Подготовка биологический образец высокого давления замораживания, при содействии Микроволновая печь контрастности и минимальным смолы, встраивание образов тома

Высокого давления замораживание является подготовка образца методом выбора для получения ультраструктурных сохранение высокого качества, который представляет состояние собственного образца гораздо лучше, чем обычные подготовка методы, с помощью химической фиксации¹. Этот метод крио подготовка полезен для образцов ткани Миелинизированные мыши² и строгое требование для использования модели организма Caenorhabditis elegans³. После замены замораживание и встраивание смолы эти образцы обычно анализируются просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА) или электронная томография (ET). Если большие объемы должны отражаться с помощью БМУ-SEM или последовательный блок лицо изображений для высокого разрешения крупномасштабных 3D реконструкций, наш опыт показывает, что правильное изображений по SEM часто затрудняется отсутствием контраста. В FIB-SEM изображение записывается обычно обнаружение рассеяния электронов от основного электронного луча. Урожайность рассеяния электронов пропорциональна содержание тяжелых металлов в образце. Таким образом протоколы были специально разработаны для тома изображений для повышения контраста дополнительных тяжелых металлов полимерами. Такие методы основаны на химически фиксированных выборок и применять сочетание осмия тетраоксид thiocarbohydrazide осмия тетраоксид⁴, как описано в Knott et al.⁵, для последовательного блока лица и сосредоточены ионного пучка сканирующая электронная микроскопия. Изменения, включая использование формамида и пирогаллол⁶ или свинца аспартат⁷ успешно применяется для различных методов обработки изображений.

Протокол, здесь сочетает крио подготовка образцов по ЖКХ и заморозить замещения с последующей обработки для повышения контраста, используя thiocarbohydrazide/осмия тетраоксид в ацетон при комнатной температуре, при содействии Микроволновая печь. Мы демонстрируем это на tibialis Миелинизированные nervus мышей и Caenorhabditis elegans, которые представляют образцы, которые требуют высокого давления, замораживание ультраструктурных сохранения высокого качества. Кроме того показано, как, после обезвоживания и инфильтрации, образцы внедряются с как мало смолы как можно скорее. Этот минимальный смолы, встраивание⁸ позволяет быстрее ориентации структуры интереса и уменьшает время, затраченное на обработку образца, включая меньше времени, необходимого для предоставления региона интерес с пучком ионов. После выполнения дальнейшие действия по подготовке образца внутри Микроскоп, imaging и фрезерные образца осуществляется непрерывно приобретать стек изображений. Для 3D визуализации обработки изображений программное обеспечение (IMOD) используется для восстановления части набора данных.

Наш рабочий процесс описывает, как наиболее подходящим контрастные образцов для тома изображений может сочетаться с лучших ультраструктурных сохранения по ЖКХ и моратория замещение. Это полезно для образцов, которые строго требуют крио подготовка. Приложения ограничены небольшие образцы, которые могут быть подготовлены HPF. В образцах различной природы, такие как растительного материала или микроорганизмов этот протокол требует адаптации.

Все эксперименты, включая образцы от животных, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и Нижней Саксонии государственного управления для защиты клиента и продовольственной безопасности (LAVES).

