Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Прямой впрыск лентивирусные вектора выделяет несколько мотор путей спинного мозга крысы

8.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59160

⸱

15 марта 2019 г.

 ,  ,  ,  , 
1Shriner's Pediatric Research Center, Temple University

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол демонстрирует инъекции retrogradely переносные вирусный вектор в ткани спинного мозга крысы. Вектор take up в синапсе и перевезены в клетки тела нейронов целевой. Эта модель подходит для ретроградного отслеживания важных путей спинного мозга или ориентации клетки для генной терапии приложений.

Аннотация

Представляя протеинов интереса в клетки нервной системы является сложной задачей из-за врожденной биологические барьеры, которые ограничивают доступ к большинство молекул. Инъекции непосредственно в ткани спинного обходит эти барьеры, обеспечивая доступ к Сотовые органов или синапсов, где молекулы могут быть включены. Сочетание вирусных векторной технологии с помощью этого метода позволяет для внедрения целевых генов в нервной ткани для генной терапии или тракта трассировки. Здесь вирус инженерии для высокоэффективных Ретроградная транспорта (HiRet) вводится в синапсах propriospinal интернейронов Латвийской почты (PNs) для поощрения конкретных видов транспорта для нейронов спинного мозга и ядрах ствола головного мозга. Ориентация ПНС использует многочисленные соединения, которые они получают из мотора, таких как rubrospinal и вставочные участки, а также их взаимосвязи друг с другом на протяжении сегментов спинного мозга. Представитель трассировки с помощью вектора HiRet с конститутивно активных Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) показывает высокоточных деталей органов ячейки, аксоны и дендритных беседки в грудной ПНС и вставочные нейроны в Понтийские ретикулярной формации. HiRet включает в себя хорошо в пути ствола мозга и ПНС, но показывает возраст зависит от интеграции в кортикоспинальных путей нейронов. В целом спинного инъекций с использованием вирусных векторов является подходящим методом для внедрения протеинов интереса в нейроны целевых участков.

Введение

Вирусных векторов являются важными биологического инструментами, которые можно ввести генетического материала в клетки для того чтобы компенсировать дефектных генов, upregulate существенный рост белки или производство маркер белки, которые подчеркивают структуру и синаптических связей их цели. Эта статья посвящена прямым впрыском высокоэффективных retrogradely переносные лентивирусные вектора в спинной мозг крыс для того чтобы выделить основные моторные пути с флуоресцентные трассировки.  Этот метод также является весьма уместным для аксональное регенерации и отрастания исследований ввести протеинов интереса в разнообразных популяций нейронов и был использован для замолчать нейронов для сопоставления функциональных исследований1,2.

Многие анатомические детали позвоночника моторные пути были выяснены путем прямого впрыска исследований с классической Трейсеры как BDA и фтор золото3,4,5,6,7 , 8. Эти Трейсеры считаются золотой стандарт, но может иметь определенные недостатки, такие, как поглощение повреждения аксонов, или аксоны в проход в белого вещества, окружающих инъекции сайта9,10,11 . Это может привести к неправильной интерпретации путь подключения и может быть недостаток в регенерации исследования где поглощение красителя поврежденные или отрезанные аксоны может быть ошибочно принято за регенерирующее волокна во время последующего анализа12.

Лентивирусные векторы популярны в генной терапии исследований, поскольку они обеспечивают стабильные, долгосрочные выражение в нейрональных популяций13,14,,1516,17,18 ,19. Тем не менее, традиционно упакованных лентивирусные векторы могут ограничили Ретроградная транспорта и может вызвать реакцию иммунной системы при использовании в естественных условиях4,,2021. Высоко эффективная Ретроградная транспорта вектор называется HiRet был подготовлен по Kato et al., изменяя вирусный конверт с гликопротеин вирус бешенства для создания гибридных вектор, который улучшает Ретроградная транспорта22,23.

