферный раствор, содержащий EVs в нижней части трубки ultracentrifugation 5,5 мл.
  3. Подготовьте по крайней мере в 1,5 мл 20% и 10% iodixanol решений на сэмпл в ультрачистая вода из 60% iodixanol раствор.
  4. Мера 1.3 мл 20% iodixanol и тщательно слой поверх нижней градиентного слоя с помощью шприца и иглы 18 G. Чтобы избежать смешивания слоев на плотность интерфейс, держите скос иглы при контакте с внутренней трубки ultracentrifugation чуть выше мениска и добавить решение каплям.
  5. Слой 1,2 мл раствора 10% iodixanol поверх слоя 20% iodixanol, используя ту же технику, как указано выше.
  6. Тщательно сбалансировать и загрузить ultracentrifugation трубы в ротор ведра и центрифуги в свинг ведро ротора на 268.000 x g 50 мин при 4 ° C. Установите ускорение и замедление скорости центрифуги минимальные ставки, возможность избежать нарушения плотности слоёв.
  7. Метка 10 1,5 мл microcentrifuge трубы для каждого образца соответствовать фракций 1 до 10 градиент плотности. Фракция 1 обозначается как верхний фракция, которая будет сначала удалена, в то время как фракция 10 является нижней часть последнего удален.
  8. После завершения градиента ultracentrifugation, аккуратно удалить трубы из ведра ротора и место в стабильной держателя. Видимый диапазон везикулы часто можно увидеть в долю интереса. Пипетка десяти последовательных фракций 490 мкл от верхней части градиента в соответствующие трубы. Там будет небольшое количество жидкости, оставаясь в нижней части трубки, который вероятно содержит загрязняясь протеины. Этот пример можно отказаться, или при желании сохранить как часть 11.
  9. Измерьте преломления фракций с использованием рефрактометра. Это может также выполняться с градиентом управления параллельно при необходимости сохранения образцов. Пипетка 20-30 мкл каждой фракции, содержащие iodixanol на поверхность рефрактометр и оценить плотность, сравнивая преломления плотности известных iodixanol. Обратите внимание, что фракции могут храниться на ночь в iodixanol содержащих решение при необходимости перед переходом к следующему шагу мыть ultracentrifugation.
  10. Передавать каждую долю чистой 12 мл ultracentrifugation. Добавьте 5 мл 1 x фосфат амортизированное saline (PBS; 137 мм NaCl, 2,7 мм KCl, 10 мм Na2HPO4, 2 мм х2PO4, рН 7,4) трубки и микс, закупорить медленно вверх и вниз.
    Примечание: PBS, добавлены образцы должны быть свободной частицы, обеспечивается фильтрации через 0,22 мкм фильтром стерильные PBS и хранения при комнатной температуре, избегать соли осадков.
  11. Добавьте дополнительные 6 мл ПБС в верхней и еще раз тщательно перемешать.
  12. Ультрацентрифуги трубы на 100,000 x g за 2 ч при 4 ° C до повторного Пелле небольшие пузырьки. Декант супернатант и коснитесь трубы сухой перед lysis пузырьки для анализа белка (шаг 3) или ре подвеска EVs для морфологической анализа (шаг 5).

3. распад и подтверждение Immunoblot EV белков

Примечание: Если сохранение всего везикулы морфологическая характеристика или биологической активности, исследователи могут перейти непосредственно к шагу 5. В первоначальных экспериментов, или перед анализом масс-спектрометрии восстановлены все фракции должны быть проанализированы, immunoblot для подтверждения фракций с EV белков.