1. высокого давления блокирования и замораживания замещения

1. Вскрыть tibialis nervus мыши (например, C57Bl6N, 12 недель, самка)⁹.
2. Погрузите tibialis nervus в капли 20% поливинилпирролидона (1 g PVP в 5 мл) в-фосфатный буфер (PBS) и вырезать куски длиной 2 мм. Затем поместите его в металлические прободержатели (тип А, 0,2 мм глубина) с помощью тонкой щипцами. Добавьте еще один плоский перевозчика (тип B) покрыта тонким слоем гексадекан как крышкой и вставьте патрон образца этой Ассамблеи.
3. Передача нескольких C. elegans взвешенных в капельки 20% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в M9 (см. Таблицу материалы) с одноразовые пластиковые пипетки в металлический корпус (тип A). Затем добавьте второй перевозчик как крышка на вершине (тип B) и собрать картриджа.
4. Для обоих образцов, продолжить следующим: высокого давления замораживания образца перевозчик сборки один на один, загружая их в трехсекционный патрон в загрузки станции высокого давления морозильник. Нажмите кнопку процесса согласно инструкции по эксплуатации изготовителя.
   Примечание: Обоих типов образцов могут быть обработаны вместе в последующих замораживание замещения.
5. Поместите образцы в криопробирки, содержащих 2 мл замороженных дубильной кислоты 0,1% в ацетоне. Выполните передачу в ванну жидкого азота без разливать жидкого азота во флаконы. Передача криопробирки в блок автоматического замораживания в замену¹⁰ в-90 ° C и запустите программу.
   Примечание: Образцы хранятся в-90 ° C для 100 h. дубильной кислоты до osmification используется как Морилка для увеличения поглощения осмия тетраоксид¹¹.
6. Вручную мыть образцы 3 x 30 мин с 2 мл ацетона в-90 ° C в группе замещения моратория.
7. Оставьте образцов в 2 мл 2% осмия тетраоксид, уранила ацетата 0,1% в ацетон для дальнейшего окрашивания в автоматическом заморозить замены блока для 7 h-90 ° c.
   Предупреждение: осмия тетраоксид токсичных и должны быть обработаны под вытяжного шкафа, и должны носить защитное снаряжение.
   Примечание: Замораживание замены блока автоматически поднимает температуру до-20 ° C на 5 ° C/ч. Образцы хранятся в-20 ° C для 16 h в группе замещения моратория. Температура будет вызываться автоматически до 4 ° C на 10 ° C/ч.
8. Обмен осмия тетраоксид решение с чистым ацетоном, когда температура достигает 4 ° C. Удаление криопробирки из блока замещения моратория.

2. при содействии микроволновой обработки

Примечание: Выполнить все следующие шаги при комнатной температуре¹² с помощью блока управления температуры для поддержания стабильной температуры (см. Таблицу материалы).

1. Оставьте открытым колпачки трубы реакции во время обработки в микроволновой печи.
2. Возьмите металла прободержателей из криопробирки и удалить образцы из металлический корпус, с помощью тонкой щипцами или иглы, сохраняя образцы submersed в ацетоне в часы стекло блюдо (150 мм).
3. Передача образцов в 2 мл пробирок реакции с помощью тонкой щипцами или пипетки и мыть с 1 мл ацетона четыре раза для 40 s 250 Вт.
   Предупреждение: Thiocarbohydrazide является токсичным и должны быть обработаны под вытяжного шкафа, должны носить защитное снаряжение.
4. Пятно образцы с 1 мл 1% thiocarbohydrazide в ацетоне 14 мин 150 W, чтобы увеличить контрастность. Для окрашивания, Пипетка решение thiocarbohydrazide в трубу реакции, поместите трубку в микроволновой печи и настроить программу на уровень мощности 150 W (с функцией вакуумной включен) для 2/2 мин от итерации для 14 мин. Запустите микроволновой печи.
   Примечание: Thiocarbohydrazide реагирует с осмия тетраоксид, которая применялась во время моратория замещение. Он образует мост, позволяя более осмия тетраоксид депонироваться на оригинальные сайты осмия тетраоксид¹³.
5. Стирать образцы 4 x 1 мл ацетона для 40 s 250 W. пипеткой ацетона в реакции трубку, поместите трубку в микроволновой печи и выберите пункт 250 Вт для 40 s. старта микроволновой печи.
6. Пятно в 1 мл 2% осмия тетраоксид в ацетоне 14 мин 150 Вт пипеткой осмия тетраоксид решения в реакции трубку, поместите трубку в микроволновой печи и настроить программу на уровень мощности 150 W (с функцией вакуумной включен) для 2 мин/2 мин от , итерации для 14 мин. Запустите микроволновой печи.
7. Стирать образцы 4 x 1 мл ацетона для 40 s на 250 Вт (как это сделано в шаге 2.5).
8. Проникнуть в 1 мл увеличения концентрации смолы в ацетоне (см. Таблицу материалы) 25%, 50%, 75%, 90%, 100% и 100% за 3 мин 250 W. дозатор смолы в реакции трубку, поместите трубку в микроволновой печи и установить программу для питания Леве l 250 Вт (с функцией вакуумной включен) на 3 мин начать Микроволновая печь.