Ретроградная трассировки представляет вектор в синаптических пространство целевого нейрона, позволяя ему быть принятые этой ячейки аксона и перевезены в клетки тела. Успешной перевозки HiRet была продемонстрирована из нейрональных синапсах в мозг мышей и приматов23,24 и мышцы в двигательных нейронов22. Этот протокол демонстрирует инъекции в поясничного отдела спинного мозга, предназначенная специально для синаптических терминалы propriospinal интернейронов и нейронов мозга. ПНС получать соединения от многих различных путей спинного мозга и таким образом могут быть использованы для различных слоев населения нейронов спинного мозга и ствола мозга. Приклеенные этикетку нейронов в этом исследовании представляют цепей, иннервирующих мотонейрона бассейны, связанных с моторной функции задних конечностей. Надежной маркировки рассматривается в спинного мозга и ствола мозга, включая высокой четкости деталей дендритных беседки и аксон терминалов. Мы также использовали этот метод в предыдущих исследованиях в рамках шейного отдела спинного маркировать propriospinal и ствола мозга вставочные пути25.

Этот протокол демонстрирует инъекции вирусный вектор в поясничного отдела спинного мозга крысы. Как видно в кино 1, разрез является мишенью для выявления L1 позвонка, расположенный у последнего ребра. Это используется в качестве хвостовой вехой для 3-4 см разрез, предоставляющий мускулатура через спинной мозг L1-L4. Laminectomies спинной аспектов T11-T13 позвонков, выполняются и скошенные стеклянные игла направлена 0,8 мм сбоку от средней линии и опустил 1,5 мм глубоко в сером веществе придать вирус.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все следующие хирургические и животных ухода процедуры были одобрены Уход за животными и использование комитета университета Темпл.

1. предварительно хирургические препараты

  1. Подготовьте вытащил стекла иглы для вирусных инъекций за несколько дней до операции, используя 3,5 nanoliter стекла капиллярные пипетки предназначены для nanoliter форсунок. Тяните каждый дозатор иглы съемник двухэтапный согласно инструкциям производителя для создания двух шаблонов иглы.
  2. Уточните кончик иглы шаблонов, отрезав примерно 1-2 мм излишки стекла с microscissors. Мера приблизительное диафрагмы под микроскопом с калибровки микроскопа изолировать иглы с отверстиями 30-40 мкм.
  3. С иглой, дислоцированные в 30° используйте микропипеткой beveller для создания подсказка с 30-40 мкм диафрагмы и скошенный угол 45°. Проверка ширины диафрагмы с нониуса масштаба на слайде калибровки. Пройти через стеклянный иглу с помощью шприца с насадкой гибкой иглой смыть мусора и Марк иглы на регулярной основе с черным маркером воды и этанола.
  4. Иглы в крытой Петри, ранее очищен с 70% этанола и стерилизовать 30 мин в капюшоне биобезопасности под УФ светом.
  5. Подготовка HiRet человека, удалив соразмерную громкость из холодильника непосредственно перед процедурой.
    Примечание: Соразмерную громкость включает суммы, необходимой для инъекций (1 мкл на инъекцию x количество инъекций) плюс небольшое количество дополнительного объема для учета закупорить и погрузка потерь. Перевозить и хранить вирус на льду когда не в пользе.
  6. Подготовьте инжектор, подключить его в микронасосом и поместив его в микроманипулятор с нониуса масштаба.
  7. Подготовить стеклянных иглу, тщательно загрузить цветной краситель например Красного масла с помощью шприца оснащен гибкой иглой. Убедитесь, что нет пузырьков остаются в иглу. Используйте асептические технику при обращении с иглой и воздерживаться от прикосновения кончика.
  8. Вставить иглу стекла в инжектор, обеспечивающ что игла установлена правильно в шайбы, форсунки колпачок ввинчивается на жесткой, и стали инжектор иглу распространяется приблизительно на ¾ длины иглы стекла. Вирус может быть загружена в иглу на более позднем этапе.