  1. Чтобы лизировать EVs для анализа белка, добавьте 40 мкл буфера lysis сильных (5% SDS, 10 мм ЭДТА, 120 мм трис-HCl рН 6,8, 2,5% 2-меркаптоэтанол, мочевина 8 М) с добавлением ингибитора протеазы EV Пелле в ультрацентрифуга трубки.
    Примечание: По желанию-уменьшение условия для обнаружения антител белков замените ультрачистая вода для 2-меркаптоэтанол сильный литического буфера.
  2. Обеспечение полной ресуспендирования гранул и lysis EVs в буфере, поместив парафина ultracentrifugation трубки, vortexing энергично, затем качалки для 20 мин при комнатной температуре до окончательного вихря.
  3. Кратко центрифуги на 1000 x g за 30-60 s, чтобы восстановить объем всей выборки. Передать образец новой пробки microcentrifuge 1,5 мл и хранить при 20 ° C до-80 ° C до дальнейшей обработки.
  4. Для подготовки очищенного лизатов immunoblot анализа, добавьте буфер образца 5 x Laemmli (10% SDS, 250 мм трис рН 6,8, 1 мг/мл бромфеноловый синий, 0,5 М DTT, 50% глицерина, 5% 2-меркаптоэтанол) образцы для конечной концентрации 1 x.
    Примечание: По желанию-сокращение условий DTT и замените 2-меркаптоэтанол ультрачистая вода.
  5. Если огневки цельной ткани, элементы управления желательны, лизируют ткани в мочевины содержащих сильные буфера lysis подробно выше с ингибитором протеазы, затем центрифуги на 10000 x g за 10 мин отменить оставшиеся внеклеточного матрикса, всей клетки, или нетронутыми сотовой мусора. Добавьте 5 x Laemmli буфер образца ткани огневки для конечной концентрации 1 x.
  6. Отварить образца буфер, содержащий образцы огневки EV или ткани на 95 ° C за 5-10 мин, а затем загрузить равный объем (от эквивалент 0,1-0,3 г исходный материал ткани; 1-2 мкг очищенный протеин EV) фракций 1-10 в гель SDS-PAGE 10%. Загрузить равные массы ткани огневки. Больший объем пробы могут быть необходимы для обнаружения менее чувствительных антител.
  7. Как ранее подробные21 для подтверждения EV белков в очищенной лизатов и сравнить относительное изобилие EV в долях приступайте электрофорез геля и Западный анализ помаркой.
    Примечание: Как только EV белка была продемонстрирована можно воспроизвести в соответствии фракций, окончательный ultracentrifugation мыть, описанные в шаге 2.12 может быть ограничена градиента фракций интерес.

4. EV белка количественная оценка

  1. Используйте моющее средство - и мочевина совместимые пробирного на основе флуоресценции чувствительных количественная оценка EV белков по желанию для дальнейшего анализа (см. Таблицу материалы). Обратите внимание, что некоторые анализы на основе флуоресценции совместимы с бромфеноловый синий, присутствующих в буфер Лэмли образца, содействия прямой lysis EV Пелле (в шаг 2.12) в этом буфере, если предпочтительный.
  2. Если используется комплект количественной оценки вышеупомянутых на основе флуоресценции белков, пятно 1 мкл пример или стандарта в по крайней мере дублировать на предоставленный фильтровальная бумага и продолжить белка количественной оценки согласно инструкциям производителя.

5. характеристика EV морфология

  1. Для изучения всего везикулы, после окончательного центрифугирования мыть в 2.12 шаг, тщательно вновь приостановите EV Пелле в свободной частицы ПБС. EVs хранить при 4 ° C не более чем за одну неделю до обработки избежать циклов замораживания оттаивания.
    Примечание: Это полезно для ранее подтвердили дроби последовательно содержащие обогащенный белком EV immunoblot анализ ограничить морфологический анализ фракций интерес.
  2. Выполнение отслеживания анализа всего EV образцов для определения концентрации и размер пузырьков в подготовке, как ранее подробные22наночастиц.
  3. Характеризуют EV морфологии и подтвердить размер измерения электронной микроскопии везикулы, при желании. ЕТ сетки могут быть получены из везикул суспензий после шаг 5.123, или в качестве альтернативы могут быть обработаны как блок подготовки24 из окатышей, следуя шаг 2.12.