3. Минимальный смолы, встраивание⁸

1. Возьмите nervus tibialis и C. elegans из трубки реакции с зубочисткой и место их на кусок пластиковой пленки (см. Таблицу материалы).
2. Используйте зубочистку для аккуратно вставьте образец на пленку пока не обнаружено никаких оставшихся смолы. Используйте галогенная лампа для отопления (см. Таблицу материалы), поэтому смола становится менее вязкой и возможность более легко снимается. Место галогенная лампа достаточно близко, чтобы нагреть вверх смолы (будьте осторожны, чтобы не обжечь руки).
3. Полимеризоваться образцы для по крайней мере 48 часов при температуре 60 ° C на верхней части пластиковой пленки в духовке.

4. Подготовка к FIB-SEM

1. Вырезать полимеризованной образцы вместе с пластиковой пленки с помощью лезвия бритвы на размер установки заглушки SEM и прикрепить их к SEM заглушки с помощью проводящая Серебряная смолы (см. Таблицу материалы). Полимеризоваться снова при 60 ° C для по крайней мере 4 h или на ночь.
2. Распыления пальто образцы на SEM заглушки с золотом за 1 мин 35 мА с помощью распыления нанесения покрытий (платины/палладия также могут быть использованы; 10 Нм толщиной покрытия достаточно) и поместите их в FIB SEM.

5. сбор данных внутри FIB-SEM

1. Изображения образцов с детектор электронов средней, с использованием базового программного обеспечения, вождение микроскопа (см. Таблицу материалы). Образца должна быть ориентирована таким образом, что регион интерес (например, средняя часть nervus tibialis или C. elegans) находится в поле зрения.
   Примечание: Для выполнения сбора данных, наклона этап на позицию так, что образец сталкивается ионного пучка под углом в 90° на соответствующем расстоянии рабочей (5 мм) в так называемой совпадение точки пучка ионов и электронов. С помощью нашего инструмента, это достигается на стадии наклона 54° и 5 мм Рабочее расстояние.
2. Чтобы настроить правильное положение образца, центр общей чертой на 0° наклона при визуализации с детектор средних электронов. Медленно наклона 54 ° (5°, 20°, 54°), recentering и тот же объект, перемещая М-оси.
3. Найти совпадение точки центрирования функции при визуализации с детектор средних электронов на 54°, а затем перемещая функцию центральное место в режиме FIB. Выполните это, показывая перекрестья в SEM программное обеспечение, чтобы иметь представление центра. Тогда сначала переместите выбранный образец компонента в центр области изображения с помощью функции точки центр SEM программного обеспечения. Затем центр функцию по оси y, перемещая сцене в z. Любое окончательное смещение между FIB и SEM корректируется с SEM луч сдвига.
4. Открыть расширенный программного обеспечения (см. Таблицу материалы) для записи 3D наборов данных и следуйте шаг за шагом мастера программного обеспечения.
5. В регионе интереса, депозит углерода или платины (400 Нм) на вершине ROI использованием 3 nA текущего разрешить даже фрезерные и уменьшить артефакты индуцированных зарядки.
   Примечание: Путем рисования региона, представляющих интерес для фрезерования на поверхности образца, отображаемого с FIB (ширина, высота, глубина), программное обеспечение вычисляет и начитан размеров различных образцов подготовка функций, таких как траншеи, чтобы быть фрезерованные или области для Платина/углерода осаждения. Кроме того будьте осторожны изображений поверхности образца с слишком высокие токи FIB, как это может повредить поверхности образца. Ток 50 ПА является достаточным для изображений.
6. Используйте целенаправленного ионный луч для стан траншею подвергать региона интерес (ROI) с помощью 15/30 nA текущей.
7. Используйте целенаправленный ионный луч для полировки сечения с 7 nA текущей.
8. После окончания подготовки пробы, установите следующие параметры изображений: FIB фрезерные параметры на вкладке Настройка FIB (FIB фрезерования тока); Визуализации параметров на вкладке установки и изображения, Настройка параметров на вкладке SEM AutoTune SEM (выполнения автофокусировки и autostigmation каждые 60 мин, размер пикселя 50 Нм, продолжительность 3, строка средняя 3). Оптимизируйте это для каждого образца.
9. Чтобы предотвратить любой тепловой дрейф, вызывая блок лицо дрейф во время выполнения, оставьте место для по крайней мере 2 ч до начала приобретения.
10. Получить набор данных в непрерывный стан и приобрести режим с 700 ПА FIB текущей. Использование 1,5 кв (аналитический режим, 900 V) детектор ESB с напряжением 400 V приобрести Сетка Фото с 5 размер пикселя Нм, используя передовые программное обеспечение (см. Таблицу материалы) и 50 Нм толшины. Приобретение одного изображения занимает около 1,5 мин с продолжительность 6 МКС.
11. Начало сбора данных. FIB изображение на фрезерные текущего приобретается обеспечить образца не двигаться и выбран правильный области интереса. При необходимости отрегулируйте.