2. анестезии и хирургических сайт подготовка

  1. Вес животного на цифровой шкале. Запись предоперационное вес для определения объема необходимых анестетика и для контроля веса после хирургии. Самок Sprague-Dawley приблизительно 200 – 250 g использовались в настоящем Протоколе.
  2. Анестезировать крыс с помощью изофлюрановая ингаляции или вводят раствора кетамина/Ксилазина (k / x). Здесь кетамин внутрибрюшинно вводили в 67 мг/кг и ксилазина в дозировке 6,7 мг/кг.
  3. Подтвердите соответствующие анестетиков плоскости, щипать ноги твердо. Если рефлексивного выхода происходит, подождите несколько дополнительных минут, прежде чем продолжить.
    Примечание: Также наблюдать за усы, глаза и частота дыхания для признаков сознания. Если подергивания усы, глаз мигает, когда коснулся нежно, или дыхание быстрое и неглубокие, подождите, пока плоскости обезболивающий глубже приступить к протоколу. Также контролировать эти знаки на протяжении Ламинэктомия и инъекции хирургии. Если животное показывает мелкой обезболивающий плоскости, администрировать руля выстрел кетамин только равный ½ оригинальный k / x дозировки.
  4. Бритье крыса вдоль спинной midline от бедра до нижнего угла лопатки. Потяните кожу животного тугой легче и более точного бритья.
  5. Применить глазная мазь для обоих глаз.
  6. Применяются антисептические бритая район для стерилизации на сайте. Для первого скраб Замочите марлевый стерильный раствор 5% йода и стереть прочь все волосы и мусор. Следить за этим с однонаправленной пальцем с стерильной марлей, пропитанной 70% этиловом спирте, таким образом, чтобы ни один район направляется дважды. Используйте эту же технику с чередующимися йода и этанола, пропитанной марлевые вдвое больше.

3. хирургического поля и инструмент подготовки

  1. Подготовьте набор газобетона хирургических инструментов, которые включают скальпель, rongeurs, Крысиный зуб щипцы, Весна ножницы, hemostats, средней точки Изогнутый пинцет и ретракторы или взвешенных крюки развертки стерильных обертывание для создания поля, стерильный.
  2. Откройте пакет стерильные хирургические перчатки и поместите обернуть стерильных перчаток на столе. Используйте это в качестве дополнительного стерильные поля для используемых инструментов для предотвращения загрязнения запасов стерильных wrap.
  3. Перетащите поле стерильным лезвием скальпеля #10. Закрепите лезвие на ручку с hemostats. Позиция стерильного физиологического раствора, 4.0 Хромовой Кетгуд шов и материалы для контроля кровотечения, таких как cauterizer, стерильную марлю, стерильным ватным наконечником аппликаторы (для мышц кровоточит), или gelfoam или bonewax (для костей кровоточит) в доступном месте.
  4. Получить животных и установите его на стерильной тканью. Поместите марлю под мочевого пузыря для сбора мочи. Подпирать целевой области с проката полотенце под живот. Если возможно, место хирургические грелку под стерильной тканью, особенно для больше процедур.
    Примечание: Бесплодие имеет важное значение во время хирургии выживания. Держите бутылку спрей под рукой, чтобы поддерживать стерильность перчатках, и использование бисера стерилизатор если стерильность инструмента компрометации, или между отдельными операций на 70% спирте.

4. выявление позвоночника и выявления Ламинэктомия сайт

  1. Определите области, где разрез кожи будут приниматься путем нажатия пальцами нежно последнего ребра найти L1 позвонка. Используя это в качестве ориентира, делают разрез кожи 3-4 см с #10 хирургическим скальпелем заканчивается просто уступает L1 подвергать мышцы. Придерживайте кожу подтянутой распространяя нежный и зафиксируйте с лезвием скальпеля для обеспечения чистого разреза.
  2. Вырезать и распространение поверхностный жир с щипцы и ножницы, в случае необходимости. (В зависимости от целевой позвонка, там может быть или не быть большой жировой ткани, поверхностные мышцы).
  3. Почувствовать остистого отростка с плоским лезвием скальпеля или палец. Часто будет озвучена срединная область «V» белый фасции с обеих сторон. Сделайте небольшой надрез ростральной разрешить обслуживание надежно ухватиться верхней процесс пинцетом крысиный зуб, а затем сделать 2 длинные, глубокие порезы как можно ближе к процессы как можно скорее. В глубокой точке разреза спинной поверхности позвонков может ощущаться с лезвием скальпеля.
  4. Держите боковые мышцы сторону с ретракторы или взвешенных крючки для улучшения видимости. Четкие мышцы вокруг процессов с скальпель, Весна ножницы или rongeurs чтобы определить форму головы.
    Примечание: Помните, что спинного мозга не распространяется полная длина позвоночника, как спинного тканей останавливается растет ранее в развитии чем кости. Это означает, что целевой уровень спинного мозга могут быть под по-разному именем позвонка.
  5. Найдите T11 и смежные процессы T12 и T13.
    Примечание: Помощь в ориентации правильные позвоночного уровня можно найти в Атлас спинного мозга крыс и предыдущих исследований, описанием достопримечательностей в мышь, которая имеет очень похожи позвоночных структура6,33. Оставьте ростральной остистого отростка, например T9 спокойно дать ориентир срединной линии.