6. в гель пищеварения трипсина и очистка для анализа масс-спектрометрии

  1. Если характеристика EV протеомов по масс-спектрометрии, загрузите равные массы (по крайней мере 10 мкг белка) фракций, содержащих EVs в сборных полиакриламидный гель для разделения и очистки белков. Поставляется производитель сборных гели предпочтительны для снижения уровня потенциальных загрязняющих белков (например, кератин) внедряется в образцы.
  2. Запуск образца по крайней мере 0,5 дюйма в полиакриламидный гель для очистки белков, затем исправить и пачкает краской Кумасси, как описано в деталях25.
  3. Нарежьте полосы 1 мм3 кубов для переваривания трипсином, как ранее подробные19,26.
  4. Загрузка 5 мкл переваривается пептид образца в LC-MS/MS инструмент для разделения на аналитической колонки и последующего анализа по масс-спектрометрии в зависимости от параметров, указанных в деталях16.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Схематический обзор ткани диссоциации, дифференциального центрифугирования и градиента очистки везикулы отображается на рисунке 1. Морфологическая и иммунофенотипических подтверждения градиент очищенная EVs выделяется на рисунке 2. Диаграмма воспроизводимые после ultracentrifugation 10-30% iodixanol градиента плотности показано, с двух популяций отдельных пузырьков, переход вверх к фракции 2 (свет EVs) и фракция 5 (плотной EVs), ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Гораздо научный интерес был создан относительно роли, которую малые EVs играть микроокружения опухоли, а также в орган развития, созревания и функции. В целом это исследование обеспечивает оптимизированный рабочий процесс для извлечения нетронутыми EVs от весь мозг или образцы опухоли. Хотя здесь мы просто продемонстрировать применимость этой техники к производным опухоли легких EVs, этот метод может быть легко адаптирована для работы на других твердых тканей, обеспечивая возможности для дальнейших ex vivo характеристики...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Авторы благодарят д-р Ричард Новаковский и Флорида государственного университета лабораторных животных ресурсов для предоставления и заботы о животных, используемых для разработки этого протокола, с уважением. Мы благодарим Лю ся, доктор Ракеш Сингх и Флорида государственного университета трансляционная научная лаборатория для помощи с работой масс-спектрометрии для вниз по течению везикул характеристик, а также БСС биологических наук Imaging ресурсов Фонда для Использование просвечивающий электронный микроскоп в этом исследовании. Наконец мы благодарим д-р Mandip Сачдева (Флорида A & M университет) за пожертвование в размере опухоли образцов, используемых в разработке этого метода. Это исследование было поддержано грантов от Флорида Департамента здравоохранения Эд и Этель Мур Альцгеймера болезнь исследовательской программы награждены D.G.M. и J.M.O (6AZ11) и национального института рака национальных институтов здоровья под номером премии Вручена D.G.M. R01CA204621

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,45 & микро; m фильтрVWR28145-505
12 мл ультрацентрифужные пробиркиBeckman Coulter331372
5,5 мл ультрацентрифужные пробиркиBeckman Coulter344057
антитела против AlixSanta Cruzsc-7129
антитела против кальнексинаSanta Cruzsc-11397
антитела против CD63 Abcamab59479
антитело против CD81Santa Cruzsc-9158
антитело против флотилина 2 антителоSanta Cruzsc-25507
антитело против HSC70Santa Cruzsc-7298
антитело против синтенина-1 антителоSanta Cruzsc-100336
антитело против TSG101 антителоSanta Cruzsc-7964
EZQ набор для количественного определения белкаThermoFisher ScientificR33200
FA-45-6-30 ротор Eppendorf5820715006
FEI CM120 Электронный микроскопTSS Микроскопия
козы против кролика IgG (Fab фрагмент)Genetex27171
HALT ингибитор фосфатазы (100x раствор)ThermoFisher Scientific78420
HALT ингибитор протеазы (100x раствор)ThermoFisher Scientific78438
Hibernate E mediumThermoFisher ScientificA1247601
MLS-50 ротор с качающимся ковшомBeckman Coulter367280
NanoSight LM10Malvern
Optima MAX-XP Настольная ультрацентрифуга Beckman Coulter393315
ультрацентрифуга Optima XE-100Beckman CoulterA94516
OptiprepSigmaD155660% йодиксанол в стерильном водном растворе
Q Exactive HF Масс-спектрометрThermoFisher Scientific
кролик против коз IgGGenetex26741
кролик против мышей IgGРефрактометр Genetex26728
30PX (рефрактометр)Ротор Mettler Toledo51324650
S-4-104Eppendorf5820759003
SW 41 Ti Ротор с качающимся ковшомBeckman Coulter333790
Настольная центрифуга 5804REppendorf22623508
антитело