6. а. Визуализация

1. Откройте изображения в Фиджи, перетащив папку, содержащую все изображения в Фиджи и выберите Виртуальный стек.
2. Обрезка области интереса, используя инструмент прямоугольник (изображение > урожай).
3. Инвертировать данные, чтобы показать контраст традиционной передачи электронной микроскопии с мембранами, показывая вверх в темноте (Редактировать > Инвертировать).
4. Использование TrackEM2¹⁴ (¹⁵Фиджи) для выравнивания. Загрузить данные в TrackEM2 (Файл > Новый > TrackEM2), щелкнув на слое. После загрузки всех изображений, привести их в соответствие с помощью многослойной мозаика функции (щелкните правой кнопкой мыши на изображение > Align > Выровнять многослойных мозаика). После выравнивания, изображения экспортируются в отдельные файлы tiff (щелкните правой кнопкой мыши на изображение > Экспорт > сделать плоский образ). Выберите все изображения, которые должны быть экспортированы и выберите сохранить в файл.
5. Для пост-обработки, используйте Гауссу (процесс > Фильтры > Gaussian blur; Сигма 2) и локальное улучшение контраста (процесс > повышения локального контраста; CLAHE: blocksize 127, гистограмма бункеров 256, максимальный наклон 1.5), которые применяются в Фиджи для сглаживания изображения и получить лучшее соотношение сигнал шум.
6. IMOD¹⁶ используется для выполнения ручной сегментации и визуализировать структуру интереса к 3D. Откройте набор данных в IMOD и выберите инструменты рисования (Специальные > инструменты рисования) для выполнения ручной сегментации. Различные ручные инструменты могут использоваться для следовать структуре интерес во всем объеме (например, соединения, лепить). Используйте браузер изображений микроскопии (¹⁷МБ) для полуавтоматического сегментации.

Рабочий процесс начинается с образцом (здесь, tibialis nervus свежезаваренным расчлененных мыши) в металлических перевозчиков для замораживания высокого давления (рис. 1a). Перевозчики оправился от жидкого азота (рис. 1b) и помещается в блок замены заморозить на вершине замороженных первый химический коктейль (рис. 1С). После длительного замораживания замены протокола, включая 2% осмия тетраоксид и 0,1% ацетат уранилнитрата, образцы удаляются из перевозчиков при комнатной температуре (рис. 1 d). Для дальнейшего повышения контраста, образцы будут переданы пластиковые трубы для обработки в микроволновой печи (Рисунок 1e). Вакуумной камеры и блок управления температуры используются для оптимизации процесса (Рисунок 1f).