5. выполнение Ламинэктомия

  1. После того, как был правильно определен целевой области, выполняют laminectomies спинной аспектов T11-T13. Аккуратно распространение позвонков раскрыть межпозвонковых связок, которые являются хорошие сайты для вставки rongeurs для первоначального укус кости. Держите rongeurs в положении, полузакрытыми, увеличить штраф контроль.
  2. Удаление остистого отростка и спинной позвонок, принимая небольшие закуски с rongeurs. Будьте осторожны, чтобы не повредить спинной мозг или нарушить Дура. Слегка приподнимите пинцетом зуб крысы, чтобы помочь вытащить спинного мозга от позвонков и уменьшить тенденцию к хит спинного тканей.
  3. Убрать кости от средней линии так, что может наблюдаться срединной кровеносного сосуда. Оставьте окно, которое ясно показывает ткани спинного мозга и мусора.
  4. Нежно коснуться спинного мозга с щипцами. Некоторые животные могут рефлекторно прыгать, даже если их обезболивающий самолет глубоко. Нанести несколько капель онемение агента как лидокаин непосредственно на спинной мозг для предотвращения прыжки во время процедуры инъекции.
  5. Закрепите животного в спинномозговой держатель крепления стабилизирующим щипцы для остистого отростка ростральной и каудально к окну Ламинэктомия. Поднимите брюшке животного с помощью держателя позвоночника инвертировать эффект дыхательных движений. Это увеличит иглы стабильности и обеспечения соответствующей глубины инъекций.

6. Загрузка вируса и позиционирование инжектор

  1. Загрузить вирус в инжектор, закупорить приблизительно 5 мкл на кусок парафина и позиционирования иглы, таким образом, чтобы кончик внутри падение.
  2. Используйте микронасосом снять до 4 мкл вируса со скоростью 20 – 100 nL/сек.
  3. Установите контроллер инъекционные и выпустить небольшое количество вируса от иглы, чтобы убедиться, что кончик иглы не блокируется. Стереть избыток вируса Лаборатория салфеткой.
    Примечание: Гамильтон шприц с иглой стальной может использоваться как альтернатива вытащил стеклянной пипетки.
  4. Поместите микроманипулятор так, что видна нониуса масштаба и положение иглы в средней линии спинного мозга.
    Примечание: Midline иногда может быть расположен на большой кровеносный сосуд на передней поверхности спинного мозга. Однако это может варьироваться в отдельных крыс, и ориентации срединной линии должны быть подтверждены по сравнению с нетронутыми остистого отростка.
  5. Прямые иглы боково на 0,8 мм, используя нониуса масштаба на микроманипулятор.
  6. Опустите иглу в спинном до тех пор, пока это отступов, но не прокола, дура. Используя быстрый вращательные движения, прокол дура с иглой, до тех пор, пока она упала на глубину 1,5 мм.

7. инъекции вируса в спинного мозга

  1. Когда игла находится в месте, программа инжектор впрыснуть в размере 400 нл/мин подтвердить что вирус вступает спинного мозга, наблюдая прогресс краситель фронта. Там должно быть без очевидных утечки или выпячивание тканей спинного мозга. Если наблюдается утечки, это иногда может быть уменьшена путем уменьшения скорости впрыска до 200 nL/мин.
  2. По окончании инъекции позволяют иглы на отдых в спинном мозге для 2-5 мин (в зависимости от объёма инъекции) для облегчения распространения вируса.
  3. Медленно снять иглу и перейти на следующий сайт инъекции. Inject 1 мкл вируса в каждой из 6 сайтов равномерно около 1 мм друг от друга по длине L1-L4 позвоночника ткани. Той же иглой может использоваться для каждой инъекции, пока он продолжает функционировать должным образом.