Ссылки

  1. Bobrie, A., Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Exosome secretion: molecular mechanisms and roles in immune responses. Traffic. 12 (12), 1659-1668 (2011).
  2. Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
  3. Howitt, J., Hill, A. F. Exosomes in the Pathology of Neurodegenerative Diseases. Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26589-26597 (2016).
  4. Sardar Sinha, M., et al. Alzheimer's disease pathology propagation by exosomes containing toxic amyloid-beta oligomers. Acta Neuropathologica. 136 (1), 41-56 (2018).
  5. Meckes, D. G., Raab-Traub, N. Microvesicles and viral infection. Journal of Virology. 85 (24), 12844-12854 (2011).
  6. Meckes, D. G. Exosomal communication goes viral. Journal of Virology. 89 (10), 5200-5203 (2015).
  7. Schorey, J. S., Cheng, Y., Singh, P. P., Smith, V. L. Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions. EMBO Reports. 16 (1), 24-43 (2015).
  8. Zhang, X., et al. Exosomes in cancer: small particle, big player. Journal of Hematology Oncology. 8, 83(2015).
  9. Janas, A. M., Sapoń, K., Janas, T., Stowell, M. H. Exosomes and other extracellular vesicles in neural cells and neurodegenerative diseases. Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1139-1151 (2016).
  10. Chahar, H. S., Bao, X., Casola, A. Exosomes and Their Role in the Life Cycle and Pathogenesis of RNA Viruses. Viruses. 7 (6), 3204-3225 (2015).
  11. Pegtel, D. M., Peferoen, L., Amor, S. Extracellular vesicles as modulators of cell-to-cell communication in the healthy and diseased brain. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1652), (2014).
  12. Raposo, G., et al. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).
  13. Katsiougiannis, S. Extracellular Vesicles: Evolving Contributors in Autoimmunity. Forum on immunopathological diseases and therapeutics. 6 (3-4), 163-170 (2015).
  14. Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
  15. Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
  16. Hurwitz, S. N., et al. An optimized method for enrichment of whole brain-derived extracellular vesicles reveals insight into neurodegenerative processes in a mouse model of Alzheimer's disease. Journal of Neuroscience Methods. 307, 210-220 (2018).
  17. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).
  18. Perez-Gonzalez, R., Gauthier, S. A., Kumar, A., Levy, E. The exosome secretory pathway transports amyloid precursor protein carboxyl-terminal fragments from the cell into the brain extracellular space. Journal of Biological Chemistry. 287 (51), 43108-43115 (2012).
  19. Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. An Adaptable Polyethylene Glycol-Based Workflow for Proteomic Analysis of Extracellular Vesicles. Methods in Molecular Biology. 1660, 303-317 (2017).
  20. Vella, L. J., et al. A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885(2017).
  21. Hurwitz, S. N., et al. CD63 Regulates Epstein-Barr Virus LMP1 Exosomal Packaging, Enhancement of Vesicle Production, and Noncanonical NF-.κB Signaling. Journal of Virology. 91 (5), (2017).
  22. Hurwitz, S. N., Conlon, M. M., Rider, M. A., Brownstein, N. C., Meckes, D. G. Nanoparticle analysis sheds budding insights into genetic drivers of extracellular vesicle biogenesis. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 31295(2016).
  23. Lässer, C., Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and characterization of RNA-containing exosomes. Journal of Visualized Experiments. (59), e3037(2012).
  24. Jung, M. K., Mun, J. Y. Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).
  25. Meckes, D. G. Affinity purification combined with mass spectrometry to identify herpes simplex virus protein-protein interactions. Methods in Molecular Biology. 1144, 209-222 (2014).
  26. Rider, M. A., Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. ExtraPEG: A Polyethylene Glycol-Based Method for Enrichment of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 6, 23978(2016).
  27. Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913(2014).
  28. Thakur, B. K., et al. Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection. Cell Research. 24 (6), 766-769 (2014).
  29. Balaj, L., et al. Tumour microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene sequences. Nature Communications. 2, 180(2011).
  30. Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nature Cell Biology. 10 (12), 1470-1476 (2008).
  31. Zhang, H., et al. Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation. Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).
  32. Zijlstra, A., Di Vizio, D. Size matters in nanoscale communication. Nature Cell Biology. 20 (3), 228-230 (2018).
  33. Meehan, B., Rak, J., Di Vizio, D. Oncosomes - large and small: what are they, where they came from. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 33109(2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Экстракция тканейизоляция внеклеточных везикулультрацентрифугированиеградиент плотностиградиент иодиксанолаочистка везикулэлектронная микроскопиявестерн-блоттинганализ методом отслеживания наночастиц
Извлечение внеклеточного Vesicles из цельной ткани
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.