Чтобы иметь возможность выполнить встраивание минимальный смолы, зубочистки и листы пластиковой пленки необходимы (рис. 2a). После проникновения образцы смолой с помощью микроволновой печи, они размещены на куски пластиковой пленки и двигался до тех пор, пока не смолы остается на поверхности образца. Галогенная лампа используется для слива оставшиеся смолы и оставить образец минимально встроенных (Рисунок 2Б) на пластиковой пленки. Следует отметить, что больше смолы, удалены из верхней части образца является хорошим. По-прежнему должно быть небольшое количество слева под образец, чтобы держать его с подложкой. Этот образец полимеризуется на пленку вырезать и монтируется поверх SEM заглушки с серебряные проводящих смолы (рис. 2 c). Заглушки полимеризуется по крайней мере 4 часа при температуре 60 ° C (Рисунок 2d). Компоненты должны быть тщательно перемешивают, или смесь не может правильно полимеризоваться. Чтобы избежать зарядки внутри сканирующий электронный микроскоп, заглушки — кляксы с покрытием золотом или платины/палладия (Рисунок 2e).

Образцы помещаются в FIB-SEM и образы с детектор средних электронов для региона интерес (рис. 3ae). Ионный луч используется для удаления материала непосредственно перед региона интерес подвергать поперечного сечения (Рисунок 3b-d, 3f-h). Стандартные протоколы часто страдают от недостатка контрастности мембраны (Рисунок 3bf), в то время как расширение протокола обеспечивает сильное мембраны контраст (рис. 3 c-d, 3 g-h).

ЕТ данных (после пост-обработки) визуализируются с помощью IMOD, обработки изображений и моделирования программа. Для достижения лучшего понимания 3D информации, используется виртуальный reslicing данных (рис. 4a). Различные структуры набора данных разбиваются вручную (рис. 4b-d).

Рисунок 1: высокого давления замораживания, замораживание замены и при содействии микроволновой обработки. () образец перевозчика, содержащие tibialis nervus мыши, шкалы бар 3 mm. (b) прободержатели содержащие tibialis nervus мыши после высокого давления замораживания, шкалы бар 3 мм. (c) Автоматическое замораживание замещения (AFS) единицы с образцами. Вставка: по заказу металлический контейнер для до 23 образца флаконов и два больших флаконов, содержащих химические вещества в АФН. (d) образцы, удаляется из перевозчиков в стеклянную посуду в ацетоне, масштаб бар 3 мм (e) образцы реакции Пробирки положить в микроволновой печи для обработки. (f) вакуумной камеры и терморегулирование устройство микроволновой печи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: встраивание минимальный смолы и подготовка к FIB-SEM. () полиэтиленовой пленкой и зубочистками, которые используются для минимальной смолы встраивание, шкалы бар 4 cm. (b) Nervus tibialis осушенных смолы на верхней части пластиковой пленки, шкалы бар 250 мкм. (c) Nervus tibialis полимеризуется на пленку, а затем вырезать и монтируется поверх SEM заглушки с серебряные проводящих смолы, шкалы бар 250 мкм. (d) образцы полимеризуется на вершине SEM заглушки, шкала 3 мм бар. (e) образцы, покрытые золотом на SEM заглушки, шкалы бар 3 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: Подготовка образца внутри FIB-SEM. (и e) Электрон средних изображения внутри SEM-FIB образца поверхности () Nervus tibialis, шкалы бар 100 µm. (e) C. elegans, шкалы бар 2 мкм (b-d) и (f-h) сечение через образец с помощью ESB детектор для изображений. (b и c) Nervus tibialis, масштаб бар 2 мкм. (f и g) C. elegans, шкалы бар 1 мкм и 200 Нм. (b и f) Приведены результаты высокого давления блокирования и замораживания замены без расширения, тогда как все другие изображения показывают результаты повышения моратория замещение. (d и h) Детальное изображение образца с помощью детектора ESB. (d) tibialis Nervus, шкалы бар 200 Нм. (h) C. elegans, шкалы бар 200 Нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4: приобретение и визуализации изображений. (a) ет данные, отображаемые в IMOD с практически resliced x / z и y/z самолеты, масштаб бар 2 мкм. (b) сегментированных аксоны на EM данных (синий), Remak связки (красный), миелиновой оболочки (желтый и оранжевый) и митохондрии (бирюзовый), масштаб бар 2 мкм. (c и d) 3D-модель, шкалы бар 2 мкм и 500 Нм . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Отсутствие конфликта интересов объявил.