8. Закрытие и послеоперационный уход за ранами

  1. Удалите животное из держателя позвоночника и вывезти ретракторы или крючки, используемые для распространения боковые мышцы. Убедитесь, что раны ясно все мусора перед закрытием.
  2. Шов мышц с помощью 4.0 Хромовой Кетгуд швов. Вырежьте шовные потоков вблизи узел для уменьшения вероятности раздражения внутренних кожи.
  3. Сшивание кожи закрыты с использованием 9-мм раны клипы. Чтобы разрешить для оптимального лечения, линия до края кожи до сшивания.
  4. Поместите животное на воде конвекции потепление площадку и монитор до бодрствующем.
  5. Придать 5 – 10 мл стерильного физиологического раствора подкожно для пополнения жидкости и антибиотик например Цефазолин для предотвращения инфекции. Когда животное амбулаторно, поместите его обратно в свои дома клетке и обеспечить первоначальный анальгетиков.  Контролировать крыс для любого знака боли и страданий и лечить согласно вашей IACUC утверждения процедуры для облегчения боли.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Успешное инъекций и транспорта вирусный вектор должно привести к трансдукции надежные населения односторонних нейронов спинного мозга и в некоторых ядрах ствола головного мозга. Рисунок 1 демонстрирует, стереотипные маркировки нейронов и аксоны в грудного отдела спинного и Понтийские ретикулярной формации ствола мозга на четыре недели после инъекции. Значительные экспрессия гена GFP рассматривается в нейроны в сером веществе грудного отдела спинного мозга на стороне ипсил...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Генетические манипуляции нейронов в головном и спинном служил для выделения чувств, мотор и вегетативная пути через флуоресцентные трассировки и исследовать потенциал отрастания нейрональных участки после травмы27,28, 29 , 30 , 31 , 32 , 33. прямого впрыска retrogradely переносные вирусный в...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа финансировалась за счет гранта от Национальный институт неврологических нарушений и инсульта R01 R01NS103481 и Больница Шрайнерс для педиатрических исследований предоставляет ГХК 84051 и SHC 86000 и Министерство обороны (SC140089).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
#10 Лезвия для скальпеляRobozRS-9801-10Для использования со скальпелем.
1 мл шприцевBecton, Dickinson and Company309659Для инъекций анестетика, потенциальных бустерных инъекций анестетика и инъекций антибиотиков.
Шприцы 10 млBecton, Dickinson and Company309604Для введения физиологического раствора животному после операции.
4.0 Хромовый кетгутовый шовный материалDemeTECHNN374-16Для повторного связывания мышц во время закрытия.
48000 Устройство для снятия фаски с микропипеткамиWorld Precision Instruments32416Используется для снятия фаски с кончиков натянутых стеклянных капиллярных трубок с образованием функциональных стеклянных игл.
5% раствор йодаPurdue Products L.P.L01020-08Для использования при стерилизации операционного поля.
70% этанолН/ДН/ДДля стерилизации вновь подготовленных стеклянных игл, животных моделей во время хирургической подготовки и рук хирурга во время операции, а также для всех других незначительных мер по поддержанию стерильности.
Анестетик (раствор кетамина/ксилазина)Zoetis240048Для удержания животного в правильной плоскости сознания во время операции.
Антибиотик (цефазолин)West-Ward PharmaceuticalsNPC 0143-9924-90Для подкожного введения для предотвращения инфекции после операции.
Стерилизатор шариковCellPoint5-1450Для термической стерилизации хирургических инструментов.
BonewaxFine Science Tools19009-00Для запечатывания кости в случае костного кровотечения.
CacterizerFine Science Tools18010-00Для герметизации любых артерий или вен, разорванных во время операции, чтобы предотвратить чрезмерную кровопотерю.
Цифровые весыOkausREV.005Для взвешивания животного во время хирургической подготовки.
Гибкая насадка для иглWorld Precision InstrumentsMF34G-5Для очистки стеклянных игл и загрузки красного масла в стеклянные иглы.
Гель-пенаPfizerH68079Для герметизации кости в случае костного кровотечения.
Стеклянные капиллярные трубкиWorld Precision Instruments4878Для тянутых стеклянных игл - должны быть рассчитаны на нанолитровые инжекторы.
Машинки для стрижки волосOster111038-060-000Для очистки хирургического участка от волос.
ГемостатыRobozRS-7231Для общего применения в хирургии.
KimwipesKimtech34155Для общего использования в хирургии.
Изогнутые щипцы со средней точкойRobozRS-5136Для общего использования в хирургии.
Микроманипулятор с нониусной шкалойKanetecN/AДля точного наведения во время операции.
МикроножницыRobozRS-5621Для резки стекла отсчитываются от только что выдернутых стеклянных капиллярных трубок.
Микроскоп со световым и нониусным масштабом ОкулярныйLeitz WetzlarN/AИспользуется для визуализации и измерения скоса стеклянных капиллярных трубок в функциональные стеклянные иглы.
Контроллер насоса MicroSyringePrecision Instruments62403Для контроля скорости впрыска.
Nanoliter 2000 Pump Head InjectorWorld Precision Instruments500150Для загрузки и впрыска вирусов контролируемым образом.
Съемник иглNarishigePC-100Для нагрева и раздвигания стеклянных капиллярных трубок с образованием стеклянных игл.
Офтталамическая мазьDechra Veterinary ProductsRAC 0119Для защиты глаз животного во время хирургического вмешательства.
ПарапленкаBemisPM-996Для помощи при загрузке вируса в наноинъектор.
Иглы PrecisionGlide (25G x 5/8)Becton, Dickinson and Company305122Для использования со шприцами объемом 1 мл и 10 мл для введения в животную модель.
Щипцы для зубов крысыRobozRS-5152Для захвата остистых отростков.
Красное маслоН/Д Н/ДДля обеспечения фронта для визуализации вируса, проникающего в ткани во время инъекции.
Втягивающие устройстваRobozRS-6510Для удержания открытой операционной раны.
Rimadyl TabletsBio ServMP275-050Для обезболивания после операции.
RongeursRobozRS-8300Для удаления мышц позвоночного столба во время операции.
Рукоятка лезвия скальпеляRobozRS-9843Для разрезания кожи и жировой подушки животной модели во время операции.
НожницыRobozRS-5980Для общего использования в хирургии.
Зажимы для ран Stainless StealCellPoint201-1000Для связывания кожи операционной раны во время закрытия.
Щипцы для снятия скобKent ScientificINS750347Для удаления скоб, если они были наложены неправильно.
Стерильная салфеткаPhenix Research ProductsBP-989Для обеспечения стерильной поверхности для проведения операции.
Стерильные аппликаторы с ватным наконечникомPuritan806-WCДля впитывания крови в операционной ране при сохранении стерильности.
Стерильная марляCovidien2146Для очистки хирургической области и хирургических инструментов с сохранением стерильности.
Стерильный физиологический растворBaxter Healthcare Corporation281324Для использования при очистке крови и для замены жидкостей после операции.
Хирургические перчаткиН/ДН/ДДля использования хирургом для поддержания стерильного поля во время операции.
Хирургическая грелкаН/Д/ДДля поддержания температуры тела животного модели во время операции.
Хирургический микроскопН/Д Н/ДДля улучшенной визуализации операционной раны.
Хирургический степлерKent ScientificINS750546Для наложения скоб.
T/Pump Heat Therapy Водяной насосGaymarTP500CДля закачки теплой воды в нагревательную прокладку с конвекцией воды.
Прокладка для согревания воды с конвекциейBaxter Healthcare CorporationL1K018Для использования в послеоперационной зоне восстановления для поддержания температуры тела животного, находящегося в бессознательном состоянии.
Утяжеленные крючкиН/ДН/ДДля удержания открытой операционной раны.
World Н

Ссылки

  1. Wang, X., et al. Deconstruction of corticospinal circuits for goal-directed motor skills. Cell. 171 (2), 440-455 (2017).
  2. Kinoshita, M., et al. Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates. Nature. 487 (7406), 235-238 (2012).
  3. Brichta, A. M., Grant, G. Cytoarchitectural organization of the spinal cord. The rat nervous system. Vol. 2, hindbrain and spinal cord. , Academic Press. (1985).
  4. Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. Projections from the brain to the spinal cord in the mouse. Brain Structure & Function. 215 (3-4), 159-186 (2011).
  5. Rexed, B. The cytoarchitectonic organization of the spinal cord in the cat. The Journal of Comparative Neurology. 96 (3), 414-495 (1952).
  6. Schmued, L. C., Fallon, J. H. Fluoro-gold: A new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties. Brain Research. 377 (1), 147-154 (1986).
  7. Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies. Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).
  8. Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G., Heise, C. Atlas of the rat spinal cord. The spinal cord. , 238-306 (2009).
  9. Brandt, H. M., Apkarian, A. V. Biotin-dextran: A sensitive anterograde tracer for neuroanatomic studies in rat and monkey. Journal of Neuroscience Methods. 45 (1-2), 35-40 (1992).
  10. Geed, S., van Kan, P. L. E. Grasp-based functional coupling between reach- and grasp-related components of forelimb muscle activity. Journal of Motor Behavior. 49 (3), 312-328 (2017).
  11. Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y., Del Mar, N., Honig, M. G. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 23-37 (2000).
  12. Steward, O., Zheng, B., Banos, K., Yee, K. M., et al. Response to: Kim et al., "axon regeneration in young adult mice lacking nogo-A/B." neuron 38, 187-199. Neuron. 54 (2), 191-195 (2007).
  13. Brown, B. D., et al. A microRNA-regulated lentiviral vector mediates stable correction of hemophilia B mice. Blood. 110 (13), 4144-4152 (2007).
  14. Lo Bianco, C., et al. Lentiviral vector delivery of parkin prevents dopaminergic degeneration in an alpha-synuclein rat model of parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (50), 17510-17515 (2004).
  15. Malik, P., Arumugam, P. I., Yee, J. K., Puthenveetil, G. Successful correction of the human cooley's anemia beta-thalassemia major phenotype using a lentiviral vector flanked by the chicken hypersensitive site 4 chromatin insulator. Annals of the New York Academy of Sciences. 1054, 238-249 (2005).
  16. Pawliuk, R., et al. Correction of sickle cell disease in transgenic mouse models by gene therapy. Science. 294 (5550), 2368-2371 (2001).
  17. Wang, G., et al. Feline immunodeficiency virus vectors persistently transduce nondividing airway epithelia and correct the cystic fibrosis defect. The Journal of Clinical Investigation. 104 (11), R55-R62 (1999).
  18. Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. The red nucleus and the rubrospinal projection in the mouse. Brain Structure & Function. 217 (2), 221-232 (2012).
  19. Abdellatif, A. A., et al. delivery to the spinal cord: comparison between lentiviral, adenoviral, and retroviral vector delivery systems. Journal of Neuroscience Research. 84 (3), 553-567 (2010).
  20. DePolo, N. J., et al. VSV-G pseudotyped lentiviral vector particles produced in human cells are inactivated by human serum. Molecular Therapy. 2 (3), 218-222 (2000).
  21. Higashikawa, F., Chang, L. Kinetic analyses of stability of simple and complex retroviral vectors. Virology. 280 (1), 124-131 (2001).
  22. Hirano, M., Kato, S., Kobayashi, K., Okada, T., Yaginuma, H., Kobayashi, K. Highly efficient retrograde gene transfer into motor neurons by a lentiviral vector pseudotyped with fusion glycoprotein. PLoS One. 8 (9), e75896(2013).
  23. Kato, S., et al. A lentiviral strategy for highly efficient retrograde gene transfer by pseudotyping with fusion envelope glycoprotein. Human Gene Therapy. 22 (2), 197-206 (2011).
  24. Kato, S., et al. Selective neural pathway targeting reveals key roles of thalamostriatal projection in the control of visual discrimination. The Journal of Neuroscience. 31 (47), 17169-17179 (2011).
  25. Sheikh, I. S., Keefe, K. M., et al. Retrogradely transportable lentivirus tracers for mapping spinal cord locomotor circuits. Frontiers in Neural Circuits. 12, 60(2018).
  26. Harrison, M., et al. Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse. NeuroImage. 68, 22-29 (2013).
  27. Tang, X. Q., Heron, P., Mashburn, C., Smith, G. M. Targeting sensory axon regeneration in adult spinal cord. The Journal of Neuroscience. 27 (22), 6068-6078 (2007).
  28. Cameron, A. A., Smith, G. M., Randall, D. C., Brown, D. R., Rabchevsky, A. G. Genetic manipulation of intraspinal plasticity after spinal cord injury alters the severity of autonomic dysreflexia. The Journal of Neuroscience. 26 (11), 2923-2932 (2006).
  29. Liu, Y., Keefe, K., Tang, X., Lin, S., Smith, G. M. Use of self-complementary adeno-associated virus serotype 2 as a tracer for labeling axons: Implications for axon regeneration. PLoS One. 9 (2), e87447(2014).
  30. Chamberlin, N. L., Du, B., de Lacalle, S., Saper, C. B. Recombinant adeno-associated virus vector: Use for transgene expression and anterograde tract tracing in the CNS. Brain Research. 793 (1-2), 169-175 (1998).
  31. Filli, L., et al. Bridging the gap: A reticulo-propriospinal detour bypassing an incomplete spinal cord injury. The Journal of Neuroscience. 34 (40), 13399-13410 (2014).
  32. Williams, R. R., Pearse, D. D., Tresco, P. A., Bunge, M. B. The assessment of adeno-associated vectors as potential intrinsic treatments for brainstem axon regeneration. The Journal of Gene Medicine. 14 (1), 20-34 (2012).
  33. Smith, G. M., Onifer, S. M. Construction of pathways to promote axon growth within the adult central nervous system. Brain Research Bulletin. 84 (4-5), 300-305 (2011).
  34. Morcuende, S., Delgado-Garcia, J. M., Ugolini, G. Neuronal premotor networks involved in eyelid responses: Retrograde transneuronal tracing with rabies virus from the orbicularis oculi muscle in the rat. The Journal of Neuroscience. 22 (20), 8808-8818 (2002).
  35. Ugolini, G. Specificity of rabies virus as a transneuronal tracer of motor networks: Transfer from hypoglossal motoneurons to connected second-order and higher order central nervous system cell groups. The Journal of Comparative Neurology. 356 (3), 457-480 (1995).
  36. Gelderd, J. B., Chopin, S. F. The vertebral level of origin of spinal nerves in the rat. The Anatomical Record. 188 (1), 45-47 (1977).
  37. Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. 73, e50313(2013).
  38. Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus. Journal of Visualized Experiments. 53, e2834(2011).
  39. Snyder, B. R., et al. Comparison of adeno-associated viral vector serotypes for spinal cord and motor neuron gene delivery. Human Gene Therapy. 22 (9), 1129-1135 (2011).
  40. Cronin, J., Zhang, X. Y., Reiser, J. Altering the tropism of lentiviral vectors through pseudotyping. Current Gene Therapy. 5 (4), 387-398 (2005).
  41. Reed, W. R., Shum-Siu, A., Onifer, S. M., Magnuson, D. S. Inter-enlargement pathways in the ventrolateral funiculus of the adult rat spinal cord. Neuroscience. 142 (4), 1195-1207 (2006).
  42. Mao, X., Schwend, T., Conrad, G. W. Expression and localization of neural cell adhesion molecule and polysialic acid during chick corneal development. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (3), 1234-1243 (2012).
  43. Charles, P., et al. Negative regulation of central nervous system myelination by polysialylated-neural cell adhesion molecule. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (13), 7585-7590 (2000).
  44. Tervo, D. G., et al. A designer AAV variant permits efficient retrograde access to projection neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
  45. Tohyama, T., et al. Contribution of propriospinal neurons to recovery of hand dexterity after corticospinal tract lesions in monkeys. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (3), 604-609 (2017).
  46. Liu, Y., et al. A sensitized IGF1 treatment restores corticospinal axon-dependent functions. Neuron. 95 (4), 817-833 (2017).
  47. Kinoshita, M., et al. Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates. Nature. 487 (7406), 235-238 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Инъекция в спинной мозгретроградный транспортпроприоспинальные интернейроныэкспрессия GFPядра ствола мозгатаргетирование позвонковинъекция с помощью микронасосапрокол твердой мозговой оболочкикартирование нейронных цепей
Прямой впрыск лентивирусные вектора выделяет несколько мотор путей спинного мозга крысы
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.